一种大鼠可诱导多能干细胞及其制备方法

专利名称：：一种大鼠可诱导多能干细胞及其制备方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大鼠成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcell,简称iPS细胞)及其制备方法。
背景技术：
：大鼠是重要的实验动物，在行为学、癌症、心血管、血液、自体免疫等疾病、以及生理药理等方面都有广泛用途，针对大鼠的研究对于指导生物医学、人类健康和病理学等方面意义重大。胚胎干细胞是来自胚泡，可无限繁殖同时能维持多能性，即可分化为三个胚层的一类祖细胞。基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、发育生物学、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推动作用。从25年前小鼠胚胎干细胞获得到现在，人们利用反向遗传学手段不断建立和完善各种小鼠模型(Demers，S.P.，etal.(2007)，Cloningandstemcells,9,512-522)。但数十年来科学界始终没能成功建立大鼠胚胎干细胞(ES)系，首次报道在1994年，P.Lannaccone实验室宣布获得了大鼠ES细胞并打出了嵌合体，但三年后，他们却推翻了当年的成果，原因是污染了小鼠胚胎干细胞(lannaccone,P.M.，Taborn，G.U.，Garton，R丄，etal.(1994).Dev.Biol.163,288-292;Brenin，D.，etal.(1997).Transplant.Proc.29，1761-1765);本世纪初，又有几个实验室相继报道建立了类似大鼠胚胎干细胞(ES-like)的细胞系(Demers，etal.(2007)，Cloningandstemcells9，512-522;Vassilieva，S.，etal.(2000)，Exp.CellRes.258,361-373;Notarianni，E.，etal.(2001)，Placenta22，111—123;Fandrich，F.，etal.(2002)，Nat.Med.8，171—178;Buehr，M.，etal.(2003)，Biol.R印rod.68，222-229;Mullins，L.J.，etal.(2004)，J.Physiol.554,4-12;Tesson，L.，etal.(2005)，TransgenicRes.14，531-546)，但缺陷是ES-like细胞得不到长期维持；体内验证ES-like细胞多能性的实验结果不理想，即打不出畸胎瘤；没有成功的嵌合体大鼠得的报道，注射到囊胚的ES-like细胞只能分化成胚外组织，也就无法对生殖系嵌入情况进行探索；此外，对干细胞特征性指标的鉴定也很有限。大鼠胚胎干细胞的建系成为阻碍大鼠在生物医学方面用途广泛的巨大限制因素，而就前人的这些研究结果来看，使用传统方法(小鼠ES细胞的建立方法)建立大鼠ES细胞是相当困难的。2006年8月，Yamanaka实验室利用外源表达0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4四个转录因子，成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的"可诱导的多能干细胞"(inducedpluripotentstemcells,iPS)，这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转录因子诱导，重编程到全能性的状态(Takahashi，K.，andYamanaka，S.(2006).InductionofPluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126,663-676);2007年，人类iPS的建立，进一步验证了该方法的可行性(Takahashi，K.，etal.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Celll31，861_872;Yu，J.，etal.(2007).3Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318,1917-1920)。尽管iPS细胞并非百分之百的ES细胞，但有理由相信，iPS细胞可运用到那些使用传统方法无法建立ES细胞的物种上，比如大鼠。
发明内容本发明的首要目的在于，提供一种大鼠可诱导多能干细胞。本发明的第二个目的在于，提供一种大鼠可诱导多能干细胞的制备方法。根据本发明的大鼠可诱导多能干细胞iPS的制备方法，包括步骤A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog;B)将步骤A)所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠iPS细胞。根据本发明所述的方法，所述大鼠成体细胞包括大鼠原代骨髓细胞或原代耳尖成纤维细胞。根据本发明所述的方法，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4。根据本发明所述的方法，所述步骤B)的传代培养是将大鼠iPS克隆按l:350的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。根据本发明所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。根据本发明所述的方法，还包括步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定。根据本发明所述的方法，所述步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定包括D)碱性磷酸酶表达呈阳性；E)干细胞表面特异标记SSEA-1(+)、Nanog(+);F)自然分化形成胚状体后，外胚层NCAM(+)、PAX6(+)，中胚层SM22-a(+)、Myod(+)和内胚层Soxl7(+)、AFP(+);G)大鼠iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根据本发明所述的方法，所述步骤G)形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。根据本发明所述的方法，所述大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定还包括H)0ct4基因的启动子区域被去甲基化；I)端粒酶活性比大鼠成体细胞高。本发明有助于确立大鼠ES细胞建系的最适培养条件和方法；大鼠iPS细胞是大鼠基因打靶的良好载体，本发明的大鼠iPS细胞将利于揭示大鼠各基因功能和复杂的发育事件；此外，大鼠iPS是继小鼠和人的iPS成功诱导后第一项其它物种的iPS，这对于其它模式动物iPS的诱导有着重大指导意义。图1是病毒载体LV-efla-IRES-EGFP结构图。4图2是大鼠iPS细胞形态荧光镜检结果，其中A:PEF的ES-like克隆形态B:PEF的ES-like克隆的绿色荧光镜检结果C:BMC的ES-like克隆形态D:BMC的ES-like克隆的绿色荧光镜检结果E:非ES-like克隆形态F:非ES-like克隆的绿色荧光镜检结果。图3是大鼠iPS细胞碱性磷酸酶检测阳性克隆统计结果。图4是大鼠iPS细胞经多次挑克隆和传代后的细胞形态，其中A:克隆形态B:克隆绿色荧光镜检结果。图5是大鼠iPS细胞碱性磷酸酶活性检测，其中A:由PEF得到的大鼠iPS细胞AP染色结果，B:由BMC得到的大鼠iPS细胞AP染色结果。图6是RealtimePCR检测大鼠iPS细胞未分化Marker表达情况的电泳图，从左到右泳道依次是大鼠骨髓细胞，大鼠耳尖成纤维细胞，M13号iPS细胞，F65号iPS细胞，大鼠胚胎细胞，阴性对照。图7是免疫荧光染色检测大鼠iPS细胞干细胞相关marker表达情况，其中A:由BMC得到的大鼠iPS细胞SSEA-l染色结果，B:由PEF得到的大鼠iPS细胞SSEA-l染色结果，C:由BMC得到的大鼠iPS细胞Nanog染色结果，D:由BMC得到的大鼠iPS细胞Nanog染色结果，其中标尺代表100m。图8是RealtimePCR检测大鼠iPS细胞内外源基因表达水平，从上到下依次是0ct4，Nanog，Sox2。图9是大鼠iPS细胞重亚硫酸盐基因组测序分析结果，从上到下依次是大鼠耳尖成纤维细胞，大鼠骨髓细胞，M13号iPS细胞，F65号iPS细胞。图IO是大鼠iPS细胞端粒酶活性检测，从左到右泳道依次是大鼠骨髓细胞，大鼠耳尖成纤维细胞，M13号iPS细胞，F65号iPS细胞，阳性对照细胞，热失活阳性对照细胞，裂解液；其中_表示未进行热失活，+表示热失活。图11是RealtimePCR检测大鼠iPS细胞在体外向三个胚层的分化能力，从左到右泳道依次是大鼠骨髓细胞，大鼠耳尖成纤维细胞，M13号iPS细胞，F65号iPS细胞，M13号iPS细胞分化后的细胞，F65号iPS细胞分化后的细胞，大鼠胚胎细胞，阴性对照。图12是大鼠iPS细胞畸胎瘤形成情况，其中A:神经上皮(外胚层)B:软骨(中胚层)C:肠样上皮(内胚层)。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。以下实施例中，用到的培养基有大鼠原代骨髓细胞的培养基，具体组成为90%的a-MEM培养液(购自Invitrogen，12571);10%的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03)。大鼠原代耳尖成纤维细胞在原代培养时的培养基，具体组成为69X的D-MEM培养液(购自Invitrogen，11965);30%的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03);lmML-谷氨酸(购自Invitrogen,25030);1%的非必须氨基酸(购自Invitrogen,11140050)。大鼠原代耳尖成纤维细胞传代后的培养基，具体组成为89X的D-MEM培养液(购自Invitrogen,11965);10%的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03);lmML-谷氨酸(购5自Invitrogen,25030);1%的非必须氨基酸(购自Invitrogen,11140050)。大鼠iPS细胞的培养基，具体组成为79%的KnockoutD-MEM/F12培养液(购自Invitrogen,12660);10%的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03);10%的KnockoutSR(购自Invitrogen,10828);lmML-谷氨酸(购自Invitrogen,25030);1%的非必须氨基酸(购自Invitrogen,11140050);0.ImMP-巯基乙醇(购自Sigma，M7522)。以下实施例中所使用的慢病毒载体LV-efla-IRES-EGFP购自Invitrogen公司，其结构如图1所示，具有氨苄抗性。以下实施例中，通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司。实施例1、悔病毒载体的构建1.1、从NCBI网站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询干细胞中特异表达或高表达的特定基因(0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4，Lin28，Nanog)的编码区，根据编码区序列设计引物，并引入酶切位点，引物序列如表l所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。1.2、PCR扩增以人类总cDNA为模板，利用表1中各基因引物进行PCR扩增，具体如下反应体系(25:10XpfxMix2.5ii1，AccuPrimepfx酶0.2ii1，上下游引物(50iiM)各0.25iil，模板O.25ii1，ddH2021.55ii1。反应条件95。C2min;95°C20sec，66。C20sec，68。C30sec，循环35次；68°C10min。1.3、慢病毒载体的构建将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)回收各基因片段，分别利用各自酶切位点双酶切，用相应的酶双酶切慢病毒载体LV-efla-IRES-EGFP，得到慢病毒载体的骨架片段，将慢病毒载体的骨架片段和各基因片段用T4DNA连接酶(Fermentas公司)于22。C连接3h。将连接产物转化GBE180感受态细菌(制备方法见htto:〃www.chem.uga.edu/scottgrp/GrpProtocols/Competentcellpreparation.htm)，在琼月旨平板上(含氨苄抗生素)，于37t:培养12小时，从平板上挑取阳性单菌落，使用博大泰克B型质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，经测序鉴定为正确方可使用，将所得载体分别命名为LV-ef1a_0ct4_IRES_EGFP、LV-efla_Sox2_IRES_EGFP、LV-ef1a_c_Myc_IRES_EGFP、LV-efla-Klf4-IRES-EGFP、LV-ef1a-Lin28-IRES_EGFP、LV-ef1a-Nanog-IRES-EGFP。实施例2、细胞培养2.1、大鼠原代骨髓细胞(BMC)的培养取6周SD雄性大鼠的大腿股骨和胫骨，浸泡于75X酒精中10min，使用含双抗(青霉素、链霉素)的PBS冲洗三次，剪开骨两端，用含10X胎牛血清(FBS)的a-MEM培养基的无菌注射器冲骨髓至15mL无菌离心管中，1200rpm离心5min，使用上述培养基重悬细胞一次，再次1200rpm离心5min，培养基再次重悬后将细胞移入培养瓶中。三天后换液，可见微小克隆，约一周后按1比3传代，传代时使用PBS清洗细胞2次，37t:下0.25%胰酶消化5min，大鼠原代骨髓细胞(BMC)在前四代能保持较好状态。2.2、大鼠原代耳尖成纤维细胞(PEF)的培养取大鼠耳朵，75%酒精清洗后剃毛，浸泡于含双抗(青霉素、链霉素)的PBS中15min，再依次使用PBS，无血清培养基(D-MEM)清洗耳朵数次，然后将耳朵浸泡于少量含30%FBS的D-MEM中，同时使用无菌剪刀将其剪成小块，移至培养瓶中，小块之间保持较小的距离，培养瓶倒置。6-8小时后，补加含30%FBS的D-MEM，正置，此后每天补加少量该培养基，一般3、4天后可明显观察到成纤维细胞，约一周后传代，传代时使用PBS清洗细胞2次，37。C下0.25%胰酶消化5min，以10%FBS的D-MEM终止反应吹打。首次传代按1比1或2传(视细胞量而定)，此后每3至4天传代，按1比3或4传，大鼠原代耳尖成纤维细胞(PEF)传10代以上依然有较好的增殖能力。2.3、其它细胞的培养293T细胞(购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库)的培养传代时37。C下0.25%胰酶消化5min，使用10%FBS的D-MEM终止反应，吹打后按1比810传代。小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞根据文献(ThomsonJA.，Itskovitz-EldorJ.，ShapiroSS.，etal.Science.Nov61998;282(5391):1145-1147及Xu，C.，etal.NatBiotechnol.2001，19(10):971-4)的方法制备，作为滋养层细胞铺于平板备用。实施例3、病毒包装3.1、包装质粒的扩增将实施例1中得到的六种鉴定正确的载体转化感受态细菌以进行扩增，经AxygenAxyPwpplasmidMaxipr印Kit试剂盒(Axygen公司)中抽后，在超净工作台中进行纯化，即用中抽后质粒的十分之一体积的3MNaAC和2倍体积的无水乙醇混匀后，13000rpm离心15min，去上清，使用75%乙醇漂洗，吸去上清，于超净工作台中吹干后，使用无菌去离子蒸馏水溶解质粒，最后使用分光光度计及凝胶电泳确定质粒的浓度。3.2、转染按照Invitrogen公司转染试齐U盒(ViraPowerLentiviralExpressionSystems)的说明书，使用转染试剂Lipofectamine2000将步骤3.1中的六个慢病毒质粒分别与包装质粒ViraPowerPackagingMix(Invitrogen公司)共同转染293T细胞。具体步骤为转染实验前一天铺293T细胞，使第二天细胞可生长至90X满，对于一个T75瓶，取9iigViraPowerPackagingMix禾口3iig病毒质粒于1.5mLopti-MEM中，轻轻混匀，另取已摇匀的Lipofectamine2000转染试剂36y1于另一份1.5mLopti-MEM中，轻轻混匀后，室温放置5min，将上述两份分别含DNA和转染试剂的opti-MEM轻轻混匀，室温放置20min后将上述混合液至于293T细胞90%满的T75培养瓶中。按相同的方法转染其它五种慢病毒质粒。3.3、病毒滴度测定将步骤3.2中转染获得的六种病毒分别在24h内更换培养基，此后收集转染48h，72h和96h的病毒上清，一般无需进行病毒浓縮，而直接取5ill和1ill上述六种病毒，分别于24孔板中悬浮感染15万293T细胞，同时加入polybrene，由感染48h后六种病毒感染的293T细胞的GFP情况来确定病毒滴度，可由视野中GFP阳性细胞所占比例估算15万细胞中GFP阳性总细胞数，继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数，即为相应病毒的滴度。实施例4、病毒感染将实施例3包装的慢病毒，以MOI50感染5乂104个大鼠原代耳尖成纤维细胞(PEF)和大鼠原代骨髓细胞(BMC)两种细胞，所用病毒的滴度约为58X106IU/mL，实验分为3组a)空白对照组仅携带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒；b)实验组1:包含4种因子的第一种慢病毒组合，0ct4，Sox2，Nanog和Lin28;c)实验组2:包含4种因子的第二种慢病毒组合，0ct4，Sox2，c_Myc和Klf4。每组实验均有6个平行样，其中3个用于碱性磷酸酶(AP)染色，统计阳性克隆数，另3个样用于克隆挑选。感染48小时后，将上述细胞用0.25%胰酶，371:下消化5min，计数后传代转移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的6孔板中，传代后24h内改用人胚胎干细胞(ES)培养基，隔天换液，待出现克隆后每天换液。实施例5、转染后阳性细胞的筛选5.1、感染细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶(AP)染色用荧光显微镜观察实施例4感染后的细胞，发现感染后48小时有绿色荧光表达。传代后24小时空白对照组中没有克隆形成，实验组1也没有克隆形成，实验组2传代后2-3天细胞形态发生改变，呈圆形和明显的细胞聚集，克隆出现在传代后4-6天，实验组2显微镜观察的结果如图2所示，其形态主要有两种，一类是小鼠胚胎干细胞类(mES-like)克隆，其细胞致密，克隆表面光滑，边缘平滑，边界清晰光亮(见转染PEF所得图2A、2B，转染BMC细胞所得图2C、2D);另一类克隆中部明显突起，细胞相对松散，边缘不够平滑，边界相对模糊(图2E、2F)，为非ES-like克隆。感染第12天对3组实验下6个平行样中的三个进行碱性磷酸酶(AP)染色，统计阳性克隆数，结果如图3所示，由图3可知，空白对照组和实验组1没有克隆形成，实验组2(慢病毒组合0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4)克隆基本都显示较弱的AP阳性，5X104个大鼠BMC和PEF传代后分别形成10±8个和21±8个AP阳性的iPS细胞集落。由以上结果可知，转入特定的因子可以使已经分化的大鼠成体细胞重编程形成类似胚胎干细胞(ES-like)的克隆(iPS细胞集落)，感染PEF比感染BMC产生的克隆多1倍左右。5.2、阳性细胞的筛选在感染后12天随机挑选克隆，使用0.25X胰酶37t:下消化5min，吹打为单细胞后，用含10%SR(血清替代物)+10%FBS的D-MEM的KnockD-MEM/F12培养液终止反应，此后每天更换该培养基，此时细胞增殖很快，每三天可传一代，每三天按l:350传代(视克隆总数而定)至辐照过的滋养层细胞MEF上，此后不断进行克隆挑选和AP检测。大鼠iPS细胞经5、6次传代后，经AP检测发现阳性率明显提升。大鼠iPS细胞经多次挑克隆和传代后的细胞形态镜检结果如图4所示，由图4可以看出，经多次克隆挑选传代后，其克隆形态和挑克隆前第一类(图2A、2B)的接近。由以上结果可知，大鼠iPS细胞经多次挑克隆和传代，其形态逐渐类似于胚胎干细胞。实施例6、干细胞特件柃测l取传至15代的小鼠成纤维细胞形成的克隆F65和转染骨髓细胞形成的克隆M13进行以下大鼠iPS细胞检测，以证明其具备干细胞特性。6.1、碱性磷酸酶表达使用ChemiconAlkalinePhosphataseDetectionKit(Millipore公司)进行染色，具体步骤如下使用PBS清洗细胞两次，4XPFA(多聚甲醛)室温固定1-2min，TBST清洗一遍，AP染料(按试剂盒中注明的配制)避光染色15min，TBST再清洗一遍后使细胞浸泡于PBS中。显微镜检测，结果如图5所示。由图5可以看出，细胞被染成紫红色，而紫红色表示细胞具有碱性磷酸酶活性，从而说明反复挑克隆后的大鼠iPS细胞具有很强的碱性磷酸酶活性，进一步地说形成的大鼠iPS克隆具有胚胎干细胞特性，即表达碱性磷酸酶。6.2、大鼠iPS细胞的未分化状态检测用realtimePCR方法检测大鼠iPS细胞与诱导前细胞大鼠BMC及PEF进行对比，分析其未分化基因表达水平。6.2.1、引物设计由于未分化的细胞会特异性表达以下基因，包括0ct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra，所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的大鼠iPS细胞的未分化状态。未分化marker引物序列设计如表2所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.2.2、PCR扩增使用ToyoboSybergreenPCRMix,反应体系(15iU):模板0.3ii1，弓|物(5iiM)lii1，SybergreenMix7.5iil，ddH206.2ii1，其中模板为抽提iPS细胞的RNA反转得到的cDNA。反应条件94。C，5min;94。C15sec，66。C10sec，72。C15sec，循环40次；72。C，10min。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中阳性对照的模板取自大鼠胚胎细胞RNA反转得到的cDNA，阴性对照的模板为未进行反转的RNA。由图6的结果可知，大鼠iPS细胞(F65、M13)与诱导前的大鼠BMC及PEF相比，其干细胞相关的marker,即0ct4，Sox2，Nanog，Nodal，Fgf4，Gal，Leftyb，Lin28，Gabrb均有高水平的表达。6.2.3、通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关marker是否表达(包括SSEA-1和Nanog)使用PBS清洗细胞两次，4XPFA室温固定30min，PBS洗三次，再用含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS洗两次，接着使用含1%BSA+4%normalserum+0.1%Triton-lOO的PBS封闭细胞lh，再将一抗(SSEA-1和Nanog)稀释在含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS中，然后加到样品上，室温2h或4。C过夜，然后用PBT(0.1%Triton-lOO的PBS)洗涤细胞3-5次，将二抗(anti-mouseIgM和anti-rabbitIgG)稀释在含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS中，然后加到样品上，室温lh，再用PBT洗三次，将Hochest母液以l:1000用PBS稀释，室温避光放置5min，然后PBS洗涤两次，每次5min，再用4XPFA室温固定30min，最后用PBS洗涤两次，每次5min。免疫荧光染色结果如图7所示。由图7可以看出，荧光镜检检测到大鼠iPS细胞表达干细胞相关markerSSEA-1和Nanog，说明大鼠iPS克隆持续传代后，仍能自我更新，维持未分化的状态，具有胚胎干细胞能自我更新的特性。6.3、大鼠iPS细胞内外源基因表达水平检测6.3.1、引物设计由于使用人源的基因诱导大鼠BMC及PEF重编程为大鼠iPS细胞，因此使用人源的引物检测外源基因的表达情况，使用大鼠基因检测大鼠iPS细胞内源基因的表达情况，引物序列如表3所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6.3.2、PCR扩增使用ToyoboSybergreenPCRMix反应体系(15ii1):模板0.3ii1，弓|物(5iiM)liil，SybergreenMix7.5iil，ddH206.2ii1，其中模板为抽提iPS细胞的RNA反转得到的cDNA。反应条件94。C，5min;94。C15sec，66。C10sec，72。C15sec，循环40次；72。C，10min。根据定量PCR原理，利用绝对定量，未知样品的量(拷贝数)可以通过从已知量的标准品的范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板(模板即质粒载体Lv-efla-0ct4-IRES-EGFP，Lv-efla-Sox2-IRES_EGFP，Lv-efla-Nanog-IRES-EGFP)。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验中进行反应，用稀释的样品标准样品构建标准曲线，通过计算来确定未知样品中目的基因的量。标准品基因PCR的ct值与起始量(拷贝数)的对数呈线性关系，据此可作一条ct值对log(拷贝数)的曲线，得到线性相关得方程式，样本基因的拷贝数可以通过对应的ct值利用方程式计算得出，将结果绘制成图8。由图8结果可知，大鼠iPS细胞M13及F65的外源0ct4基因表达水平较内源0ct4表达水平高一倍以上。F65外源Sox2基因已沉默，仅表达内源Sox2，M13克隆仍有部分外源Sox2基因表达，M13及F65均无外源Nanog表达。由以上结果可知，得到的大鼠iPS细胞，其内源的胚胎干细胞全能性相关marker0ct4，Nanog，Sox2均得到激活表达，但仍有部分外源0ct4表达，M13有外源Sox2表达。6.4、干细胞特异启动子去甲基化程度检测为检测得到的大鼠iPS细胞的0ct4基因的启动子区域是否被去甲基化，先使用Bisulphite处理DNA，具体步骤如下取每份样品DNA210ng，双蒸水稀释到21ill，每管加入新鲜配置的2M的NaOH4iU，5(TC反应15min，向该样品中加入50°C的502%的低熔点琼脂糖(该琼脂糖预先置于IO(TC5min)，混匀后取10于预冷的300液体石蜡中，冰上至少放置30min，使形成的beads坚硬。然后向beads中加入500新配的2.5M焦亚硫酸钠(Sodiummetabisulphite)摇匀，使beads位于分层上，离心甩一下，然后50。C避光反应4h-12h(不超过16-18h)。接着使用lmlTE(pH8.0)洗3次，每次lOmin，O.5ml0.2MNaOH洗2次，每次15min，再用lmlTE，每次10min，然后每管加100TE，4"C保存。在大鼠目的基因(0ct4)Promoter区富含CpG区域的上下游设计引物，将各富含CpG区的PCR产物连接至T载体上，转化后抽提质粒酶切鉴定送测序，其中的CG区即为甲基化位点，而TG区为未甲基化位点，绘制图谱(AnalysisofDNAmethylationusingbisulphatesequencing,contributedbyDr.AlexeiGratchev)，结果见图9。由图9的结果可见，诱导前的大鼠BMC及PEF细胞，其0ct4基因的启动子区域被高度甲基化，而诱导重编程得到的大鼠iPS细胞的0ct4基因的启动子区域被高度去甲基化，诱导后的细胞大鼠BMC及PEF细胞得到有效的重编程。6.5、端粒酶活性检测按照试剂盒TRAPEZERTelomeraseDetectionKit(Chemicon公司)中的操作步骤，经过提取端粒酶、端粒酶延伸反应和PCR扩增反应，上样于PAGE胶上染色照相。具体步骤为收集100万大鼠iPS细胞以及阳性对照细胞(肿瘤细胞或干细胞)，PBS洗一次，使用含150U/mLRNaseinhibitor的1XCHAPSLysisBuffer,冰上裂解30min，12000rpm，4。C离心20min，收集上清，使用LysisBuffer适当稀释后取少量85。C热处理，分别取热处理和非热处理的上述裂解液，按照试剂盒中所说进行端粒酶延伸反应和PCR扩增反应。然后上样于12.5%的非变性PAGE胶上，缓冲液为0.5XTBE，使用EB按1yg/mL染色30min，之后用去离子水洗脱10-20min，凝胶电泳成像的结果如图IO所示。由图IO可知大鼠iPS细胞如M13，F65与大鼠BMC及PEF细胞相比具有较高端粒酶活性，且热失活情况下细胞端粒酶失活，说明该活性为RNA特异性依赖的端粒酶活性。6.6、拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能(大鼠iPS细胞体外分化能力)为了验证大鼠iPS细胞的多能性，使之自然分化形成胚状体(EB)，使用相对定量PCR的方法，即在确保看家基因G即dh表达水平基本一致的情况下，比较各个样品，其三个胚层不同标记基因的表达水平间的差异。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示。由图11的结果可知，大鼠iPS细胞能够表达外胚层NCAM、PAX6，中胚层SM22-a、Myod和内胚层Soxl7、AFP的分化基因，证明大鼠iPS细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层。以上结果证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有体外分化成不同的组织细胞的潜能。6.6、畸胎瘤形成的检测为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力，用畸胎瘤石蜡切片，苏木精一伊红(HE)染色显示三个胚层组织细胞。6.6.1、畸胎瘤形成将F65号iPS细胞用0.25%胰酶消化为单细胞，将其铺于用于细胞培养的培养皿中，置于37t:培养箱静置45min，取上层未贴壁的细胞(feeder贴壁快，故可将feeder与iPS细胞分离)。计数，500万iPS细胞悬浮于300iU10%D-MEM中，对先天性免疫缺陷小鼠NOD-SCID小鼠进行后腿肌肉注射。第20天观察到有瘤形成，于第25-30天将其取出。6.6.2、石蜡切片及HE染色畸胎瘤石蜡切片制作步骤将畸胎瘤用4%PFA固定后，PBS洗三次，依次使用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水lh，继续使用100%乙醇脱水lh后，使用100%乙醇脱水过夜，接着用氯仿处理lh，处理三次，之后浸没于石蜡中2h，随后包埋，5iim切片。HE染色步骤将石蜡切片用二甲苯(Xylene)洗四次，每次5min(在脱色摇床上进行)，无水乙醇洗两次，每次10min，95X、90X、80X、70X乙醇依次洗5min，再用蒸馏水洗三次，每次5min，苏木精染色10min后流水冲洗15-30min至适合的颜色，接着再用蒸馏水洗5min，伊红A液染lmin，伊红B液染5min，再用蒸馏水洗，接着用70%乙醇涮洗，90%乙醇涮洗至适合颜色，再用无水乙醇洗两次，每次10min，最后用Xylene洗四次，每次5min后封片。将玻片显微镜镜检，结果如图12所示。由图12可以看到，大鼠iPS细胞能够在体内分化形成三个胚层细胞，包括，内胚层的肠样上皮细胞，中胚层的软骨组织以及外胚层的玫瑰状结样的神经上皮细胞。由以上结果进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有在体内分化成不同的组织细胞的潜能。综上所述，本发明大鼠成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞，使用大鼠原代骨髓细胞(BMC)和原代耳尖成纤维细胞(PEF)，已获得数株大鼠iPS细胞，并由碱性磷酸酶表达、干细胞表面特异标记(SSEA-1，Nanog)，干细胞特异启动子去甲基化程度、端粒酶活性、拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能以及畸胎瘤形成，确认其干细胞特性。本发明有助于确立大鼠ES细胞建系的最适培养条件和方法；大鼠iPS细胞是大鼠基因打靶的良好载体，大鼠iPS细胞将利于揭示大鼠各基因功能和复杂的发育事件；此外，本发明的大鼠iPS是继小鼠和人的iPS成功诱导后第一项其它物种的iPS，这对于其它模式动物iPS的诱导有着重大指导意义。权利要求一种大鼠可诱导多能干细胞iPS的制备方法，其特征在于，包括步骤A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)将步骤A)所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠iPS细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠成体细胞包括大鼠原代骨髓细胞或原代耳尖成纤维细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的传代培养是将大鼠iPS克隆按l:350的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定包括D)碱性磷酸酶表达呈阳性；E)干细胞表面特异标记SSEA-1(+)、Nanog(+);F)自然分化形成胚状体后，外胚层NCAM(+)、PAX6(+)，中胚层SM22-a(+)、Myod(+)和内胚层Soxl7(+)、AFP(+);G)大鼠iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤G)形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定还包括H)0ct4基因的启动子区域被去甲基化；I)端粒酶活性比大鼠成体细胞高。10.—种按权利要求19所述任一项制备的大鼠可诱导多能干细胞。全文摘要本发明涉及一种大鼠可诱导多能干细胞及其制备方法，本发明的大鼠可诱导多能干细胞的制备方法包括步骤A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)将步骤A)所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠iPS细胞。本发明有助于确立大鼠ES细胞建系的最适培养条件和方法；大鼠iPS细胞是大鼠基因打靶的良好载体，大鼠iPS细胞将利于揭示大鼠各基因功能和复杂的发育事件。文档编号G01N33/53GK101748100SQ20081020135公开日2010年6月23日申请日期2008年10月17日优先权日2008年10月17日发明者任江涛,崔春,廖婧,肖磊,陈思晔,陈霁君申请人:中国科学院上海生命科学研究院