异黄酮衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途的制作方法

专利名称：异黄酮衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途的制作方法
专利说明异黄酮衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途 发明领域 本发明涉及新型水溶性抗氧化剂，更具体涉及异黄酮衍生物，尤其是大豆甙元衍生物和染料木素衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途。

背景技术：
随着科学研究的不断发展，人们逐渐认识到自由基与疾病(如炎症、动脉粥样硬化、心肌梗塞、休克、中毒、肿瘤、突变、衰老等)密切相关，因而自由基的研究日益受到人们的重视。在生物体正常的代谢过程中，氧化还原反应是最常见的反应，氧是生物体内的受电子体，在反应过程中，由于其获得的电子数的不同，可以产生不同的自由基，根据氧化性及其程度的不同，一般将自由基分为氧自由基和脂质自由基两类。其中氧自由基是与人体关系最为密切的自由基，它是活性氧衍生物，主要包括超氧阴离子自由基(O2-·)羟基自由基(·OH)，其中以O2-·形成最早，·OH作用最强，本发明中涉及的自由基为这两种自由基。超氧阴离子自由基O2-·是生物体内一类重要的活性氧自由基，它对生物分子(如脂质、蛋白质、核酸、色素等)的损伤是广泛和多层次的，大量的研究表明，O2-·可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类发生氧化，与机体的许多功能障碍和疾病的发生(如吞噬、解毒、炎症、衰老、肿瘤、辐射损伤等)有着密切的关系。此外它还可以经过一系列反应生成其它自由基，从而引发一系列疾病。但在动物生命的氧化代谢中总会不断产生超氧阴离子自由基(O2-·)，细胞中的一些膜性结构如线粒体、内质网、过氧化物体、细胞膜等都包含氧化酶系、电子传递酶系或过氧化氢酶系。这些酶系在催化其相应的底物过程中以不同形式释放出自由基，此外空气中紫外线、X射线照射、高温以及空气中烟尘污染也能促使人体中产生O2-·自由基。O2-·自由基还能诱发诸如冠心病、动脉硬化、肿瘤等多种疾病。·OH带有一个不成对电子，性质极活泼，其反应性和毒性都很强，对生物体的损害也最大，它是造成组织细胞损伤的重要活性氧之一，氧化能力很强，可以发生电子转移，参与夺氢反应和羟基化等反应，它可以引起膜过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤等，氧化糖类、氨基酸和脂类而使它们遭受损伤和破坏，另外羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关，是公认的毒性最大的自由基之一。这些氧自由基可以攻击生物大分子，使其交链或断裂，导致细胞结构和功能的破坏。因此，它们是人类衰老和许多疾病如癌症、多发性硬化症、帕金森疾病、自身免疫疾病、局部缺血、贫血症、老年痴呆病和慢性肺炎等的重要诱因。所以，寻找能够有效清除自由基而无毒副作用的物质一直是学者们研究的课题之一。
目前已有的可以用作抗氧化剂的药物主要是一些天然产物如丹参、当归的提取物，但是由于其提取十分麻烦，而且由于其分子结构的限制，水溶性和脂溶性都很差，导致在临床应用中存在一些弊端，如生物利用度不高，服用量大，制成的片剂或胶囊在体内吸收缓慢，7～14天才能见到有限的效果，因此寻找水溶性好、抗氧化能力强和生物利用度高的抗氧化剂具有重大的现实意义。
发明概述 本发明的一般目的是提供新型水溶性抗氧化剂，其抗氧化能力强且生物利用度高。
本发明的更具体的目的是提供水溶性良好的异黄酮衍生物，其抗氧化能力强且生物利用度高，因此适合用作抗氧化剂。
本发明的另一目的是提供一种制备上述异黄酮衍生物的方法。
本发明的又一目的是提供上述异黄酮衍生物作为抗氧化剂的用途。
本发明的这些和其他目的、特征和优点在阅读完本说明书之后将变得更加明了。
发明详述 本发明的异黄酮衍生物由如下通式表示
其中X为氢或羟基，且M为碱金属或碱土金属离子，优选钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等。
更具体地说，当上述通式中的X为氢时，本发明的异黄酮衍生物为3’-磺酸基-大豆甙元金属盐且对应于下式
其中M如上所定义。
当上述通式中的X为羟基时，本发明的异黄酮衍生物为3’-磺酸基-染料木素金属盐且对应于下式
其中M如上所定义。
本发明的新型抗氧化剂的制备方法包括将通式(I’)磺化并使用碱金属或碱土金属化合物成盐，由此引入磺酸盐基，得到水溶性较好的抗氧化剂
其中X为氢或羟基。
更具体地说，当上述通式(I’)中的X为氢时，反应如下
其中M如上所定义。
当上述通式中的X为羟基时，反应如下
其中M如上所定义。
具体而言，3’-磺酸基-大豆甙元金属盐(L3)和3’-磺酸基-染料木素金属盐(L4)的制备可以按如下方式进行分别使大豆甙元(L1)或染料木素(L2)与浓硫酸反应并加入碱金属或碱土金属化合物使磺基成盐，由此得到L3或L4。在所述磺化反应中，浓硫酸的用量范围基于每克L1或L2为2-10ml。在所述成盐步骤中碱金属或碱土金属化合物的实例为碱金属或碱土金属的卤化物，尤其是氯化物，碳酸盐，硝酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐等等，其加入量应使整个体系析出沉淀。
本发明的化合物的结构特点是在大豆甙元(L1)和染料木素(L2)的基础上引入磺酸基，提供了两种水溶性的可以有效清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的结构L3和L4。本发明对上述化合物进行了一系列有关与清除超氧阴离子自由基(O2-·)和羟基自由基(·OH)的实验，实验结果表明它们具有较强的抗氧化作用。另外，它们的水溶性好，克服了以前的抗氧化剂水溶性差的缺点。与现有的抗氧化剂黄芩甙相比较，具有显著提高清除这些氧自由基的特点。L3和L4在清除羟基自由基方面，其活性依照相应的EC50计算，对比黄芩甙，分别提高了40倍和68倍。在清除超氧阴离子自由基方面，分别提高了20倍和133倍。
下面通过实施例来对本发明作进一步说明，应当指出的是这些实施例仅用于对本发明进行举例说明，不应该理解为对本发明的限制。
实施例1 抗氧化剂L3的合成 取2.52g(0.01mol)L1(供应商为陕西赛德高科生物股份有限公司)投入到10mL浓硫酸中，室温搅拌30分钟，固体逐渐溶解，溶液变成深黄色。取少量反应液滴于水中，无不溶物出现，说明反应已完全。将此反应物缓慢小心倾倒入40mL冰水中，搅拌。然后在滤液中加入固体NaCl，剧烈搅拌，直到加入的NaCl不再溶解。静置，生成白色絮状沉淀，过滤，饱和食盐水洗涤。用5％NaCl水溶液重结晶，得白色针状晶体大豆甙元-3’-磺酸钠盐2.6g，产率75％。m.p.349℃，IR(KBr，ν，cm-1)3441.4(-OH)，1635(-CO-)，1193(-SO3)；1H NMR(D2O，500MHz，δ，ppm)6.59(s，1H，HC-6)，6.64(s，1H，HC-8)，6.69或6.81(d，1H，HC-5’或6’)，7.15(d，1H，HC-5)，7.62(s，HC-2)，7.83(s，1H，HC-2’)；C15 H9O7SNa的元素分析(％)，计算值C，50.56；H，2.53；实测值C，50.58；H，2.54。
实施例2 抗氧化剂L4的合成 取2.69g(10mmol)L2(供应商为陕西赛德高科生物股份有限公司)投入到10mL浓硫酸中，室温搅拌30分钟，固体逐渐溶解，溶液变成深黄色。取少量反应液滴于水中，无不溶物出现，说明反应已完全。将此反应物缓慢小心倾倒入40mL冰水中，搅拌。然后在滤液中加入固体NaCl，剧烈搅拌，直到加入的NaCl不再溶解。静置，生成白色絮状沉淀，过滤，饱和食盐水洗涤。用5％NaCl水溶液重结晶，得白色针状晶体(L4)2.8g(产率78％)。m.p.＞260℃(分解)，IR(KBr，ν，cm-1)3441.4(-OH)，1642.5(-CO-)；1H NMR(D2O，500MHz，δ，ppm)5.89或5.91(s，1H，HC-6或HC-8)，6.90或7.02(d，1H，HC-5’或HC-6’)，7.59(s，1H，HC-2)，7.69(s，1H，HC-2’)；C15H9O8SNa的元素分析(％)，计算值C，48.39；H，2.42；实测值C，48.37；H，2.39。
实施例3 L3和L4对羟基自由基的清除 一、荧光光谱法 通用程序 在5ml比色管中，加入0.1ml 20mM的H2O2溶液、0.1ml 2mM的对苯二甲酸(TA)溶液以及一定体积的0.3mM的样品溶液，定容至5ml，迅速放置于紫外灯下，以254nm紫外光照射20分钟，准确计时，迅速测定溶液的荧光强度。
荧光条件激发波长(Ex)312nm，发射波长(Em)427nm，高灵敏度；狭缝EX＝5nm，EM＝5nm。
原理 H2O2在紫外光照射下会发生分解反应，生成羟基自由基(·OH)，它容易进攻芳环化合物一对苯二甲酸(TA)，生成具有荧光的羟基-对苯二甲酸(反应1)，而在实验条件下，TA的荧光很弱，基本可以忽略。因此，通过监测产物的荧光强度就可以确定体系中·OH的相对含量。当体系中有样品存在时，H2O2产生的部分·OH与样品反应，生成无荧光物质(反应2)。
这样，·OH与对苯二甲酸反应产物减少，通过测定加入样品后溶液荧光强度的变化，便能间接反映出样品对·OH自由基的清除能力。样品对·OH的清除率(％)可以按如下方程计算
其中F0、F分别代表体系中未加入样品和加入样品时反应液的荧光强度。
结果 通过使用不同浓度的各个样品进行对羟基自由基的清除试验，结果如表1所示 表1 L3和L4的浓度与羟基自由基的清除率关系 通过将F0/F对[样品]/[TA]作图，可得到样品L3和L4的直线斜率，并由此求得它们与羟基自由基反应的速率常数分别为1.3×1012L·mol-1·s-1(L3)和1.8×1012L·mol-1s-1(L4)，半数有效清除浓度EC50分别为0.0031mmol.L-1(L3)和0.0019mmol.L-1(L4)。
在相同实验条件下对天然产物baicalin(黄芩甙，购自陕西赛德高科生物股份有限公司)进行测试，结果求得baicalin与羟基自由基反应的速率常数为2.3×109L·mol-1·s-1，半数有效清除浓度EC50为0.13mmol.L-1。
由此可见，本发明化合物L3和L4对羟基自由基的清除效果都明显好于天然产物baicalin。
二、单扫示波极谱法 原理和通用程序 用自旋捕集剂PBN捕捉Fenton反应产生的羟基自由基·OH，生成的PBN自旋加合物可利用单扫示波极谱法检测。在pH7.4的PBS缓冲底液中，加合物给出一个灵敏的二阶导数还原波，峰电位在-0.52V(vs.SCE)。测定反应时间为4分钟时的峰高。反应混合溶液的终体积为10mL，各反应物的终浓度分别为Fe2+(1×10-4mol/L)，EDTA(1×10-4mol/L)，Vc(抗坏血酸)(2.0×10-4mol/L)，PBN(1.65×10-4mol/L)，H2O2(0.03％)。对羟基自由基产生的抑制率可根据下面公式计算
在上式中A空白为没有加样品时二阶导数极谱波的峰高，A样品为加了样品时二阶导数极谱波的峰高。
为了便于比较，同时给出单扫示波极谱法测得具有抗氧化作用的天然产物红景天甙对羟基自由基的清除率。
结果 通过使用不同浓度的各个样品进行对羟基自由基的清除试验，结果如表2所示 表2 L3、L4和红景天甙的浓度与羟基自由基的清除率关系 L3、L4和红景天甙的半数有效清除浓度分别为0.09g.L-1、0.06g.L-1和0.10g.L-1。由此可见L3和L4对羟基自由基的清除效果都明显好于天然产物红景天甙。
另外，由表1和表2还可以看出L4对羟基自由基的清除效果好于L3。
实施例4 L3和L4对超氧阴离子自由基的清除 一、紫外分光光度法 通用程序 测试波长为319nm，反应总体积为10mL。取pH＝8.2，0.05M Tris-HCl缓冲液4.5mL，与适量蒸馏水混匀后置于25℃水浴中保温10分钟，再依次加入1、2、3、4mL的样品(L3，L4)溶液，最后加入3mM邻苯三酚溶液0.3mL，然后用蒸馏水定容至10mL，混匀后在25℃继续保温4分钟，严格控制时间，立即在319nm处测定吸光度A值。由于L3，L4本身在319nm处都有吸收，因而测定混合体系的吸光度时分别以对应浓度的供试样品溶液为参照溶液，空白组以去离子水代替供试品溶液，并按下式计算清除率(E％)
结果 通过使用不同浓度的各个样品进行对超氧阴离子自由基的清除试验，结果如下表3所示 表3 L3和L4的浓度与超氧阴离子自由基的清除率关系 表4 baicalin的浓度与超氧阴离子自由基的清除率关系 由此可见，2个实验样品对O2-·有不同程度的清除作用，并呈明显的量效关系，L3、L4和baicalin对超氧阴离子自由基的半数有效清除浓度分别为0.0071mmol.L-1，0.0011mmol.L-1和0.148mmol.L-1。
由此可见，L3、L4对超氧阴离子自由基的清除效果都明显好于天然产物baicalin。
二、单扫示波极谱法 原理和通用程序 超氧阴离子自由基(O2-·)可通过邻苯三酚在pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中自氧化产生。分别加入适量的样品溶液，以单扫示波极谱法检测-0.96V处的二阶导数还原波随时间的变化情况。扫描电位-0.3～1.2V。反应混合液总体积为10mL，邻苯三酚的终浓度为1×10-4mol/L。按下式计算清除率(E％)
其中A空白为没有加样品时二阶导数极谱波的峰高，A样品为加了样品时二阶导数极谱波的峰高。
为了便于比较，同时给出单扫示波极谱法测得具有抗氧化作用的天然产物红景天甙对超氧阴离子自由基的清除率。
结果 通过使用不同浓度的各个样品进行对超氧阴离子自由基的清除试验，结果如下表所示 表5 L3、L4和红景天甙的浓度与超氧阴离子自由基的清除率关系 L3、L4和红景天甙的半数有效清除浓度分别为0.10g.L-1、0.08g.L-1和0.15g.L-1。由此可见，L3和L4对超氧阴离子自由基的清除效果都明显好于天然产物红景天甙。另外，由表5还可以看出L4对超氧阴离子自由基的清除效果好于L3。
权利要求
1.如下通式的异黄酮衍生物
其中X为氢或羟基，且M为碱金属或碱土金属离子。
2.根据权利要求1的异黄酮衍生物，其中X为氢。
3.根据权利要求1的异黄酮衍生物，其中X为羟基。
4.根据权利要求1-3中任一项的异黄酮衍生物，其中M为钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等。
5.一种制备根据权利要求1-4中任一项的异黄酮衍生物的方法，包括使用浓硫酸将通式(I’)的化合物磺化
其中X为氢或羟基，
然后使用碱金属或碱土金属化合物使磺基成盐。
6.根据权利要求5的方法，其中浓硫酸的用量范围基于每克通式(I’)化合物为2-10ml。
7.根据权利要求5的方法，其中在所述成盐步骤中碱金属或碱土金属化合物的实例为碱金属或碱土金属的卤化物，尤其是氯化物，碳酸盐，硝酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐等等，其加入量应使整个体系析出沉淀。
8.根据权利要求1-4中任一项的异黄酮衍生物作为抗氧化剂的用途。
全文摘要
本发明涉及新型水溶性抗氧化剂，更具体涉及异黄酮衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途。本发明的新型水溶性抗氧化剂通过大豆甙元或染料木素的磺化和成盐而制备。本发明的新型水溶性抗氧化剂可以较好地清除羟基自由基和超氧阴离子自由基。
文档编号A61P39/06GK1982305SQ200510130118
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者延玺, 刘芸, 马雨伟, 司书峰 申请人:北京师范大学