与卵巢癌相关的方法和材料的制作方法

与卵巢癌相关的方法和材料的制作方法
【专利摘要】本文中描述了用于诊断卵巢癌的方法。特别地，某些microRNA对于卵巢癌患者对化学疗法的响应是有用的。
【专利说明】与卵巢癌相关的方法和材料
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2011年10月14日提交的美国临时申请61/547, 109和2012年7月 25日提交的美国临时申请61/675, 449的利益，所述美国临时申请的公开内容通过引用明 确地并入本文，用于所有目的。
[0003] 关于联邦政府资助的研究的声明
[0004] 本发明是在国立卫生研究院（NIH/EDRN)授予的基金号U01CA152758下由美国政 府支持进行的。美国政府具有本发明的某些权利。
[0005] 关于序列表的声明
[0006] 本申请通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交，如MPEP § 1730II. B. 2(a) (A)中所授 权和规定的，并且该电子提交包括电子提交的序列（SEQ ID)表。该序列表的完整内容通过 引并入本文用于所有目的。序列表在电子地提交的.txt文件中标识为：2012年10月11日 创建的 604_53324_SEQ_LIST_2012-030. txt，其大小为 3, 287 字节。 发明领域
[0007] 本申请涉及医学，特别地肿瘤学的领域。本发明还涉及分子生物学，特别地 microRNA的领域。
[0008] 发明背景
[0009] 卵巢癌是发达国家中妇科学癌症相关死亡的首要原因。虽然通过改进的减积手术 (debulking surgery)和钼-紫杉烧方案的引入在其治疗上已取得进步，但在晚期疾病中5 年总体存活率仅为29%，这主要归因于晚期的诊断和对钼类化学疗法的固有抗性和获得性 抗性。因此,鉴定卵巢癌化疗抗性（chemoresistance)的分子标志物是至关重要的。分子 水平上的发现的成功翻译将产生个体化治疗方案，改善化学治疗响应率和避免不必要的治 疗。
[0010] 特别地，上皮卵巢癌是最常见的妇科学恶性肿瘤；是高度侵袭性的并且每年引起 几乎125, 000例死亡。尽管在检测和细胞毒疗法上取得进展，但极低百分数的晚期疾病患 者在初次诊断后存活5年。该疾病的高死亡率主要归因于对可获得的疗法的抗性。
[0011] MicroRNA(miR)是一类小的非编码RNA，其调节基因表达，引起翻译抑制、mRNA切 割或去稳定作用。它们参与许多生理细胞过程。最重要地，不断积累的证据表明，许多miR 在人癌症中异常表达，并且它们的表达特征谱（profile)可对一些癌症的分期、亚型和预后 进行分类。
[0012] 附图概述
[0013] 本专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专 利申请公开案的拷贝可应要求和支付必要的费用后由专利局提供。
[0014] 图 1A-1D。
[0015] 图1A.使用TLDA卡对训练组的分析。显示显著的miR。
[0016] 图1B.鉴定的miR的图心分析。下调的miR以绿色表示，上调的miR以红色表示。
[0017] 图1C.以两个种类：非响应者（稳定的疾病和进行性疾病）和响应者（完全响应 者和部分响应者）重新定义的训练组中的显著miR。
[0018] 图ID.训练组中的显著的miR。
[0019] 图 2A-2D。
[0020] 图2A.用MDAH-2274对照细胞在右肋腹注射和用过表达miR-484的MDAH-2274在 左肋腹注射的小鼠的肿瘤体积。显示了 CBDCA+Tax治疗开始当天（左图）肿瘤的尺寸和21 天的治疗后它们的增大（右图）。
[0021] 图2B.用SK0V-3对照细胞在右肋腹注射和用过表达miR-484的SK0V-3在左肋腹 注射的裸小鼠的体内成像。在即将开始治疗时（左图框）和在21天的CBDCA+Tax治疗后 拍摄图像。
[0022] 图2C. B中描述的实验在治疗的第0天（左图）和在7、14和21天的治疗后（右 图）的体内EGFP荧光的定量。
[0023] 图2D.在CBDCA+Tax治疗存在的情况下表达对照（scr)或miR-484的慢病毒的瘤 内注射的作用。在每一个图中报告了显著的差异，如通过非参数t-检验评价的。当〈0.05 时，差异被认为是显著的。
[0024] 图 3A-3C。
[0025] 图3A.左图框：VEGFB的3' UTR中潜在miRs-484结合位点的比对。中间图框：在 293细胞中转染miR-484后VEGFB的Western印迹分析。右图框：微管蛋白与VEGFB的表 达之间的光密度比值（densitometric ratio)。
[0026] 图3Β·左图框：VEGFR2的3' UTR中潜在miRs-484结合位点的比对。中间图框：在 HUVEC细胞中转染miR-484后VEGFR2的Western印迹分析。右图框：微管蛋白与VEGFR2的 表达之间的光密度比值。
[0027] 图 3C.用混杂 miR(VEGFB cnt)或用 miR-484(VEGFB-miR-484)转染 的包含野生型VEGFB mRNA的3' UTR的载体、用混杂miR(VEGFB-mut cnt)或用 miR-484 (VEGFB-mut-miR-484)转染的包含突变的miR-484结合位点的载体、用混杂 miR(VEGFR2cnt)或用 miR-484(VEGFR2-miR-484)转染的包含野生型 VEGFR2mRNA 的 3' UTR 的载体，以及用混杂 miR(VEGFR2-mut cnt)或用 miR-484(VEGFR2-mut-miR-484)转染的包 含突变的miR-484结合位点的载体的萤光素酶测定（从左至右）。
[0028] 图 4A-4D。
[0029] 图4A-4B.响应者（图4A)和非响应者（图4B)的肿瘤的⑶34染色，在后者中显 示了具有明显的微血管形成的更高血管密度。
[0030] 图4C.用miR-484或对照转导的SK-0V3或MDAH2774细胞的小鼠异种移植物肿瘤 的肿瘤血管计数。
[0031] 图4D. miR-484和血管数目的回归分析。
[0032] 图 5A-5E。
[0033] 图5A-5B.显示了在稳定的转染后卵巢癌来源的细胞系（图5A)和来源于相同细 胞系的CM培养基（图5B)中的miR-484的表达。
[0034] 图5C.与卵巢癌来源的细胞系共培养的HUVEC细胞中的miR-484的水平。
[0035] 图5D.共培养的用缀合有FITC的miR-484 (绿色）转染的SK-0V3细胞和用缀合 有德克萨斯红的⑶31抗体（红色）染色的HUVEC的共聚集显微镜图像。
[0036] 图5E.右图框：在来自用miR-484或EGFP稳定转染的SK-0V3细胞的CM中培养的 HUVEC细胞的VEGFR2表达的Western印迹分析。左图框：微管蛋白与VEGFR2的表达之间 的光密度比值。
[0037] 图 6A-6D。
[0038] 图 6A. EOC 中的 miRs296 和 484 的表达。
[0039] 图6B.表格显示了 miR_296、484在指定的卵巢癌细胞系中的标准化的表达水平以 及它们对于CBDCA治疗的IC值（如方法部分中所述进行评价）。
[0040] 图 6C-6D. miR-484 和 miR-296 表达对于 MDAH-2274 (图 6C)和 SK0V-3 (图 6D)细 胞对CBDCA(上图框）和泰素（下图框）治疗的体外敏感性的作用。
[0041] 图7.在指定的条件培养基（CM)或对照存在的情况下在3D基质胶基质（Matrigel Matrix)上温育20小时的HUVEC的图像。如所显示的，当与来自对照细胞的CM相比较时， 来自用miR-484转导的SK0V-3和MDAH2774细胞的CM减小HUVEC在3D中正确形成和维持 管状结构的能力。
[0042] 图8.显示侵袭性浆液性卵巢癌的患者数据、关于临床结果的数据的表格。
[0043] 图9.响应者对难治性卵巢癌的miR表达特征。
[0044] 图 IOA-IOD。
[0045] 图 10A.HGS(SEQ ID NO :10)和 VEGFB(SEQ ID NO :12)的 3'UTR 中分别地潜在 miRs-296(SEQ ID N0:9)和 484(SEQ ID N0:11)结合位点的比对。
[0046] 图10B.显示了转染后293细胞中的miRs296和484的表达。
[0047] 图10C.左图框，在293细胞中转染miRs-296和484后，HGS、VEGFB和微管蛋白的 Western印迹分析，右图框，微管蛋白、HGS和VEGFB的表达之间的光密度比值。
[0048] 图 10D.用混杂 miR (HGS cnt)或用 miR-296 (HGS-miR296)转染的包含野生型 HGS 1111?隱的3'^1?的载体和用混杂111丨1?〇?5111此〇^)或用111丨1?-296〇?5111此11丨1?296)转染的包 含突变的miR296结合位点的载体的萤光素酶测定。
[0049] 图 10E.用混杂 miR (VEGFB cnt)或用 miR-484 (VEGFB-miR484)转染的包含野生型 VEGFB mRNA 的 3' UTR 的载体和用混杂miR(VEGFBmut cnt)或用 miR-484 (VEGFBmut-miR484) 转染的包含突变的miR484结合位点的载体的萤光素酶测定。
[0050] 图 IIA-11C。
[0051] 图11A. 30例（15例NR和15例R)人浆液性卵巢癌病例的肿瘤血管计数。
[0052] 图11B.用miR484或对照转导的SK0V-3或MDAH2774细胞的小鼠异种移植物肿瘤 的肿瘤血管计数。
[0053] 图11C. NR(左图框）和R(右图框）肿瘤的⑶34染色，在前者中显示了具有显著 的微血管形成的更高血管密度。
[0054] 发明概述
[0055] 在第一方面，本文中描述了诊断受试者的对化学治疗干预具有抗性的卵巢癌的方 法，包括：
[0056] a)鉴定与对照表达水平相比，来自受试者的样品中miR-484、miR-642和/或 miR-217的表达水平，和
[0057] b)如果相较于对照表达水平，受试者具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表达水平，则诊断受试者具有化疗抗性卵巢癌，或
[0058] c)如果相较于对照表达水平，受试者不具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表达水平，则诊断受试者不具有化疗抗性卵巢癌。
[0059] 在某些实施方案中，所述方法还包括鉴定与对照表达水平相比，miR-592、 miR-302d、miR-491、miR-483-5p、miR-653、miR-181a、miR-671-3p、miR-19a 和 / 或 miR-744 的表达水平。
[0060] 在某些实施方案中，所述方法包括鉴定与对照表达水平相比，miR-296-5p和/或 miR-518e的表达水平。
[0061] 在某些实施方案中，所述方法包括鉴定miR-484、miR-642和miR-217的水平。
[0062] 在某些实施方案中，化学治疗干预包括下列中的一种或多种的施用：钼类药物、卡 钼(Paraplatin?)、顺钼(Platinol?)、紫杉烧、紫杉酚（Taxol?)、多西紫杉醇 (Taxotere?)、Λ 西他滨（Gemzar?)、多柔比星（Adriamycin?、Doxil?)、 依托泊苷（VepesidC·?))、长春瑞滨（Navelbine?)、伊沙匹隆（Ixempra?)、 epithelone药物、贝伐单抗(AvaStin?)和/或苯妥帝尔。
[0063] 在某些实施方案中，所述方法包括：
[0064] 1)从获自受试者的样品反转录miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供特征 (signature)祀寡脱氧核糖核苷酸；
[0065] 2)将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特异性探 针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和
[0066] 3)将步骤⑵的特征谱与对照相比较。
[0067] 在某些实施方案中，所述方法包括将样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特 征谱相比较。
[0068] 在某些实施方案中，所述方法包括将样品杂交特征谱和与非癌样品相关的miR水 平的数据库、统计数据或表格相比较。
[0069] 在某些实施方案中，卵巢癌是浆液性上皮卵巢癌。
[0070] 在某些实施方案中，相较于对照，减少的miR-484表达确认了化疗抗性卵巢癌的 诊断。
[0071] 在另一个方面，本文中描述了确定人受试者是否具有卵巢癌的不良存活预后的方 法，包括：
[0072] a)测量人受试者的卵巢组织样品中特征miR基因产物的水平，所述特征miR基因 产物由miR基因产物：miR-484、mir-642和/或miR-217组成；和
[0073] b)当相对于无癌卵巢组织的对照样品中的miR基因产物的对应水平，样品中一个 或多个miR基因产物的水平的降低表明人受试者具有卵巢癌的不良存活预后时，确定人受 试者的不良存活预后。
[0074] 在某些实施方案中，所述方法包括：
[0075] 1)反转录样品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供特征祀寡脱氧核苷 酸；
[0076] 2)将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特异性探 针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和
[0077] 3)将步骤⑵的特征谱与对照相比较。
[0078] 在某些实施方案中，确定受试者的存活预后的步骤可区分浆液性卵巢癌与其它卵 巢癌。
[0079] 在某些实施方案中，确定受试者的存活预后的步骤预测对化学治疗干预的响应。
[0080] 在某些实施方案中，miR-484、miR-642和/或miR-217的特征组与分别特异于 miR-484、miR-642和/或miR-217的一个或多个探针杂交，并且相对于对照样品，miR-484、 miR-642和/或miR-217的水平的降低的存在表明对化学治疗干预的不良响应、人患者的不 良存活预后和/或浆液性卵巢癌的存在。
[0081] 在另一个方面，本文描述了用于测定受试者的化疗抗性卵巢癌的方法，所述方法 包括：
[0082] a)检测受试者的样品的miRNA表达特征谱，
[0083] b)将样品的miRNA特征谱与包含非癌性卵巢细胞的对照样品的miRNA表达特征谱 相比较，和
[0084] c)当样品的miRNA表达特征谱包括hsa-miR-484、hsa-miR-642和/或 hsa-miR-217中的一个或多个的表达的统计上显著的变化时，确定化疗抗性卵巢癌。
[0085] 在某些实施方案中，统计上显著的变化是miR-484的表达水平的降低。
[0086] 在某些实施方案中，特征microRNA包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642和 hsa-miR-217〇
[0087] 在另一个方面，本文描述了用于评价患者的临床状况的方法，包括步骤：
[0088] a)提供患者的生物样品，
[0089] b)测定样品中预先确定的特征miRNA的表达水平以获得miRNA表达特征谱，预先 确定的特征 miRNA 包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217，
[0090] c)将步骤（b)的miRNA表达特征谱与不同疾病包括卵巢癌特有的一个或多个参照 miRNA表达特征谱相比较，和
[0091] d)基于步骤（C)的比较评价患者的临床状况。
[0092] 在某些实施方案中，参照miRNA表达特征谱获自数据库，所述数据库发现于下列 中的一个或多个：国际互联网数据库、集中式数据库（centralized database)或分布式数 据库（decentralized database) 〇
[0093] 在某些实施方案中，测定包括预先确定的特征miRNA的定性、定量或半定量测定。
[0094] 在某些实施方案中，测定包括核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序、质谱法或其 任意组合。
[0095] 在另一个方面，本文中描述了用于评价患者的临床状况的试剂盒，其包括：
[0096] a)用于测定患者的生物样品中预先确定的特征miRNA的生物标志物，预先确定的 特征 miRNA 包括 hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217 中的至少一个，和
[0097] b)不同疾病包括卵巢癌特有的多个miRNA参照表达特征谱。
[0098] 在某些实施方案中，在数据库例如国际互联网数据库、集中式数据库或分布式数 据库中获得miRNA参照表达特征谱。
[0099] 在另一个方面，本文中描述了用于诊断患者的卵巢癌的试剂盒，其包括：
[0100] a)包括一种或多种检测器的捕获试剂，所述检测器特异于至少一种卵巢癌诊断生 物标志物,其中至少第一卵巢癌生物标志物为miR-484生物标志物，
[0101] b)检测试剂，和
[0102] c)使用试剂盒的说明书，当患者的生物样品中miR-484诊断生物标志物的表达水 平低于不具有卵巢癌的对照受试者的相同生物标志物的表达水平时，将患者诊断为具有卵 巢癌。
[0103] 在某些实施方案中，试剂盒还包括选自miR-642和miR-217生物标志物的一个或 多个另外的卵巢癌诊断生物标志物。在某些实施方案中，试剂盒还包括选自：hsa-miR-592、 hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、hsa-miR-491、hsa-miR-483_5p、 hsa-miR-653、hsa-miR-181a、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-19a 和 / 或 hsa-miR-744 的一个或 多个另外的卵巢癌诊断生物标志物。
[0104] 在另一个方面，本文中描述了用于诊断卵巢癌的一组寡核苷酸或多核苷酸，所述 寡核苷酸或多核苷酸包含一组选自下列的miRNA的序列：miR-484、miR-642和miR-217,和 /或其互补序列。
[0105] 在另一个方面，本文中描述了用于诊断患者的卵巢癌的方法，包括：
[0106] a)检测患者的生物样品中至少一个诊断生物标志物的表达水平，其中至少第一诊 断生物标志物是miR-484生物标志物，和
[0107] b)当患者样品中至少mir-484诊断生物标志物的表达水平低于源于不具有卵巢 癌的对照受试者的生物样品的相同生物标志物的正常表达水平时，将患者诊断为患有卵巢 癌。
[0108] 在某些实施方案中，所述方法还包括检测选自miR-642和miR-217生物标志物 的一个或多个另外的卵巢癌诊断生物标志物的表达水平。在某些实施方案中，所述方法 还包括检测选自 hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、 hsa-miR-491、 hsa-miR-483_5p、 hsa-miR-653、 hsa_miR-181a、 hsa-miR-671_3p、 hsa-miR-19a和/或hsa-miR-744的一个或多个另外的卵巢癌诊断生物标志物的表达水平。
[0109] 在某些实施方案中，所述方法包括步骤：
[0110] a)获得样品，其中所述样品包含卵巢细胞；
[0111] b)扩增样品的miRNA表达特征谱中的至少一个miRNA ;
[0112] c)测定样品的miRNA表达特征谱；和
[0113] d)将样品的miRNA表达特征谱与对照miRNA特征（包括miR-484、miR-642和 /或miR-271)相比较，其中对照miRNA特征在所述样品的miRNA表达特征谱中的重现 (repI ication)表明，所述样品包含对化疗性治疗具有抗性的卵巢癌细胞。
[0114] 本文中还描述了诊断卵巢癌的装置。卵巢癌诊断装置可包括：
[0115] a)包括一个或多个检测器的捕获试剂，所述检测器特异于至少miR-484、miR-642 和/或miR-217诊断生物标志物，和
[0116] b)用于检测患者的生物样品中至少诊断生物标志物的表达水平的检测试剂，其中 当至少一个诊断生物标志物在患者生物样品中的表达水平低于不具有卵巢癌的对照受试 者中的表达水平时，患者被诊断为患有卵巢癌。
[0117] 装置的捕获试剂可以是与诊断生物标志物特异性相互作用的有机或无机化学药 品、生物分子或其任何片段、同源物、类似物、缀合物或衍生物。在某些实施方案中，捕获试 剂是蛋白质和/或抗体，并且可被固定在固体载体上。
[0118] 本文中还描述了，区分可对利用化学治疗剂的治疗具有响应的卵巢癌患者与具有 化疗抗性卵巢癌的患者的诊断生物标志物组，所述具有化疗抗性卵巢癌的患者不能从利用 化学治疗剂的治疗受益。
[0119] 诊断生物标志物组通常可包括，至少用于区分这两种类型的患者和/或鉴定患者 (其对于不良预后结果具有最高风险和/或对目前可用的化学治疗干预具有不良响应）的 化疗抗性卵巢癌诊断生物标志物。鉴定处于发生此类不良预后的风险中的患者将导致对卵 巢癌患者的这些亚群使用更特异性、侵入性的疗法。
[0120] 在具体实施方案中，生物标志物的组合极大地增加了诊断的准确性。
[0121] 在另一个广泛方面，本文中描述了诊断受试者的与化疗抗性相关的浆液性卵巢癌 的方法，包括：
[0122] a)鉴定相较于对照的相对miR-484、miR-642和/或miR-217表达，和
[0123] b)如果相较于对照，受试者具有减少的miR-484、miR-642和/或miR-217的表达， 则诊断出受试者具有与化疗抗性相关的浆液性卵巢癌，或
[0124] c)如果相较于对照，受试者不具有减少的miR-484、miR-642和/或miR-217的表 达，则诊断出受试者没有与化疗抗性相关的浆液性卵巢癌。
[0125] 在某些实施方案中，所述方法包括鉴定相较于对照的相对miR-表达，其中步骤a) 还包括鉴定图IC中所列的一个或多个另外的miR :miR-592, miR-302d, miR-491, miR-483-5 p, miR-653, miR-181a, miR-671-3p, miR-19a 和 miR-744。在某些实施方案中，所述方法包括 鉴定相较于对照的相对miR-518e和/或296-5p表达。
[0126] 在某些实施方案中，所述方法包括基于诊断设计治疗计划。在某些实施方案中，所 述方法包括施用基于诊断的治疗。在某些实施方案中，所述方法包括，如果诊断出卵巢癌， 则施用抗-血管生成治疗。在某些实施方案中，所述方法包括基于诊断测定预后。
[0127] 在另一个广泛方面，本文中提供了增强上皮卵巢癌患者的药物敏感性的方法，包 括增加上皮卵巢癌患者的上皮卵巢癌细胞中的miR-484的水平。
[0128] 在某些实施方案中，通过选自基因疗法、小分子或生物制品的装置增加 miR。
[0129] 在另一个广泛方面，本文中提供了抑制上皮卵巢癌-相关血管生成的方法，包括 增加上皮卵巢癌患者的上皮卵巢癌细胞的miR的水平。
[0130] 在某些实施方案中，通过选自基因疗法、小分子或生物制剂的装置增加 miR。
[0131] 在某些实施方案中，所述方法包括确定受试者的存活预后，区分浆液性卵巢癌与 其它卵巢癌。
[0132] 在某些实施方案中，所述方法包括确定受试者的存活预后，预测对化疗干扰的响 应性。
[0133] 在某些实施方案中，特征miR-484、miR-642和miR-217分别与特异于miR-484、 miR-642和miR-217的探针杂交，并且相对于对照样品，miR-484、miR-642和miR-217的水 平的减少的存在表明对化疗干预的不良响应，人患者的不良存活预后和/或浆液性卵巢癌 的存在。
[0134] 在另一个广泛方面，本文中提供了确定化疗抗性卵巢癌的存在的方法，包括步 骤：
[0135] a)获得卵巢癌细胞的样品；
[0136] b)提取样品的总RNA ;
[0137] c)扩增样品中的至少一种miRNA ;
[0138] d)测定样品的miRNA表达特征谱；和
[0139] e)将肿瘤样品的miRNA表达特征谱与由miR-484、miR-642和miR-271中的一个 或多个组成的miRNA特征相比较，
[0140] 其中miRNA特征在样品的miRNA表达特征谱内的重现表明卵巢癌细胞对化疗性治 疗具有抗性。在某些实施方案中，卵巢癌包括浆液性卵巢癌。
[0141] 在另一个广泛方面，本文中提供了，包含选自hsa-miR-484、hsa-miR-642和 hsa-miR-217的一个或多个miRNA的microRNA特征，其中这些miRNA在卵巢细胞中的减少 的表达表明卵巢细胞是卵巢癌细胞。
[0142] 在某些实施方案中，这些miRNA中的任一个的表达的统计上显著的变化表明卵巢 癌细胞具有对化疗干预的抗性。
[0143] 在另一个广泛方面，本文中提供了用于诊断卵巢癌的一组寡核苷酸或多核苷酸， 其包含一组选自下列的miRNA的序列：miR-484、miR-642和miR-217,和/或其互补序列。
[0144] 根据随后的详细描述和权利要求，本发明的这些和其它目的以及有利方面（其中 的一些进行了明确描述，而其它的未进行明确描述）将变得显然。
[0145] 发明详述
[0146] 在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明 书。这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容通过引用并入本公开内容以更全面 地描述本发明所属领域的技术水平。
[0147]
[0148] 应理解，上文的一般描述和下文的详细描述仅是示例性的，并且无意限制本教导 的范围。在本申请中，除非明确地另有所指，否则单数的使用包括复数。
[0149] 当在权利要求书和/或说明书中与术语"包含"结合使用时，单词"一个/一种（a) " 或"一个/ 一种（an) "的使用可意指"一个/ 一种"，并且其还与"一个/ 一种或多个/多 种"、"至少一个/ 一种"和"一个/ 一种或超过一个/种"的含义一致。
[0150] 同样地，〃含有〃、〃包含〃和〃包括〃或这些根词的修饰形式例如但不限于〃含 有（comprises) 〃、〃包含（contained) 〃和〃包括（including) 〃的使用无意是限定性的。 术语"和/或"意指，之前和之后的术语可被合并在一起或分开来考虑。为了举例说明的 目的，但不是作为限制，"X和/或Y"可意指"X"或"Y"或"X和Y"。
[0151] 应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，为简便起见，术语〃基因〃用 于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括，参与 其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其它调控序列。
[0152] 术语〃miR〃、〃mir〃和"miRNA〃通常是指microRNA，一类能够调节RNA翻译的 小 RNA 分子（参见，Zeng 和 Cullen, RNA, 9(1) : 112-123, 2003 ;Kidner 和 Martienssen Trends Genet, 19(1):13-6, 2003 ；Dennis C, Nature,420(6917):732, 2002 ；Couzin J, Science298 (5602) :2296-7, 2002,其各自通过引用并入本文）。
[0153] 应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，为简便起见，术语〃基因〃用 于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括，参与 其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其它调控序列。
[0154] 术语"miRNA"通常是指单链分子，但在具体的实施方案中，本发明中应用的分子 也可包括，与相同单链分子的另一个区域或与另一个核酸部分互补（在整个链的长度上 10-50 %互补）、大体上互补（在整个链的长度上大于50 %，但少于100 %的互补）或完全互 补的区域或另外的链。因此，核酸可包括，包含一个或多个互补或自身互补链的分子或包含 分子的特定序列的"互补序列"。例如，前体miRNA可具有自身互补区域，其多至100%的互 补，本发明的miRNA可与它们的靶60、65、70、75、80、85、90、95或100%互补或至少60、65、 70、75、80、85、90、95 或 100%互补。
[0155] 如本文中所用，术语〃其组合〃是指，该术语之前所列项的全部排列和组合。例如， 〃A、B、C或其组合〃意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一个，并且如果在特定的上下 文中顺序是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
[0156] 除非另有所指，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中的常用术 语的定义可见于 Benjamin Lewin, Genes V，由 Oxford University Press, 1994 出 版（ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（eds·)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 BlackwellScience Ltd. ,1994 出版（ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.，1995 出版（ISBN1-56081-569-8)。
[0157] 为了有助于论述本公开内容的各种实施方案，提供了下列具体术语的解释：
[0158] 附加疗法：与基础治疗组合使用以改善基础治疗的效果的治疗。
[0159] 临床结果：其是指，在疾病或障碍的治疗后或在治疗不存在的情况下患者的健康 状态。临床结果包括但不限于，直至死亡的时间长度的增加、直至死亡的时间长度的减少、 存活机会的增加、死亡风险的增加、存活、无疾病存活、慢性疾病、转移、晚期或侵袭性疾病、 疾病复发、死亡以及对疗法的良好或不良响应。
[0160] 对照："对照"是指用于与实验样品例如获自患者的肿瘤样品比较的样品或标准。
[0161] 存活的减少：如本文中所用，"存活的减少"是指，患者死亡前时间长度的减少或患 者死亡的风险的增加。
[0162] 检测表达的水平：例如，"检测miR或miRNA表达的水平"是指定量存在于样品中 的miR或miRNA的量。检测特定miR或任何microRNA的表达可使用本领域已知或本文中 描述的任何方法，例如通过qRT-PCR来实现。检测miR的表达包括，检测miRNA的成熟形式 或与miRNA表达相关的前体形式的表达。通常地，miRNA检测法包括序列特异性检测，例如 通过RT-PCR。miR-特异性引物和探针可使用本领域已知的前体和成熟miR核酸序列来进 行设计。
[0163] MicroRNA(miRNA):调控基因表达的单链RNA分子。MicroRNA在长度上通常为 21-23个核苷酸。MicroRNA从称为pri-miRNA的初级转录物被加工成称为前体（pre) -miRNA 的短莖-环结构，最后被加工成功能性成熟的microRNA。成熟的microRNA分子与一个或多 个信使RNA分子部分互补，并且它们的主要功能是下调基因表达。MicroRNA通过RNAi途径 调控基因表达。
[0164] miR表达：如本文中所用，"低miR表达"和"高miR表达"是相对术语，其涉及在样 品中发现的miRNA的水平。在一些实施方案中，低和高miR表达通过比较一组对照样品与测 试样品的miRNA水平来测定。随后可基于样品中miR的表达是高于（高）还是低于（低） 平均或中位miR表达水平来将低和高表达分配给每一个样品。对于单个样品，高或低miR 表达可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品相比较，或通过与标准值比较 来测定。低和高miR表达可包括miRNA的前体或成熟形式或两者的表达。
[0165] 受试者：如本文中所用，术语"受试者"包括人和非人动物。进行治疗的优选患者 是人。"患者"和"受试者"在本文中可互换使用。
[0166] 药学上可接受的媒介物：用于本公开内容的药学上可接受的载体（媒介物）是 常规的° Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. ,Eastern，PA,第15版（1975)描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的药 物递送的组合物和制剂。
[0167] 预防、治疗或改善疾病："预防"疾病是指抑制疾病的完全发展。"治疗"是指在疾 病或病状开始发展后改善疾病或病状的体征或症状的治疗干预。"改善"是指疾病的体征或 症状的数目或严重度的减少。
[0168] 筛选：如本文中所用，"筛选"是指用于评价和鉴定影响疾病的候选试剂的方法。 microRNA的表达可使用本领域已知的和本文中描述的许多技术中的任一种，例如通过微阵 列分析或通过qRT-PCR来定量。
[0169] 小分子：通常具有小于约1000道尔顿，或在一些实施方案中，小于约500道尔顿的 分子量的分子，其中分子能够在一定可测量的程度上调节靶分子的活性。
[0170] 治疗：包括诊断和治疗的总称。
[0171] 治疗剂：当恰当地给受试者施用时能够诱导期望的治疗或预防作用的化合物、小 分子或其它组合物例如反义化合物、抗体、蛋白酶抑制剂、激素、趋化剂或细胞因子。
[0172] 如本文中所用，"候选试剂"是被选择用于筛选以确定其是否可用作治疗剂的化合 物。"温育"包括用于试剂与细胞或组织相互作用的充足量的时间。"接触"包括将试剂以 固体或液体形式与细胞或组织一起温育。用试剂"处理/治疗"细胞或组织包括将试剂与 细胞或组织接触或一起温育。
[0173] 治疗有效量：足以在待用试剂治疗的受试者或细胞中获得期望的作用的指定的药 物试剂或治疗剂的量。试剂的有效量将取决于几个因素，包括但不限于待治疗的受试者或 细胞，以及治疗性组合物的施用方式。
[0174] 在本发明方法的一些实施方案中，对照的使用是期望的。在这点上，对照可以是获 自相同患者的非癌性细胞/组织样品，或获自健康受试者例如健康组织供者的细胞/组织 样品。在另一个实例中，对照是从历史值计算的标准。可按照本领域已知的任何方法获得肿 瘤样品和非癌性细胞/组织样品。例如，可从已经历切除术的癌症患者获得肿瘤和非癌性 样品，或可通过使用皮下注射针头的提取，通过显微解剖，或通过激光捕获来获得它们。对 照（非癌性）样品可以例如从尸体器官供者或从健康供者获得。
[0175] 有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可通过天然加工途径（例如，使用完整细 胞或细胞裂解物）或通过合成加工途径（例如，使用分离的加工酶例如分离的Dicer、 Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活 性的19-25个核苷酸的RNA分子，而不必从miR前体加工获得。当在本文中通过名称提及 microRNA时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。
[0176] 可在获自受试者的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如， 可通过常规活组织检查技术从怀疑患有卵巢癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案 中，可从受试者取出血液样品，可通过标准技术分离白细胞以用于DNA提取。优选在开始放 射疗法、化学疗法或其它治疗性治疗之前，从受试者获得血液或组织样品。对应的对照组织 或血液样品或对照参照样品可获自受试者的未患病组织，获自正常人个体或正常个体的群 体，或获自对应于受试者样品中的大部分细胞的培养细胞。随后将对照组织或血液样品与 来自受试者的样品一起处理，以便可将受试者样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR 基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平相比较。或者，可获得参 照样品并且将其与测试样品分开地（例如，在不同时间）进行处理，可将测试样品的细胞 中从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与参照样品的对应miR基因产物水平相比 较。
[0177] 在一个实施方案中，测试样品的至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的 对应miR基因产物的水平（即，miR基因产物的表达〃上调〃或"增加"）。如本文中所用， 当受试者的细胞或组织样品中的miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中的相同基 因产物的量时，miR基因产物的表达是增加的。在另一个实施方案中，测试样品的至少一种 miR基因产物的水平低于对照样品的对应miR基因产物的水平（即，miR基因产物的表达〃 下调"或"减少"）。如本文中所用，当受试者的细胞或组织样品中从该基因产生的miR基 因产物的量少于从对照细胞或组织样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达减少。可 相对于一个或多个RNA表达标准来测定对照和正常样品中的相对miR基因表达。标准可包 括例如OmiR基因表达水平，标准细胞系的miR基因表达水平、受试者的未患病组织的miR 基因表达水平，或先前获得的正常人对照群体的miR基因表达的平均水平。
[0178] 获自受试者的样品的miR基因产物的水平相对于对照样品的对应miR基因产物的 水平的改变（即，增加或减少）表明受试者存在卵巢癌。在一个实施方案中，测试样品的至 少一种miR基因产物的水平高于对照样品的对应miR基因产物的水平。在另一个实施方案 中，测试样品的至少一种miR基因产物的水平低于对照样品的对应miR基因产物的水平。
[0179] 在一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自本文中的表格和附图中显示的 miR基因产物。
[0180] 样品的miR基因产物的水平可使用适合用于检测生物样品的RNA表达水平的任何 技术来测量。用于测定生物样品（例如，细胞、组织）中的RNA表达水平的适当技术（例如， Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交）对于本领域技术人员来说是公知的。在特定的实施 方案中，使用Northern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过在核酸 提取缓冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离心来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸， 然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电 泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使 用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter7,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0181] 用于给定的miR基因产物的Northern印迹杂交的适当探针（例如，DNA探针、 RNA探针）可从本文的表中提供的核酸序列产生，并且包括但不限于，与目标miR基因产物 具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的互补性的探针，以及与目标 miR基因产物完全互补的探针。用于制备标记的DNA和RNA探针的方法以及用于其与靶核 苷酸序列的杂交的条件描述于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook 等 人，eds.，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ChapterslO 和 11，其公 开内容通过引用合并入本文。
[0182] 例如，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、 14C或35S ;重金属；能够用作已标记的 配体的特异性结合对成员的配体（例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体）；荧光分子；化学 发光分子；酶等来标记核酸探针。
[0183] 可通过 Rigby 等人（1977)，J. Mol. Biol. 113:237-251 的切口平移法或 Fienberg 等人（1983) ,Anal. Biochem. 132:6-13的随机引物法（其全部公开内容通过引用合并入本 文）将探针标记至高比放射性（specific activity)。后者是选择用于从单链DNA或从RNA 模板合成高比放射性的32P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移法通过用高放射性的 核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大大超过IO 8Cpm/微克的比放射性的32P-标 记的核酸探针。然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴 露于杂交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了 miR基因转录物水平的精确测量。使用另一 个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences, Piscataway, NJ获得 的 Molecular Dynamics400_B2D Phosphorimager 定量 miR 基因转录物水平。
[0184] 当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例 如dTTP类似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己酰基）-3-氨基烯丙基）脱氧尿苷三磷酸掺 入探针分子。可通过与结合生物素的蛋白质例如偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的抗 生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体（例如抗生物素抗体）反应来检测生物素化的探针 寡核苷酸。
[0185] 除了 Northern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的 水平。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片 上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸（例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核 酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活组织检查样品。原位杂交技术的实 施在美国专利5, 427, 916 (其全部公开内容通过引用合并入本文）中进行了更详细的描述。 用于给定的miR基因产物的原位杂交的适当探针可从本文的表中提供的核酸序列产生，并 且包括但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或99%的互补性的探针，以及与目标miR基因产物完全互补的探针，如上文中描述的。
[0186] 细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进行逆转录，然后 通过聚合酶链式反应（RT-PCR)扩增经逆转录的转录物来进行测定。可通过与内部标准例 如来自存在于相同样品中的"持家"基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的 水平。用作内部标准的合适的"持家"基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (G3TOH)。用于进行定量和半定量RT-PCR的方法以及其变型对于本领域技术人员来说是公 知的。
[0187] 在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在 其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR基因的转录物的表达水平。评估数 百种miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平非常费时并且需要大量的总RNA (例如，对 于每一个Northern印迹需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
[0188] 为了克服这些限制，可构建以微芯片形式（即，微阵列）存在的寡核苷酸文库，该 文库包含特异于一组miR基因的一组（或特征）寡核苷酸（例如，寡脱氧核苷酸）探针。使 用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，将它们与微阵列上的探针（寡 核苷酸）杂交以产生杂交或表达特征谱来测定生物样品中多个microRNA的表达水平。然 后将受试样品的杂交谱与对照样品的杂交谱比较，从而确定在卵巢癌细胞中具有改变的表 达水平的microRNA。如本文中所使用的，"探针寡核苷酸"或"探针寡脱氧核苷酸"是指能 够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。"靶寡核苷酸"或"靶寡脱氧核苷酸"是指待检测（例如， 通过杂交）的分子。"miR-特异性探针寡核苷酸"或"特异于miR的探针寡核苷酸"是指具 有选择用于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷 酸。
[0189] 特定样品的"表达特征谱"或"杂交特征谱"本质上是样品的状态指纹；虽然两种 状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是 独特的基因表达特征谱。即，正常组织可与癌细胞相区别，并且在癌细胞类型内，可确定不 同的预后状态（例如，良好的或不良的长期存活希望）。通过比较不同状态的卵巢细胞的表 达特征谱，获得关于在这些状态的每一个状态中为重要的（包括基因的上调或下调）基因 的信息。在癌细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达 允许以许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案（例如，确定化疗药物是否改善 特定患者的长期预后）。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确认 诊断。此外，这些基因表达特征谱（或个体基因）允许筛选抑制miR或疾病表达特征谱或 将不良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。
[0190] 因此，本发明提供了诊断受试者是否患有癌症或处于发展癌症的风险中的方法， 该方法包括逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧 核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交特征谱， 和将受试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱比较，其中至少一种miRNA的信 号的改变表不受试者患有卵巢癌或处于发展卵巢癌的风险中。在一个实施方案中，微阵列 包含人miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸。
[0191] 可从基因特异性寡核苷酸探针（所述探针从已知的miRNA序列产生）制备微阵 列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而另 一种探针特异于miRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格条件的对照的对照，例如与 人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的tRNA 或其它RNA(例如，rRNA、mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定 的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该 目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性选择序列。
[0192] 可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如 40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5' -胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如 GeneMachine 0mniGridTM100Microa;rraye;r 和 Amersham CodeLink? 活化的载玻片进行印 制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一 链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交 条件（例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中进行18小时，然后在37°C下于0. 75X TNT 中清洗40分钟）下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的互 补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从 而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰 度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA 寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素 蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法 扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
[0193] 使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴 定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成 熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2.5yg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个）允许对数个 物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析 各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
[0194] 除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分（优选 整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分 析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征与已建立的疾病标记关联或直接与疾病 状态关联。
[0195] 按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有癌症（例如卵巢癌）的受 试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核 苷酸。然后将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供 样品的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。杂交特征 谱包括来自靶寡脱氧核苷酸（其来自样品）与微阵列中的miRNA-特异性探针寡核苷酸结 合的信号。所述谱可记录为结合的存在或不存在（信号对〇信号）。更优选地，记录的谱包 括来自各杂交的信号的强度。将所述谱与从正常的（例如，非癌性）对照样品产生的杂交 特征谱相比较。信号的改变表示受试者中存在癌症或易于发生癌症。
[0196] 用于测量miR基因表达的其他技术也在本领域技术人员的能力之内，其包括用于 测量RNA转录和降解的速率的各种方法。
[0197] 本发明还提供了，测定具有卵巢癌的受试者的预后的方法，包括测量来自受试者 的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，所述miR基因产物与卵巢癌的特定预后（例 如，良好或积极预后，不良或不利预后）相关。根据这些方法，相较于对照样品的对应miR 基因产物的水平，测试样品中与特定预后相关的miR基因产物的水平的改变表明受试者患 有具有特定预后的卵巢癌。在一个实施方案中，miR基因产物与不利（S卩，不良）预后相关。 不利预后的实例包括但不限于，低存活率和快速疾病进展。
[0198] 在某些实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平：逆转录获自受试者 的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将该靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性 探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征谱，然后将受试样品的杂交特 征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。
[0199] 不希望受任何一个理论束缚，据信，细胞中一个或多个miR基因产物的水平的改 变可导致这些miR的一个或多个期望的靶的失调，这可导致卵巢癌的形成。因此，改变miR 基因产物的水平（例如，通过降低在卵巢癌细胞中被上调的miR的水平，通过升高在卵巢癌 细胞中被下调的miR的水平）将改善化疗抗性卵巢癌的症状。
[0200] 因此，本发明包括治疗受试者的卵巢的方法，其中至少一种miR基因产物在受试 者的细胞（例如，卵巢癌细胞）中失调（例如，下调、上调）。在一个实施方案中，测试样品 (例如，卵巢癌样品）中至少一种miR基因产物的水平高于对照样品中的对应miR基因产物 的水平。在另一个实施方案中，测试样品（例如，卵巢癌样品）中至少一种miR基因产物的 水平低于对照样品中的对应miR基因产物的水平。当至少一种分离的miR基因产物在卵巢 癌细胞中被下调时，所述方法包括施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，或其分离 的变体或生物活性片段，以便患者的癌细胞的增殖被抑制。例如，当miR基因产物在受试者 的癌细胞中被下调时，给受试者施用有效量的分离的miR基因产物可抑制癌细胞的增殖。 给受试者施用的分离的miR基因产物可以与在癌细胞中被下调的内源野生型miR基因产物 (例如，本文的表中显示的miR基因产物）相同，或可以是其变体或生物活性片段。
[0201] 如本文中所定义的，miR基因产物的〃变体〃是指，与对应野生型miR基因产物具 有少于100 %的同一性并且具有对应野生型miR基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。 此类生物活性的实例包括但不限于，靶RNA分子的表达的抑制（例如，抑制靶RNA分子的翻 译，调节靶RNA分子的稳定性，抑制靶RNA分子的加工）和与卵巢相关的细胞过程（例如， 细胞分化、细胞生长、细胞死亡）的抑制。这些变体包括物种变体和由于miR基因的一个或 多个突变（例如，置换、缺失、插入）而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型 miR基因产物具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
[0202] 如本文中所定义的，miR基因产物的〃生物活性片段〃是指，具有对应野生型miR 基因产物的一个或多个生物活性的miR基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活 性的实例包括但不限于，靶RNA分子的表达的抑制和与卵巢癌相关的细胞过程的抑制。在 某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体 的实施方案中，可将分离的miR基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施 用。适当的抗癌治疗包括但不限于，化学疗法、激素疗法、放射疗法以及组合（例如，放化 疗）。
[0203] 激素疗法是用于不能耐受化学疗法或不能从化学疗法得到帮助的患者的选择。激 素疗法药物包括他莫昔芬(Nolvadex?)，和芳香酶抑制剂例如来曲唑（Femara?)、 阿那曲唑(Arimidex?)和依西美坦(Aromasin?)。
[0204] 基于MicroRNA的治疗和诊断可改善卵巢癌的治疗并且可涉及疗法的组合。在治 疗卵巢癌中，可使用钼类药物例如卡钼(Parap I a t i η?)或顺钼(p I a t i no】。其它 治疗可包括紫杉烧，例如紫杉酚(Taxol?)或多西紫杉醇(Taxotere?)。目前，紫杉酚 是最常用作与钼类药物组合的初始疗法的药物。
[0205] 使用的其它药物可以是：吉西他浪（Gemzar?)、多柔比星 (Adriamycin⑧，Doxi 1?)、依托泊苷（Vepesid?)、长春瑞滨 (Navelbine?)、伊沙匹隆（Ixempra?)和其它印itheione药物、贝伐单抗 (Ava s t in?)和苯妥帝尔。
[0206] 本发明的实施方案可基于肿瘤对选择的治疗的响应性的预测和指示，用于选择 适当的药物以及定制患者的治疗。例如，贝伐单抗(Ava s t i η?)靶向血管内皮生长因子 (VEGF)，参与癌细胞生长的蛋白质。VEGFB和VEGFR2途径受miR-484和miR-296-5p影响。 MicroRNA测量可用于预测药物功效和化疗抗性。
[0207] 当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中被上调时，所述方法包括给受试者施 用有效量的抑制至少一种miR基因产物表达的化合物，以便卵巢癌细胞的增殖被抑制。此 类化合物在本文中称为miR基因表达-抑制化合物。适当的miR基因表达-抑制化合物 的实例包括但不限于，本文中描述的那些化合物（例如，双链RNA、反义核酸和酶促RNA分 子）。在具体的实施方案中，可将miR基因表达-抑制化合物与一种或多种另外的抗癌治疗 组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗包括但不限于化学疗法、放射疗法及其组合（例如， 放化疗）。
[0208] 如本文中所使用的，术语"治疗"、"医治"和"疗法"是指改善与疾病或病况例如卵 巢癌相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的症状的严重 度或频率。术语"受试者"和"个体"在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限 于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马科、犬 科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施这群中，动物是人。
[0209] 如本文中所使用的，分离的miR基因产物的"有效量"是足以在患有卵巢癌的受试 者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试 者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容 易地确定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。
[0210] 例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量。肿瘤块 的大致重量可通过计算肿瘤块的大致体积来测定，其中1立方厘米的体积大致等于1克。基 于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可在约10-500微克/克的肿瘤块的范围 内。在某些实施方案中，有效量可以为至少约10微克/克的肿瘤块，至少约60微克/克的 肿瘤块或至少约100微克/克的肿瘤块。
[0211] 分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优 选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR 基因产物的有效量可在大约5-3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内 或大于大约1000微克/kg体重。
[0212] 本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的miR基因 产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次（例如，作为单次注射或沉积 (deposition))miR基因产物。可选择地，可以每天1次或2次对受试者施用miR基因产物， 进行大约3至大约28天,特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天I 次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的miR 基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。
[0213] 如本文中使用的，"分离的"miR基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改 变或取出的miR基因产物。例如，合成的HliR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存 材料分离的miR基因产物被认为是"分离的"。分离的HliR基因产物可以以大体上纯化的形 式存在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至 细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是"分离的"miR基因产物。在细胞内从miR前 体分子产生的miR基因产物也被认为是"分离的"分子。根据本发明，本文中描述的分离的 miR基因产物可用于制造用于治疗受试者（例如，人）的卵巢癌的药物。
[0214] 分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方 法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚 磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的 提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. ) > Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U. S. A.) > Glen Research(Sterling，VA，U. S. A. )、ChemGenes(Ashland，MA，U. S. A.)和 Cruachem(Glasgow, UK) 〇
[0215] 可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产 物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或HlRNA pol III启动子序列或巨 细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质 粒还可包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
[0216] 可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还 可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论 述重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
[0217] miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个 实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统（包 括但不限于癌细胞中现有的加工系统）将该前体分子加工成功能性miR基因产物。其他合 适的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统（例如，如属于Tuschl等人的美国公开专 利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文）和大肠杆菌RNA 酶ΙΠ 系统（例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全 部公开内容通过引用合并入本文）。
[0218] 适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达 基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之 内。参见，例如，Zeng 等人（2002)，]?〇16(311131'06119:1327-1333;1\18(*1(2002)，恥七· Biotechnol, 20:446-448 ;Brummelkamp 等人（2002)，Science296:550-553 ;Miyagishi 等 人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20:497-500 ;Paddison 等人（2002) ,Genes Dev. 16:948-958; Lee 等人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20: 500-505;和 Paul 等人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20:505-508,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0219] 在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子 (intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的， "在启动子的控制下"是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3'端，以便启动子可 起始miR基因产物编码序列的转录。
[0220] miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组 病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病 毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将 miR基因产物递送至癌细胞的用途。
[0221] 本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何 合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或HlRNA pol III启动子序列，或巨细胞病 毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载 体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
[0222] 可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒 (AV)、腺伴随病毒（AAV)、逆转录病毒（例如，慢病毒（LV)、弹状病毒（Rhabdoviruses)、鼠 白血病病毒）、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型 化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白（如果合适）来改变病毒载体的趋向性。
[0223] 例如，可用来自水泡性口膜炎病毒（VSV)、狂犬病病毒（rabies)、埃博拉病毒 (Ebola)、莫科拉病毒（Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体 进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细 胞。例如，表达血清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2。AAV2/2载 体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV2/5载体。用于 构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例 如，Rabinowitz，J.E·，等人（2002)，J. Virol. 76:791-801，其全部公开内容通过引用合并 入本文。
[0224] 适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插 入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领 域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg (1995) ,Gene Therap. 2:301-310 ;Egl itis (1988)，Biotechniques6:608-614 ;MiIler(1990)，Hum. Gene Therap. 1:5-14 ;和 Anderson(1998)，Nature392:25-30,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0225] 特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适的 AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等 人（2002)，Nat.Biotech. 20:1006-1010,其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达 miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶 细胞的方法描述于 Samulski 等人（1987)，J. Virol. 61:3096-3101 ;Fisher 等人（1996)，J. Virol, 70:520-532 ;Samulski 等人（1989)，J. Virol. 63:3822-3826 ;美国专利 5, 252, 479 ; 美国专利5, 139,941 ;国际专利申请W094/13788 ;和国际专利申请W093/24641，其全部公开 内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV 载体表达miR基因产物。
[0226] 在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子控制下的 与PolyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，"与polyT 终止序列有效连接"是指编码有义或反义链的核酸序列以5'方向与polyT终止信号紧密邻 接。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
[0227] 在本发明的治疗方法的其他实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制 miR表达的化合物。如本文中所使用的，"抑制miR表达"是指治疗后miR基因产物的前体 和/或有活性的成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如本文中论述的测定 miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在癌细胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表达的水平上（即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录）或 在加工的水平上（例如，通过抑制miR前体至成熟的活性miR的加工）发生。
[0228] 如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的"有效量"是足以在患有癌症（例如， 卵巢癌）的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重、疾 病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的， 本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的抑制miR表达的化合物的有效量。
[0229] 例如，抑制表达的化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量，如本文中 描述的。抑制miR表达的化合物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致体重或估计的体 重,如本文中描述的。
[0230] 本领域技术人员还可容易地确定用于给给定的受试者施用抑制miR表达的化合 物的适当给药方案，如本文中描述的。
[0231] 用于抑制miR基因表达的适当的化合物包括双链RNA(例如短的或小的干扰RNA 或"siRNA"）、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物的每一种可靶向给定的miR 基因产物并干扰靶miR基因产物的表达（例如，通过抑制翻译，通过诱导切割和/或降解）。
[0232] 例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA( "dsRNA"）分子诱导miR 基因的RNA干扰来抑制，所述双链RNA分子与miR基因产物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的实施方案中，dsRNA分 子是"短的或小干扰RNA"或" siRNA"。
[0233] 用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷酸、优选长度大 约19至大约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互 作用（在下文中"碱基配对"）退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含大 体上与靶miR基因产物内包含的核酸序列同一的核酸序列。
[0234] 如本文中所使用的，siRNA中与靶mRNA内包含的靶序列"大体上同一"的核酸序列 是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于1或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义 和反义链可包括两个互补的单链RNA分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过 单链"发夹结构"区域共价连接的单个分子。
[0235] siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和 /或改变的经改变的RNA。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加，例如至siRNA的末端或 至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧核 糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。
[0236] siRNA的一条或两条链还可包含3'悬突。如本文中所用的，"3'悬突"是指从双 链RNA链的3' -末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包 含至少一个长度为1至大约6个核苷酸（其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）、长度为1 至大约5个核苷酸、长度为1至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核苷酸的3'悬 突。在特定的实施方案中，3'悬突存在于siRNA的两条链上，且其长度为2个核苷酸。例 如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸（"TT"）或二尿苷酸（"uu"）的3'悬突。
[0237] siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分 离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 属于Gewirtz的美国公开专利申请2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请 2004/0018176,这两者的全部公开内容通过引用合并入本文。
[0238] 给定的miR基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用的，"反义核酸" 是指通过RNA-RNA，RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶 RNA的活性。适合用于本方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互 补的核酸序列的单链核酸（例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸（PNA))。反义核酸可 包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补的核 酸序列。本文的表中提供了特定人miR基因产物的核酸序列。不希望受任何理论束缚，据 信，反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。
[0239] 反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分（或它们的等价物）的修饰，从 而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效相关的其他性质。此类修饰包括胆固醇 部分、双链体插入剂例如吖啶或一种或多种抗核酸酶基团。
[0240] 反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文 对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力 之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993)，Science261:1004以及属于Woolf等人的美国专 利5, 849, 902,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0241] 给定的miR基因的表达还可通过酶促核酸（enzymatic nucleic acid)抑制。如 本文中所使用的"酶促核酸"是指包含与miR基因产物的连续核酸序列互补的底物结合区 并且能够特异性切割miR基因产物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与miR基因产物 中的连续核酸序列50-100 %互补、75-100 %互补或95-100 %互补。酶促核酸还可包括在碱 基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本方法的示例性酶促核酸是核酶。
[0242] 酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上 文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性 方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995)，Nucl. Acids Res. 23:2092-96 ;Hammann 等人 (1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31 ;以及属于Cech等人的美国专利 4, 987, 071，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0243] 至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制miR表达的化合物的施用将在患有癌 症（例如，卵巢癌）的受试者中抑制癌细胞的增殖。如本文中所使用的，"抑制癌细胞的增 殖"是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或减缓细胞的生长。如果受试者中癌细胞的数目 在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后保持恒定或减少，那么可推断癌细胞 增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖 被抑制。
[0244] 受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大 小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设 计用于检测癌细胞的特征表面标记的其他技术来测量。
[0245] 可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法来对受试者施 用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。例如，可通过适合于用此类化合物或用包 含编码此类化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或抑制miR 表达的化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或抑制miR基因表 达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。
[0246] 用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，包括例如核酸至细胞的细胞核或 前核（pronucleus)的直接注射、电穿孔、脂质体转移和由亲脂材料介导的转移、受体介导 的核酸递送、基因枪或微粒加速、磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。
[0247] 例如，细胞可用质脂体转移化合物例如D0TAP(N-[1_(2,3-二油酰氧基）丙 基]-N, N, N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物例如LIP0FECTIN进行 转染。使用的核酸的量对于实施本发明不是至关重要的；可接受的结果可用〇. 1-100微克 核酸/105个细胞来获得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大约0. 5微克质粒载体/105 个细胞的比例。
[0248] 还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物或 抑制miR基因表达的化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠 或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内给药（例如，静脉内团注（bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注）；组织外 周（peri-tissue)和组织内注射（例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下 注射）；皮下注射或沉积，包括皮下输注（例如通过渗透泵）；对目的组织的直接施用，例如 通过导管或其他安置装置（例如，视网膜丸剂（retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无 孔的或凝胶状材料的植入物）；以及吸入。特别适合的施用途径是注射、输注和至肿瘤内的 直接注射。
[0249] 在本方法中，miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物可以以裸露的RNA形 式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸 (例如，重组质粒或病毒载体）的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO 亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子（例如，多聚赖 氨酸）和脂质体。
[0250] 包含表达miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的重组质粒和病毒载 体、以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在领域是 公知的。
[0251] 在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物 (或包含编码它们的序列的核酸）递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血 液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常 包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期 望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方 法，例如如 Szoka 等人（1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 ;和美国专利 4, 235, 871、 4, 501，728、4, 837, 028和5, 019, 369 (其全部公开内容通过引用合并入本文）中所描述的方 法。
[0252] 用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍 的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
[0253] 用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统（"MMS"）和网状 内皮系统（"RES"）清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制 部分和配体。
[0254] 用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大 的亲水聚合物。如本文中所使用的，抑制调理作用的部分，当其通过化学或物理方式（例如 通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团的直接结合）附着至膜时，与脂质 体膜"结合"。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的 保护性表面层；例如，如美国专利4, 920, 016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入 本文。
[0255] 适合于修饰脂质体的抑制调理作用的部分优选是具有大约500至大约40, 000道 尔顿，更优选大约2, 000至大约20, 000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚 合物包括聚乙二醇（PEG)或聚丙二醇（PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG 或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的 或树枝状聚酰胺；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇， 以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚 物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚乙二胺、聚 乙烯胺或多聚核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的 天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、 角叉菜胶（carrageenan);胺化的多糖或低聚糖（线性或分支的）；或羧基化的多糖或低聚 糖，例如与具有所得的羧基的连接的碳酸的衍生物反应的多糖或低聚糖。优选，抑制调理作 用的部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为"PEG化脂 质体"。
[0256] 可通过许多熟知的技术中的任一种将抑制调理作用的部分结合至脂质体膜。例 如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。 类似地，可使用Na(CN)BH 3和溶剂混合物（例如以30:12比例的四氢呋喃和水）在60°C下 通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖（dextran)聚合物。
[0257] 用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。 因此，此类脂质体有时称为"隐形（stealth)"脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或"渗 漏"微脉管系统饲喂的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤 (例如，卵巢癌）将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon,等人（1988)，？1*〇(^似1:1^〇3(1· Sci.，U. S.A.，18:6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大 量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用 于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物（或包含编码它们的序列的核酸）递送至 肿瘤细胞。
[0258] 可在将它们给受试者施用之前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或miR基 因表达-抑制化合物配制为药物组合物，有时称为"药物"。因此，本发明包括用于治疗卵 巢癌的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或 其分离的变体或生物活性片段，以及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，至少一种 miR基因产物对应于与适当的对照细胞相比，在卵巢癌细胞中具有降低的表达水平的miR 基因产物。
[0259] 描沭
[0260] 尽管在检测和细胞毒疗法上取得进展，但极低百分数的晚期疾病患者在初次诊断 后存活5年。该疾病的高死亡率主要归因于对可获得的疗法的抗性。
[0261] 考虑到卵巢肿瘤的不良预后（主要归因于晚期诊断和对化学疗法的低响应），本 发明人现已鉴定了治疗响应性的预测标志物和增强对治疗的敏感性的新型分子靶。
[0262] 本文中描述了可用于鉴定对常规化学疗法具有响应的那些患者和有效地从 抗-血管生成化合物的添加受益的那些患者（从而也降低了治疗成本并改善了药物的效 力）的miR的分子特征。
[0263] 此外，数据显示，除非VEGFB信号转导也被阻断，否则使用单独的抗-VEGFA抗体进 行的对VEGF的阻断在卵巢癌患者中是没有用的。可选择地，小的化合物例如靶向VEGFRl和 2受体的功能化纳米颗粒可在该患者中用作改变卵巢癌的预后和治疗的过程的有效疗法。 实施例
[0264] 本发明的某些实施方案定义于本文的实施例中。应当理解，这些实施例，虽然显示 了本发明的优选实施方案，但是仅以举例说明的方式给出。根据上述论述和这些实施例，本 领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发 明进行各种改变和变动，以使其适合各种用途和条件。
[0265] 实施例1
[0266] 方法
[0267] 在伦理学委员会批准研究并且所有患者给出他们的知情同意后，本发明人获得了 198份卵巢的侵袭性浆液性癌的样本。关于临床结果的数据获自患者的记录。按照RECIST 指导，将对初始化学疗法的响应分类为完全响应（CR)、部分响应（PR)、稳定的疾病（SD)和 进行性疾病（PD)。
[0268] miR表达特征分析和数据确认
[0269] 使用包含总共 676 个独特测定的 TaqMaH? Array Human MicroRNA Set v2. 0 对训练组（86个样品）进行miR表达特征分析。使用TaqMan? MicroRNA测定对验证组 (112样品）验证差异表达的miR。
[0270] 统计分析
[0271] 使用用于基因表达的相对定量的比较CT(A ACt)法在Data Assist ver. I. 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA)上分析 TaqMan 低密度阵列卡（TLDA)和 RT-PCR数据。对于每一个样品，平均miRNA表达值被计算为小于35的Ct值的平均值。基 于它们对第一化学疗法的响应或其它临床参数标记样品。使用R软件将单因素方差分析用 于鉴定差异表达的miRNA。全局中位数标准化（Global median normalization)用于TLDA 卡的表达分析。miR-16和miR-191，训练组中最恒定的miRNA中的两个，用作内源对照用于 验证组的RT-PCR的标准化。所有数据表达为平均值土SEM。非响应者对响应者（对照）之 间的统计上显著的差异性通过使用不成对学生双尾t检验来确定。P〈0. 05的值被认为是统 计上显著的。使用与用于图形输出的JavaTreeView组合的Cluster进行图心分析。
[0272] 表达miR-484和miR-296的卵巢癌细胞系的产生
[0273] 使用System Biosciences (SBI, USA)miR前体构建体（其包含特异性miR和 copEGFP荧光标志物的双重表达）在293FT细胞系（Invitrogen)中产生表达miR-484的慢 病毒，用于简单鉴定和监控对于转染和转导是阳性的细胞。
[0274] 卵巢癌细胞系的生长和对卡钼+泰素治疗的易感性的体内分析
[0275] 将两个方法用于评价miR-484表达对体内化学敏感性的作用：1)注射MDAH-2774 细胞混杂-miR (右肋腹）或miR-484 (左肋腹）和SK0V-3混杂-miR (右肋腹）或miR-484 (左 肋腹），通过每周腹膜内施用卡钼（15mg/kg) +泰素（5mg/kg)2次，持续3周来进行处理。通 过测径器测量和/或通过使用Ivis Lumina, Caliper Lifesciences的GFP可视化来追踪肿 瘤生长。2)与卡钼（15mg/kg) +泰素（5mg/kg)腹膜内处理结合的表达混杂miR(右肋腹） 或miR484(左肋腹）的慢病毒的直接瘤内递送。
[0276] RNA提取方法
[0277] 按照制造商的方案，使用 High Pure FFPE RNA Micro 试剂盒（Roche Applied Science Mannheim Germany)从石錯包埋的组织（FFPE)中分离用于低密度阵列分析的总 RNA。在提取后，使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc. ,USA)定量总 RNA。
[0278] 使用 TaQMan? Array Human MicroRNA Set Cards ν2· 0 进行的 MicroRNA 表达 特征分析
[0279] 使用 TaqMan? Array Human MicroRNA Set ν2· 0 (预先构造的 2 个微流体卡组， A和B，包含特异于人microRNA的676个独特测定）对训练组进行MiR表达特征分析。此 夕卜，每一个阵列包含4个对照测定，3个选择的候选内源对照测定和一个阴性对照测定。该 阵列组需要使用Megaplex? RT引物、Human Pool Set ν2·0来进行microRNA反转录。将 所有样品的浓度调整至最低限样品（15ng/ul)。为了增加灵敏度，在实时PCR之前，包括使 用Megaplex? PreAmp引物、Human Pool Set v2. 0的任选的预扩增步骤。
[0280] miR反转录
[0281] 对于 miRNA 的 cDNA 合成，使用与用于 TaqMan Array Human A 和 B 卡（Applied Biosystems)的莖-环 Megaplex? Primer Pools 组合的 miRNA 反转录试剂盒（Applied Biosystems)反转录RNA，从而允许同时反转录676个miRNA和内源对照。简而言之，分别地 对于每一个卡A和B，在7· 5μ 1的总反应体积中用Megaplex RT引物（IOx)、dNTP (IOOmM)、 MultiScribe 逆转录酶（50U/μ 1)、RT 缓冲液（IOx)、MgCl2(25mM)和 RNA 酶抑制剂（20U/ul) 补充3ul的总RNA(45ng/ul)。在冰上温育5分钟后，使用下列RT方案：40个循环的（16°C， 2min ;42°C，1分钟；和50°C，Is)，随后在85°C进行最终的逆转录酶灭活5min。
[0282] cDNA的预扩增
[0283] 对于每一个卡 A 和 B，在 25 μ I PreAmp 反应中，使用 Applied Biosystems'TaqMan PreAmp 预混合物（IOx)和Megaplex PreAmp 引物（IOx)预扩增Megaplex RT产物（2· 5 μ 1)。 预扩增循环条件如下：在95°C进行lOmin，在55°C进行2min，和在72°C进行2min，随后进行 12 个循环的（95°C，15s;和 60°C，4min)。
[0284] 实时 qPCR.
[0285] 对于每一个卡A和B，用75 μ 1的0. Ix TE pH8. O稀释25ul PreAmp反应。对于每 一个卡，在900 μ 1的总体积中制备PCR扩增反应物，其包含450 μ 1的TaqMan2x通用PCR预 混合物、w/o UNG(Applied Biosystems)、441 μ 1的不含核酸酶的水和9 μ 1稀释的PreAmp 产物。将100 μ 1的PCR反应混合物分别加载至卡A和B的每一个端口。在专门的容器中 离心卡A和Β。以1200rpm进行2次1分钟的旋转离心。密封阵列A和Β，将其分别装载 在ABI Prism7900HT序列检测系统（Applied Biosystems)上。循环条件如下：在50°C进 行2min，在94. 5°C进行10分钟，随后进行40个循环的（在97°C进行30s和在59. 7°C进行 Imin)。在 ABI Prism7900HT 序列检测系统（Applied Biosystems)上进行所有 PCR 反应。 使用SDS软件V. 2. 1，使用自动化基线设置和0. 2的阈值计算原始Ct值。
[0286] TaqMail? Array Human MicroRNA Set Cards v2. 0 数据验证
[0287] 使用TaqMan MicroRNA测定对验证组进行差异表达的miR的确认。将单管TaqMan MicroRNA测定用于在Applied Biosystems实时PCR仪上检测和定量成熟microRNA。所有 试剂、引物和探针获自 Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA)。利用 RNU44和RNU48进行标准化。按照制造商的说明书进行反转录反应和实时PCR。在GeneAmp PCR9700热循环仪（Applied Biosystems)中运行所有RT反应，包括无模板对照和RT负对 照。使用ABI Prism7900HT序列检测系统（Applied Biosystems)定量基因表达水平。以 一式三份进行比较实时PCR，包括无模板对照。使用比较Ct法计算相对表达。
[0288] 用于细胞和CM中的成熟miRNA的实时PCR
[0289] 利用Trizol (Invitrogen)从细胞分离总RNA和按照用于液体样品的制造商说 明书利用High Pure miRNA Isolation试剂盒（Roche)分离总RNA。通过单管TaqMan MicroRNA测定评估成熟miR。将细胞中的miR表达针对RNU44和RNU48标准化。所有逆 转录酶（RT)反应，包括无模板对照和RT负对照在GeneAmp PCR9600热循环仪（Applied Biosystems)中运行。
[0290] 除非另外指出，否则以一式三份测试每一个样品。从培养基样品分离MicroRNA。 在DNA酶处理（Ambion)后，利用NanoDrop(Thermo Scientific)测定RNA浓度。在血清中， 将样品针对U6snRNA (Applied Biosystems)进行标准化，如所显示的。由于U6是不一致的， 因此将靶miRNA的表达水平直接针对总RNA (本发明人先前在miR-296-5p和miR-484不存 在的情况下在非条件化培养基中测定的）进行标准化。
[0291] miRNA的过表达和Western印迹
[0292] 对于 miR-296 和 miR-484 的过表达，使用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)将 IOOnM 的 pre-miR-296、pre-miR-484 和 pre-阴性对照-2 (Ambion)转染入 HEK293 和 HUVE 细胞。24hr后，收集细胞，将其在含有蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostic)的RIPA缓 冲液中进行裂解。使用Bradford蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad)测量总细胞裂解物 的蛋白质浓度，将35 μ g的细胞裂解物在SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad)上进行分离，随后转移 至硝酸纤维素，随后利用ECL检测试剂（Denville Scientific)进行可视化。使用下列一抗： 小鼠单克隆抗-Hgs (1:1000, Enzo Life Science)、兔多克隆抗-VEGF 受体 2 (1:1000, Cell Signaling Technology)、小鼠单克隆抗-VEGF-B (1:200, Santa Cruz Biotechnology)、小 鼠单克隆抗-a-微管蛋白（I :2000, Sigma)。
[0293] 萤光素酶miRNA靶受体测定
[0294] 使用下列引物PCR扩增人HGS和VEGFB基因的3' UTR :
[0295] HGS Fw5' -GCT CTA GAC CCA GGC CAT GCT CAC GTC CGG AGT MC ACT AC-3'（SEQ ID NO :1)和
[0296] HGS Rw5'-GCT CTA GAG AAA TAC ATT TTA TTA TCG CTG TAC CAT TCT GGG G-3'（SEQ ID NO :2);
[0297] VEGFB Fw5'-TCT AGA GTG CCG GAA GCT GCG AAG GTG-3'（SEQ ID NO :3)和
[0298] VEGFB Rw5'-TCT AGA CAG GGT TGG GGG TCA CAG TTC-3'（SEQ ID NO :4)
[0299] 并通过使用紧在萤火虫萤光素酶的终止密码子下游的Xbal位点将其插入pGL3对 照载体（Promega)，从而产生p3' UTR-HGS和p3' UTR-VEGFB质粒。使用QuikChange定点诱 变试剂盒（Stratagene, San Diego, CA),将这些构建体用于产生p3'-UTRmut-HGS,引物：
[0300] Fw ：5'-CAC AAT GAC ACC TCC CCG AGC CTC TGC AGG GGC CTC TCT CGG CAG CCA CA-3'（SEQ ID NO :5);
[0301] Rw ： 5'-GCT CGG GGA GGT GTC ATT GTG ACA CCA CAG CCA GCT CAC AGT GCG GCC AG-3'（SEQ ID NO :6)，和
[0302] p3' -UTRmut-VEGFB 质粒，引物：
[0303] Fw : 5'-AGT GGG GGA ACA AAG AGG TAA AAA ACA GCC AAG C-3'（SEQ ID NO : 7);
[0304] Rw : 5'-GCT TGG CTG TTT TTT ACC TCT TTG TTC CCC CAC T-3'（SEQ ID NO :8)。
[0305] 通过使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)，利用 1 μ g 的 p3'UTR-HGS 或 p3' UTR-VEGFB 和利用 p3' UTRmut-HGS 或 p3' UTRmut-VEGFB 质粒以及 0. 1 μ g 的海肾萤光素 酶表达构建体pRL-TK (Promega)和IOOnM miRNA或对照前体转染HEK293细胞。在转染后 24h收集细胞，按照制造商的说明书，利用Dual Luciferase测定（Promega)进行测定。以 一式三份进行3个独立的实验。
[0306] 血管密度的免疫组织化学和评估
[0307] 切取肿瘤切片（2 μ m厚），用于福尔马林固定和石蜡包埋，包埋样品的脱蜡通过梯 度乙醇来实现。按照制造商的说明书使用抗⑶34-抗。使用Chalkley目镜法评估血管密度 (⑶34+)。由两个观察者在共聚焦显微镜下以低放大率扫描整个切片。鉴定了 3个具有最高 血管密度的区域（血管热点（hot-spot))。在高放大倍数（x400)下，将25-点Chalkley-目 镜计数线用于每一个热点，并进行定向以允许最大数目的点命中在血管上或血管内。3次计 数的平均值代表肿瘤的血管密度。
[0308] 表达miR-484的卵巢癌细胞系的产生
[0309] 通过磷酸I丐转染，在293FT细胞系（Invitrogen)中产生表达miR-484的慢病 毒。为此目的，使用System Biosciences(SBI，USA)miR前体构建体（其包含特异性miR和 copGFP荧光标志物的双重表达），以简单鉴定和监控对于转染和转染是阳性的细胞。转染 后72小时收集包含病毒的条件培养基，将其用于转导上皮卵巢癌细胞系（EOC)。特别地，用 表达单独的GFP的病毒（在下文中称为空载体）或表达GFP和miR-484的前体的病毒转导 SK0V-3和MDAH-2774,随后监控它们的荧光表达。
[0310] 表达miR-484的卵巢癌细胞系对卡钼+泰素处理的体外易感性
[0311] 为 了测定 EOC 细胞系的 IC5。，将 MDAH2774、SK0V-3、T0V21G、T0V112D、0VCAR8 和 IGROV以1000个细胞/孔的密度涂板在96孔板（以一式六份）中，24小时后，在无血清培 养基中用递增剂量的卡钼（CBDCA)(范围从l-150mg/ml)或泰素（TAX)(范围从1-200ηΜ)处 理6小时。在除去药物后，将细胞在PBS中洗涤，并在血清存在的情况下温育另外4天。按 照制造商的说明书使用MTS测定（SIGMA)评估细胞活力。报导的IC 5tl值代表至少3个独立 实验的平均值。为了评估miR-484对体外药物敏感性的作用，将表达亲代，混杂和miR-484 的细胞涂板在96孔板（1000个细胞/孔）中，用指定剂量的CBDCA和TAX进行处理。如上 所述，在4天后评价活力。
[0312] 对用从表达miR-484的卵巢癌细胞系收集的条件培养基刺激的HUVEC细胞的管形 成测定
[0313] 用125ml的基质胶（BD，非生长因子减少8-10ug/ul)填充48孔板的孔，让其在 37°C固化1小时。随后将重悬浮于200ml培养基中的HUVEC细胞（ATCC，IxlO 5)平铺在基 质胶层上，随时间过去监控管样结构的形成。时间推移视频显微镜（Leica)用于产生该过 程的影片，每5分钟收集图像，直至20小时。用于重悬浮内皮细胞的培养基为：1_用于内 皮细胞的完全培养基，用作阳性对照；2-低血清培养基（2% )，用作阴性对照；3-来自用混 杂-miR或miR-484转导的SK0V-7或MDAH-2774的条件培养基（+2%血清）。
[0314] 表达miR-484的卵巢癌细胞系的生长和对卡钼+泰素处理的易感性的体内分析.
[0315] 用IOOul包含I. 5xl06个MDAH-2774细胞混杂-miR(右肋腹）或miR-484(左肋 腹）的PBS在两个背侧面皮下注射无胸腺雌性裸小鼠（8只/组）。
[0316] 用SK0V-3进行相同的实验，除了注射2.2xl06个细胞外。当肿瘤块变得可见时， 开始利用CBDCA(15mg/kg)和Tax(5mg/kg)进行处理。递送在200ul PBS中稀释的药物， 每周腹膜内注射2次，进行4周。每周利用测径器测量肿瘤块2次，进行4周。此外，使小 鼠麻醉，通过探测使用的卵巢癌细胞表达的GFP荧光标志物，利用Ivis Lumina，Caliper Lifesciences对肿瘤块成像，每周一次，进行4周。随后杀死小鼠，切取肿瘤块，将其包含在 OCT中以待进一步分析。
[0317] 结果
[0318] 浆液性卵巢癌中与化疗抗性相关的miR表达.
[0319] 为了确定miR是否可用于预测浆液性卵巢癌（EOC)的化疗抗性，分析676个miR的 表达。如图IA中显示的，鉴定了能够区分4个不同组的具有23个差异表达的miR的响应特 征。图心的聚类分析（图1B)显示，EOC样品可分类为两个主要种类：一种为完全和部分响 应者，进一步标记为响应者；另一种为稳定的和进行性疾病，标记为非响应者。这两个种类 用于进一步细化响应特征和定义12个miRNA (图1C)。同样地，将来自第二患者组群的112 个EOC样品用于验证响应miRNA(图1D)。在12个初始鉴定的miR中，3个miR显示在非响 应者肿瘤中被下调：miR-484 (P-值=0.0007)、miR-642(p-值=0.041)和 miR-217(p-值 =0· 046)。
[0320] miR-484表达不改变对卡钼和泰素的体外敏感性
[0321] 在6个不同的上皮卵巢癌细胞系中评价miR-484表达水平（图6A-6B)。尽管用递 增浓度的卡钼（CBDCA)和泰素（Tax)处理细胞2或4小时，但它们的IC 5tl与miR-484的内 源水平无关，如4天后通过MTS测定评价的。此外，miR-484在MDAH-2274和SK-0V3细胞 系中的过表达未显著地影响它们对CBDCA和Tax的体外敏感性（图6C和6D)。
[0322] miR-484在化疗抗性的获得中的作用
[0323] 由于484的水平在细胞系之间非常相似，因此，将过表达对照-miR(混杂）或 miR-484的MDAH-2774和SK-0V3细胞用于在体内概述非响应者表型和确定miR是否以背 景依赖性方式影响卵巢癌的化学敏感性。使用还编码EGFP-蛋白的慢病毒载体以跟踪体 内肿瘤生长。将细胞（1.5xl0 6)皮下接种在裸小鼠的左（miR-484-MDAH-2774)和右肋腹 (EGFP-MDAH-2774)中，并使其生长15天。在该时间点上，在6/8的小鼠中，由表达miR-484 的细胞形成的肿瘤体积大于在表达对照EGFP的细胞中观察到的肿瘤体积，这表明原发性 肿瘤的生长未受miR表达影响（图2A)。
[0324] 在CBDCA和Tax治疗后，1只小鼠无响应，并且被排除在研究之外。其它7只 小鼠的分析显示，对照肿瘤在治疗结束时相对于第〇天它们的尺寸增加约6倍（范围为 2. 3-17. 7)。在相同小鼠中，表达miR-484的肿瘤仅增加1.3倍（范围为0.8-1. 8)，显示对 药物敏感得多（与对照相比）（图2A)。
[0325] 通过使用能够检测EGFP荧光的体内成像系统，SK-0V3细胞的分析确认，miR-484 的表达不影响原发性肿瘤的生长但显著增加对治疗的敏感性（图2B和2C)。
[0326] 在裸小鼠中比SK0V-3生长更快的MDAH-2774细胞用于检查miR的体内施用是否 可改变EOC对CBDCA+Tax治疗的敏感性。使亲代MDAH-2774细胞在裸小鼠的肋腹生长2周， 随后用表达EGFP-对照miR的慢病毒在右肋腹以及用表达EGFP-miR-484的慢病毒在左肋 腹注射小鼠。两天后，利用CBDCA+Tax每周2次处理小鼠（进行3周），并且1周后重复病 毒的瘤内注射。21天后，评价肿瘤生长。令人惊讶地，在6/6案例中，miR-484增加对药物的 敏感性，这表明，其表达能够在体内调节上皮卵巢癌的对⑶BCA和Tax的抗性（图2A-2D)。
[0327] miR-484调控血管生成因子的表达。
[0328] miR-484参与血管生成因子的调控。miR-484靶向能够直接刺激内皮细胞生长和 迁移的血管内皮生长因子B(VEGFB)以及牵涉正常和病理血管内皮细胞生物学的所有方面 的血管内皮生长因子2 (VEGFR2/KDR)。萤光素酶和western印迹分析确认，miR-484调节 VEGFB和VEGFR2的内源水平（图3A-3C)。
[0329] 使用抗-CD34抗体评估30例人浆液性卵巢癌（15个响应者/15个非响应者）和 28例小鼠异种移植物肿瘤[14个来自Sk-0v3,并且14个来自MDAH-2774 (7个用miR-484转 导，和7个用GFP转导）]的血管密度，并且通过Chalkley目镜法进行评价。在人肿瘤中，平 均微血管密度为30±1. 17(范围为9-54)(对于响应者）和68±1.6(范围为15-114)(对于 非响应者）（P = 〇.〇〇〇〇〇〇2);在小鼠中，其为9±5. 5(范围为1-18)(对于SK-0V3-miR484)、 23±12(范围为 5-37)(对于 SK-0V3-EGFP) (p = 0· 0004)和 10±6· 2(范围为 4-22)(对 于 MDAH-2774-miR484)、17±8· 9(范围为 5-28)(对于 MDAH-2774-EGFP) (ρ = 0· 0009)(图 4A-4C)。
[0330] 斯皮尔曼等级相关检验显示，血管数目与miR表达之间具有强关联性（r = -0. 8, ρ =I. 56E-07)，这表明，这些肿瘤的敏感性归因于它们的微血管品质（asset)，其受miR调控 驱动（图4D)。
[0331] 为了确认mir-484-介导的血管品质的调节，通过Western印迹分析用miR-484或 scr-载体稳定转导的MDAH-2774或SK-0V3细胞系的VEGFB表达。将HUVEC细胞在获自转 染的细胞的条件培养基（CM)中培养。时间推移视频显微技术显示，当将HUVEC细胞在3D 基质胶上培养6小时时，来自scr-MDAH-2774或SK-0V3细胞的CM能够诱导管样结构的形 成。当使用来自过表达miR-484的MDAH-2774或SK-0V3的CM时，该作用被减弱，并且当将 细胞在CM存在的情况下培养20hr时，该作用被消除（图7)。
[0332] 总而言之，这些数据确认了，EOC细胞的miR-484表达能够影响内皮细胞形成血管 样结构和支持血管样结构形成的能力。然而，不希望受理论束缚，本发明人现于本文中相 信，VEGFB的miR-484调控在瘤细胞上是可能的，但为了调节VEGFR2, miR必须直接对肿瘤 相关内皮细胞施加其作用。
[0333] 为了确定由EOC产生的miR-484是否释放进入局部微环境，和随后进入其中其到 达其靶的内皮细胞，共培养HUVEC和过表达miR-484-EGFP或混杂miR-EGFP的卵巢癌细胞 来源的细胞系。miR-484-EGFP在MDAH-2774和SK-0V3中的稳定转染导致其表达相对于对 照增加至少2倍（图5A)。
[0334] miR-484在稳定地转染的卵巢癌细胞来源的细胞系的CM中增加（图5B)。在过表 达miR-484的细胞系存在的情况下培养的HUVEC细胞中，miR-484的水平相对于对照增加 0.2倍至5倍（图5C)。数据显示，卵巢癌来源的细胞系与HUVEC细胞之间的直接接触不是 必需的，因为共培养实验是通过将癌细胞涂板在孔中和将HUVEC涂板在transwell中（或 反之亦然，无显著差异）来进行的。这些数据共同地显示，miR-484由瘤细胞分泌至局部微 环境中，并在24小时内进入HUVEC细胞（图OT)。
[0335] 此外，当将HUVEC与过表达对照和miR-484的SK-0V3共培养24小时时，仅后者能 够显著减少VEGFR2在内皮细胞上的表达（图5E)。
[0336] 过表达miR-484的卵巢癌细胞较不能够刺激内皮细胞的体外再组织和在小鼠中 的新血管形成。VEGFRl和2的信号转导之间的协同作用是卵巢癌生长和药物敏感性所必需 的。
[0337] 实施例2
[0338] 响应者对难治性卵巢癌的miR表达特征。
[0339] 为了研究miR是否是预测卵巢癌化疗抗性，分析训练组的676个miR的表达。在卡 A的381个靶miR和卡B的295个靶miR中，分别有364个（96% )和240个（81% )在至 少一个样品中被扩增。在所有样品中仅17个来自卡A的祀和55个来自卡B的祀是未确定 的（Ct = 40)。如图9中所示，鉴定了能够区分R与NR浆液性癌的16个差异表达的miR。 在手术结果和/或肿瘤分级方面未发现统计上显著的miR(数据未显示）。随后在验证组中 验证差异表达的miR。在最初鉴定的16个miR中，有3个miR在两个组中差异表达，其中的 2个在R肿瘤中被下调（miR-296-5p和miR-518e)并且1个被上调（miR-484)(图9)。这 3个miR能够并足以区分这两个组。
[0340] miR-296和miR-484表达不改变对CBDCA和Tax的体外敏感性。
[0341] 为了确定miR在药物抗性发展中的作用，评价6个不同的上皮卵巢癌细胞系（EOC) 的miR-484和miR-296的表达水平。虽然miR-484在所有细胞系中可容易地被检测到，但 miR-296在MDAH-2774和T0V-112D中几乎不表达。尽管用递增浓度的CBDCA和Tax处理细 胞2或4小时，但它们的IC 5tl与miR-484或296的内源水平无关，如4天后通过MTS测定评 价的。此外，miR-484和296在MDAH-2274和SK0V-3细胞系中的过表达未显著影响它们对 CBDCA和Tax的体外敏感性。
[0342] miR-484在化疗抗性的获得中的作用
[0343] 由于miR-296以极低水平在EOC中表达，并且miR-484的水平在细胞系间是极其 相似的，因此将过表达对照-miR (混杂的）或miR-484的MDAH-2774和SK0V-3细胞用于概 括体内R表型和确定miR是否以背景依赖性方式影响卵巢癌的化学敏感性。使用还编码 EGFP-蛋白的慢病毒载体以在体内跟踪肿瘤生长。将细胞（1.5xl06)皮下接种至裸小鼠的 左肋腹（miR-484-MDAH-2774)和右肋腹（EGFP-MDAH-2774)，让其生长15天。在该时间点 上，在6/8的小鼠中，由表达miR-484的细胞形成的肿瘤体积大于在表达对照EGFP的细胞 中观察到的肿瘤体积，这表明原发性肿瘤的生长未受miR表达的影响。
[0344] 在CBDCA和Tax治疗后，1只小鼠无响应，并且被排除在研究之外。其它7只 小鼠的分析显示，对照肿瘤在治疗结束时相对于第〇天它们的尺寸增加约6倍（范围为 2. 3-17. 7)。在相同小鼠中，表达miR-484的肿瘤仅增加1.3倍（范围为0.8-1. 8)，显示对 药物敏感得多（与对照相比）。通过使用能够检测FEGP荧光的体内成像系统，SK-0V3细胞 的分析确认，miR-484的表达不影响原发性肿瘤的生长，但显著增加对治疗的敏感性。
[0345] 在裸小鼠中比SK0V-3生长更快的MDAH-2774细胞用于检查miR的体内施用是否 可改变EOC对CBDCA+Tax治疗的敏感性。使亲代MDAH-2774细胞在裸小鼠的肋腹生长2周， 随后用表达EGFP-对照miR的慢病毒在右肋腹以及用表达EGFP-miR-484的慢病毒在左肋 腹注射小鼠。两天后，利用CBDCA+Tax每周2次处理小鼠（进行3周），并且1周后重复病 毒的瘤内注射。21天后，评价肿瘤生长。令人惊讶地，在6/6案例中，miR-484增加对药物 的敏感性，这表明，其表达能够在体内调节上皮卵巢癌的对⑶BCA和Tax的抗性。
[0346] miR-484和miR-296调节血管生成因子的表达
[0347] miR-484(和在较低的程度上，miR-296)在体内但非在体内在EOC细胞的化学敏感 性方面具有作用，这表明它们作用于肿瘤微环境，而非以细胞自主方式起作用。两种miR都 参与血管生成因子的调节。萤光素酶和western印迹分析确认，miR-296和miR-484分别 调节HGS和VEGFB的内源水平（图10B-10E)。
[0348] 使用抗-⑶34抗体评估30例人浆液性卵巢癌（15个R/15个NR)和28例小鼠异 种移植物肿瘤[14个来自Skov-3,并且14个来自MDAH-2774 (7个用miR-484转导，和7个 用GFP转导）]的血管密度，并且通过Chalkley目镜法进行评价。在人肿瘤中，平均微血管 密度为30 (范围为9-54)(对于R)和68 (范围为15-114)(对于NR) (P = 〇.〇〇〇〇〇〇2);在小 鼠中，其为 9(范围为 1-18)(对于 SK0V-3-miR484)、23(范围为 5-37)(对于 SK0V-3-EGFP) (p = 0· 04)和 10(范围为 4-22)(对于 MDAH-2774-miR484)、17(范围为 5-28)(对于 MDAH-2774-EGFP) (p = 0. 01)(图11A-11C)，这表明，这些肿瘤的敏感性归因于它们的微 血管品质（asset),其受miR调控驱动。为了确认mir-484-介导的血管品质的调节，通 过Western印迹分析用miR-484或scr-载体稳定转导的MDAH-2774或SK0V-3细胞系的 VEGFB表达，其被下调（数据未显示）。将HUVEC细胞在获自转染的细胞的条件培养基（CM) 中培养。时间推移视频显微技术显示，当将HUVEC细胞在3D基质胶上培养6小时时，来自 scr-MDAH-2774或SK0V-3(数据未显示）细胞的CM能够诱导管样结构的形成。当使用来自 过表达miR-484的MDAH-2774或SK0V-3的CM时，该作用被减弱，并且当将细胞在CM存在 的情况下培养20hr时，该作用被消除。总而言之，这些数据确认了，EOC细胞的miR-484表 达能影响内皮细胞形成血管样结构和支持血管样结构形成的能力。
[0349] miR-484调节VEGFB的表达，并因此调节肿瘤微环境中分泌的配体的量，然而，调 节受体的水平的miR-296必须直接对肿瘤相关内皮细胞施加其作用。然而,不希望受理论 束缚，本发明人现于本文中相信，由EOC细胞产生的miR-296被释放进入局部微环境，尤其 是在药物治疗之后，并且随后进入其在其中靶向HGS的内皮细胞，从而最终调节VEGFR2信 号传导。为了确认这一点，将HUVEC和过表达miR-296-EGFP或混杂miR-EGFP的EOC细胞共 培养。miR-296-EGFP在不同EOC细胞中的稳定转染导致其表达相对于对照增加至少2倍。 在过表达miR-296的EOC细胞的CM中发现miR-296。在过表达miR296的EOC细胞存在的 情况下培养的HUVEC细胞中，miR296的水平相对于对照增加1倍至11倍。这些数据显示， EOC与HUVEC细胞之间的直接接触不是必需的，因为共培养实验是通过将EOC涂板在孔中和 将HUVEC涂板在transwell中（或反之亦然，无显著差异）来进行的。这些数据共同地显 示，miR-296由EOC细胞分泌至局部微环境中，并在24小时内进入HUVEC细胞。此外，当将 HUVEC与过表达对照和miR-296的EOC细胞在盖玻片上共培养24小时时，仅后者能够显著 增加 VEGFR2在内皮细胞上的表达。这在所有测试的细胞中一致地重现。
[0350] 实施例3
[0351] 试剂盒
[0352] 可将本文中描述的任何组合物包括在试剂盒中。在非限定性实例中，将用于分离 miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评价miRNA群体的试剂包括在试剂盒中。试剂盒还可包 括用于产生或合成miRNA探针的试剂。试剂盒从而可在适当的容器装置中包括，用于通过 掺入标记的核苷酸或未标记的核苷酸（随后对其进行标记）而标记miRNA的酶。其还可包 括一种或多种缓冲液，例如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液、用于制备 miRNA探针的化合物，和用于分离miRNA的组分。其它试剂盒可包括，用于制备包含与miRNA 互补的寡核苷酸的核酸阵列的组分，从而可包括例如固体载体。
[0353] 对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可存在包含与本文中描述的任一个miR的 全部或部分同一或互补的序列的核酸分子。
[0354] 可将试剂盒的组分包装在含水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常 包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置（可将组分置于其中，和优选 地适当地进行等分）。当试剂盒中存在超过一种组分（可将标记试剂和标记包装在一起） 时，试剂盒通常还包括可将另外的组分分开地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然 而，可将组分的不同组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于包含核酸的装置， 和经密封用于商业销售的任何其它试剂容器。此类容器可包括，将期望的小瓶保留在其中 的注射或吹模塑料容器。
[0355] 当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，且无 菌水溶液是一种优选溶液。可包含在试剂盒中的其它溶液是用于从混合样品分离和/或富 集miRNA的那些溶液。
[0356] 然而，可以以干粉形式提供试剂盒的组分。当试剂和/或组分以干粉形式提供时， 可通过添加适当的溶剂重建粉剂。预期还可在另一个容器装置中提供溶剂。试剂盒还可包 括，有助于分离标记的miRNA的组分。试剂盒还可包括,保持或维持miRNA或保护其免受降 解的组分。所述组分可以是不含RNA酶的或被保护免受RNA酶降解。
[0357] 此外，试剂盒通常还可在适当的装置中包括，用于每一种单独的试剂或溶液的不 同容器。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其它试剂的说 明书。说明书可包括可应用的变型。预期此类试剂是本发明试剂盒的实施方案。此外，试 剂盒不限于上文中列出的特定项目，并且可包括用于操作或表征miRNA的任何试剂。
[0358] 还预期，在miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案可更普遍地用于本发明的筛 选或特征分析方法或试剂盒中。换言之，描述可包括在特定阵列中的试剂的任何实施方案 可更普遍地在miRNA特征分析的背景中实施，而不必涉及阵列本身。
[0359] 还预期，任何试剂盒、阵列或其它检测技术或工具，或任何方法可用于表征这些 miRNA的任一种。此外，还预期，在miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案可在本发明的 方法中实施（利用或不利用阵列形式）；换言之，可按照本领域技术人员已知的任何技术， 在本发明的任何方法中筛选或评价miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式对于待进行的筛 选和诊断方法不是必需的。
[0360] 还涉及将miRNA阵列用于治疗、预后或诊断应用的试剂盒以及这样的用途。试剂 盒可包括miRNA阵列，以及关于阵列上miRNA的标准或标准化miRNA特征谱的信息。此外， 在某些实施方案中，还可将对照RNA或DNA包括在试剂盒中。对照RNA可以是可用作阳性 对照用于标记和/或阵列分析的miRNA。此外，样品可以是血液或组织。
[0361] 在一个实施方案中，用于表征卵巢癌的试剂盒包括用于miR-484、miR-642和/或 miR-217的至少一个检测探针。在某些实施方案中，试剂盒为寡核苷酸阵列的形式或包含寡 核苷酸阵列。
[0362] 本文中还提供了，用于诊断卵巢癌和/或预测卵巢癌的化疗抗性的试剂盒，其包 括：
[0363] a)包括用于测定miR-484的表达水平的成对的核苷酸引物和检测试剂的miR-484 定量试剂盒，
[0364] b)包括用于测定miR-642的表达水平的成对的核苷酸引物和检测试剂的miR-642 定量试剂盒，
[0365] c)包括用于测定miR-217的表达水平的成对的核苷酸引物和检测试剂的miR-217 定量试剂盒，和
[0366] d)可编程物体，其被提供用于输入miR-484、miR-642和miR-217的表达水平以进 行体外诊断卵巢癌的方法。
[0367] 本文还提供了在试剂盒中用作诊断生物标志物的miR-484、miR-642和/或 miR-217的用途。可使用捕获试剂检测患者的生物样品中这些诊断生物标志物的表达水平， 随后将其与健康受试者的相同生物标志物的参照值相比较。用于与检测的值相比较的参照 值可以是针对对于疾病是阳性的患者，对于疾病是阴性的患者或两者而确定的值。患者的 生物样品中所述生物标志物的至少一个、二个和/或全部的表达水平相对于参照值的变化 表明患者患有还是未患有疾病。
[0368] 捕获试剂可以是与诊断生物标志物特异性相互作用的任何有机或无机化学药品、 生物分子或其任何片段、同源物、类似物、缀合物或衍生物。在某些实施方案中，捕获试剂是 特异性检测诊断生物标志物小组中的诊断生物标志物的蛋白质或抗体。在其它实施方案 中，捕获试剂是结合生物标志物寡核苷酸RNA或DNA的寡核苷酸。在某些其它实施方案中， 可将捕获试剂偶联至固体载体。在某些实施方案中，来自患者的生物样品是组织、生物液 体，包括但不限于全血、血浆、血清、泪液、唾液、粘液、脑脊髓液或尿液。
[0369] 此外，在某些实施方案中，所述方法还可包括，检测患者的生物样品中的另外的生 物标志物的表达水平的步骤。如本文中所用，另外的生物标志物包括但不限于诊断小组中 现在已知的或以后发现的诊断生物标志物,和评价这些生物标志物的检测的表达水平相对 于参照值的变化，以将患者诊断为具有所述疾病。
[0370] 在某些实施方案中，试剂盒可包括捕获试剂，所述捕获试剂包含a)特异于至少一 个诊断生物标志物的一种或多种检测器,其中生物标志物为miR-484 ;b)检测试剂，和c)使 用试剂盒将患者诊断为具有卵巢癌（当患者的测试样品中至少miR-484诊断生物标志物的 表达水平低于无卵巢癌对照受试者的相同生物标志物的表达水平时）的说明书。
[0371] 试剂盒还可包括，可将患者的生物样品与其比较的适当的阳性和阴性对照。试剂 盒还可包括，针对对于所述疾病是阳性的疾病患者，对于所述疾病是阴性的患者或两者的 表达而确定的参照值的范围。
[0372] 在某些实施方案中，本发明提供了确定至少可能响应于化疗干预和/或具有来自 疾病的不利结果的卵巢癌患者的诊断方法、试剂盒和装置。将来自患者身体的样品经历检 测至少一个或多个与卵巢癌相关的生物标志物的测定。每一个生物标志物具有常规可测定 的截止点，其通过手工或计算机辅助测定区分卵巢癌与对照。
[0373] 在具体实施方案中，生物标志物结果的组合极大地增加了诊断的准确性。
[0374] 已在本文中广泛地和一般性地描述了本发明的方法和试剂盒。落在一般性公开内 容内的每一个更窄范围和下位分类也形成本发明的一部分。这还包括，具有从一般性内容 中除去任何主题的前提或排除性限制的本发明的一般性描述，无论除去的内容在本文中是 否被明确地提及。
[0375] 实施例4
[0376] 阵列的制备和筛选
[0377] 本文中还提供了，miRNA阵列的制备和用途，所述阵列是核酸分子（探针）的有序 的巨阵列（macroarray)或微阵列，所述核酸分子与多个miRNA分子或前体miRNA分子完 全或几乎完全互补或同一，并且被以空间上分离的组织方式置于载体材料上。巨阵列通常 是已将探针点印在其上的数张硝酸纤维素或尼龙。微阵列更密集地放置核酸探针，从而可 将多达10, 000个核酸分子安放在通常1至4平方厘米的区域中。微阵列可通过将核酸分 子例如基因、寡核苷酸等点印在基质上或在基质上原位制造寡核苷酸序列来制造。点印的 或制造的核酸分子可以以多达每平方厘米约30个或更高，例如多达每平方厘米约100或甚 至1000个非同一核酸分子的高密度基质模式应用。微阵列通常使用涂覆的玻璃作为固体 载体，与过滤阵列的基于硝酸纤维素的材料不同。通过使用miRNA-互补核酸样品的有序阵 列，可跟踪每一个样品的位置并使其与原始样品相联系。其中将多种独特的核酸探针稳定 地与固体载体的表面结合的多种不同的阵列装置对于本领域技术人员来说是已知的。用 于阵列的有用基质包括尼龙、玻璃和硅。阵列可以以许多不同的方式变化，包括平均探针长 度、探针的序列或类型、探针与阵列表面之间的键的性质（例如共价或非共价的）等等。本 文中描述的标记和筛选方法以及阵列在其实用性上不限于任何参数，除了探针检测miRNA 以外；因此，可将方法和组合物与多种不同类型的miRNA阵列一起使用。在某些实施方案 中，miR基因产物包括一种或多种本文中描述的miR。
[0378] 微阵列
[0379] 微阵列可包括获自已知的或预测的miRNA序列的寡核苷酸探针。针对每一个 miRNA，阵列可包含不同的寡核苷酸探针，例如一个包含有活性的成熟序列，另一个特异于 miRNA的前体。阵列还可包含对照，例如与人直系同源物相异仅在于数个碱基的一个或多个 序列，其可用作杂交严格度条件的对照。还可以包括病毒miRNA或从生物信息学工具预测 的推定的miRNA。此外，其还可以在微阵列上包括，用于非特异性杂交的适当的对照。
[0380] 在某些实施方案中，使用固相核酸生物芯片阵列（特别是微阵列）进行核酸杂交， 或原位杂交，或其中核酸扩增法是实时PCR(RT-PCR)或定量实时PCR (qRT-PCR)。
[0381] 在某些实施方案中，试剂盒包括固相核酸生物芯片阵列，特别是微阵列，或用于 miRNA测定的一组珠粒。
[0382] 在某些实施方案中，试剂盒包括用于进行基于杂交和任选地扩增例如PCR、RT-PCR 或qRT-PCR的核酸检测的装置。
[0383] 本文中还描述了用于诊断癌症的成组的寡核苷酸或多核苷酸，其包含至少2个， 优选至少3、5、10个或全部的指定的miRNA的序列和/或此类序列的互补序列。
[0384] 方法
[0385] 本文中还描述了，用于评估与患者的癌症相关的临床状况的方法。在一个实施方 案中，用于体外诊断卵巢癌的方法包括：
[0386] a)获得受试者的样品；
[0387] b)测定作为卵巢癌生物标志物的一个或多个miRNA和内部对照RNA的表达水平；
[0388] c)计算作为卵巢癌生物标志物的一个或多个miRNA的相对表达水平；
[0389] d)通过使用一个或多个变量计算预测模型，其中所述变量包括作为卵巢生物标志 物的一个或多个miRNA的相对表达水平和任选地卵巢癌的一个或多个风险因子；和，
[0390] e)利用预测模型计算疾病风险概率，其中如果疾病风险概率大于0. 5,则受试者 被诊断为患有卵巢癌。
[0391] 在某些实施方案中，在用于体外诊断卵巢癌的方法中，作为卵巢癌生物标志物的 一个或多个miRNA获自用于选择用作疾病诊断生物标志物的miRNA的方法，其包括：
[0392] a)获得受试者的样品，其中所述受试者包含患有所述疾病的人和未患所述疾病的 人；
[0393] b)测定候选miRNA和内部对照RNA在所述样品中的表达水平；
[0394] c)计算候选miRNA的相对表达水平；
[0395] d)利用一个或多个变量计算预测模型，其中所述变量包括一个或多个候选miRNA 的相对表达水平和任选地所述疾病的一个或多个风险因子；和
[0396] e)利用预测模型计算疾病风险概率、敏感性和特异性，其中具有最高敏感性和最 高特异性的一个或多个候选miRNA被选择为所述疾病的诊断生物标志物。在某些实施方案 中，风险因子是卵巢癌的风险因子。在某些实施方案中，一个或多个miRNA选自miR-484、 miR-642 和 miRNA-217。
[0397] 在某些实施方案中，一个或多个miRNA用作参照参数，用于评价卵巢癌治疗的效 果和筛选抗卵巢癌的药物。
[0398] 在某些实施方案中，miR-484在卵巢癌患者与正常健康受试者之间具有显著不同 的表达水平。
[0399] 在某些实施方案中，通过定量实时RT-PCR测定一种或多种miRNA和内部对照RNA 的表达水平，并将其表达为循环阈值（Ct)。
[0400] 根据专利法规的条款，本发明的运行原理和模式已在其优选实施方案中进行了解 释和举例说明。然而，必须理解，除了明确解释和举例说明的之外，可以以其他方式实施本 发明而不背离其精神或范围。
[0401] 本文中对任何文献的引用不意味着承认，任何此类文献是相关现有技术水平。关 于日期的所有记载或关于这些文献内容的陈述基于 申请人:可获得的信息，并且不构成对这 些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
[0402] 虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各 种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来 使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本 文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范 围内的所有实施方案。
【权利要求】
1. 一种诊断受试者中的对化疗干预具有抗性的卵巢癌的方法，包括： a) 鉴定与对照表达水平相比，受试者的样品中miR-484、miR-642和/或miR-217的表 达水平，和 b) 如果相较于对照表达水平，所述受试者具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表达水平，则诊断所述受试者具有化疗抗性卵巢癌，或 c) 如果相较于对照表达水平，所述受试者不具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表达水平，则诊断所述受试者不具有化疗抗性卵巢癌。
2. 权利要求1的方法，其中步骤a)还包括，鉴定与对照表达水平相比，miR-592、 miR-302d、miR-491、miR-483-5p、miR-653、miR-181a、miR-671-3p、miR-19a 和 / 或 miR-744 的表达水平。
3. 权利要求1的方法，其中步骤a)还包括，鉴定与对照表达水平相比，miR-296-5p和 /或miR-518e的表达水平。
4. 权利要求1的方法，其包括鉴定miR-484、miR-642和miR-217的表达水平。
5. 权利要求1的方法，其中所述化疗干预包括下列的一种或多种：钼类药物、卡钼 (ParapIat in?)、顺钼（Platinol?)、紫杉烧、紫杉酚（Taxo 1?)、多西紫杉醇 (Taxotere?)、S西他滨（Gemzar?)、多柔比星（Adriamycin?、Doxi 1?)、 依托泊苷（Vepesid?)、长春瑞滨（Navelbine?)、伊沙匹隆（Ixempra?)、 6口：11：1161〇116药物、贝伐单抗（入乂&81；11]^)和/或苯妥帝尔。
6. 权利要求1的方法，其中步骤（a)包括： 1) 反转录样品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸； 2) 将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特异性探 针寡核苷酸的微阵列杂交以提供所述测试样品的杂交特征谱；和 3) 将步骤（2)的特征谱与对照相比较。
7. 权利要求6的方法，其中步骤3)包括，将所述样品杂交特征谱与从对照样品产生的 杂交特征谱相比较。
8. 权利要求6的方法，其中步骤3)包括，将所述样品杂交特征谱与和非癌样品相关的 miR水平的数据库、统计资料或表格相比较。
9. 权利要求1的方法，其中所述卵巢癌是浆液性上皮卵巢癌。
10. 权利要求1的方法，其中相较于对照，降低的miR-484表达确认化疗抗性卵巢癌的 诊断。
11. 一种确定人受试者是否具有卵巢癌的不良存活预后的方法，包括： a) 测量所述人受试者的卵巢组织样品中的特征miR基因产物的表达水平，所述特征 miR基因产物由miR基因产物：miR-484、miR-642和/或miR-217组成；和 b) 当相较于无癌卵巢组织的对照样品中的miR基因产物的对应表达水平，所述样品的 一个或多个所述miR基因产物的表达水平的降低表明人受试者具有卵巢癌的不良存活预 后时，确定所述人受试者的不良存活预后。
12. 权利要求12的方法，其中步骤（a)包括： 1) 反转录所述样品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供一组靶寡脱氧核苷 酸； 2) 将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特异性探 针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供所述测试样品的杂交特征谱；和 3) 将步骤（2)的特征谱与对照相比较。
13. 权利要求11的方法，其中确定所述受试者的存活预后的步骤（b)区分浆液性卵巢 癌与其它卵巢癌。
14. 权利要求11的方法，其中确定所述受试者的存活预后的步骤（b)预测对化疗干预 的响应。
15. 权利要求11的方法，其中所述miR-484、miR-642和/或miR-217分别与特异于 miR-484、miR-642和/或miR-217的一个或多个探针杂交，并且相对于对照样品，miR-484、 miR-642和/或miR-217的表达水平的下降的存在表明，对化疗干预的不良响应，人患者的 不良存活预后和/或浆液性卵巢癌的存在。
16. 用于确定受试者的化疗抗性卵巢癌的方法，所述方法包括： a) 检测来自所述受试者的样品的miRNA表达特征谱， b) 将所述样品的miRNA特征谱与包含非癌性卵巢细胞的对照样品的miRNA表达特征谱 相比较，和 c) 当所述样品的miRNA表达特征谱包括hsa-miR-484、hsa-miR-642和/或 hsa-miR-217中的一个或多个的表达水平的统计上显著的变化时，确定化疗抗性卵巢癌。
17. 权利要求16的方法，其中步骤（c)的统计上显著的变化是miR-484的表达水平的 降低。
18. 权利要求16的方法，其中所述卵巢癌包括浆液性上皮卵巢癌。
19. 权利要求16的方法，其中所述microRNA表达特征谱包括至少：hsa-miR-484、 hsa-miR-642 和 hsa-miR-217。
20. -种用于评估患者的临床状况的方法，包括步骤： a) 提供来自所述患者的生物样品， b) 测定所述样品中预先确定的特征miRNA的表达水平以获得miRNA表达特征谱，所述 预先确定的特征 miRNA 包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217， c) 将步骤（b)的表达水平与包括卵巢癌的不同疾病特有的一个或多个参照miRNA表达 特征谱相比较，和 d) 基于步骤（c)的比较评估所述患者的临床状况。
21. 权利要求20的方法，其中步骤（c)中的参照miRNA表达特征谱获自数据库，所述数 据库发现于下列中的一个或多个：国际互联网数据库、集中式数据库或分布式数据库。
22. 权利要求20的方法，其中步骤（b)中的测定包括，预先确定的miRNA的组的定性、 定量或半定量测定。
23. 权利要求20的方法，其中步骤（b)中的测定包括，核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延 伸、测序、质谱法或其任何组合。
24. -种用于评估患者的临床状况的试剂盒，其包括： a)用于测定来自患者的生物样品中预先确定的特征miRNA的一个或多个生物标志物， 所述预先确定的特征miRNA包括hsa-miR-484、hsa_miR-642和/或hsaniR-217中的至少 一个，和 b)包括卵巢癌的不同疾病特有的多个miRNA参照表达特征谱。
25. 权利要求24的试剂盒，其中在数据库例如国际互联网数据库、集中式数据库或分 布式数据库中获得miRNA参照表达特征谱。
26. -种用于诊断患者的卵巢癌的试剂盒，其包括： a) 包括一个或多个检测器的捕获试剂，所述检测器特异于至少一个卵巢癌诊断生物标 志物，其中至少第一卵巢癌生物标志物为miR-484生物标志物， b) 检测试剂，和 c) 使用试剂盒诊断患者的说明书，当来自所述患者的生物样品中miR-484诊断生物标 志物的表达水平低于不具有卵巢癌的对照受试者中相同生物标志物的表达水平时，将患者 诊断为具有卵巢癌。
27. 权利要求26的试剂盒，还包括一个或多个选自miR-642和miR-217生物标志物的 另外的卵巢癌诊断生物标志物。
28. 权利要求26的试剂盒，还包括一个或多个选自下列的另外的卵巢癌诊断生物标志 物：hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、hsa-miR-491、 hsa-miR-483_5p、hsaniR-653、hsa_miR-181a、hsa-miR-671_3p、hsa_miR-19a 和 / 或 hsa_miR-744〇
29. 用于诊断卵巢癌的一组寡核苷酸或多核苷酸，其包含选自下列的一组miRNA的序 列：miR-484、miR-642和miR-217,和/或其互补序列。
30. -种用于诊断患者的卵巢癌的方法，其包括： a) 检测来自所述患者的生物样品中至少一个诊断生物标志物的表达水平，其中至少第 一诊断生物标志物是miR-484生物标志物，和 b) 当所述患者样品的至少mir-484诊断生物标志物的表达水平低于源于不具有卵巢 癌的对照受试者的生物样品的相同生物标志物的正常表达水平时，将所述患者诊断为患有 卵巢癌。
31. 权利要求30的方法，还包括检测选自miR-642和miR-217生物标志物的一个或多 个另外的卵巢癌诊断生物标志物的表达水平。
32. 权利要求30的方法，还包括检测选自下列的一个或多个另外的卵巢癌诊断生物标 志物的表达水平：hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、 hsa-miR-491、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-653、hsa_miR-181a、hsa-miR-671_3p、 hsa_miR-19a 和 / 或 hsa_miR-744〇
33. 权利要求31的方法，其包括步骤： a) 获得所述样品，其中所述样品包含卵巢细胞； b) 从所述样品扩增miRNA表达特征谱中的至少一个miRNA ; d) 测定所述样品的miRNA表达特征谱；和 e) 将所述样品的miRNA表达特征谱与包括miR-484、miR-642和/或miR-271的对照 miRNA特征相比较， 其中所述对照miRNA特征在所述样品的miRNA表达特征谱中的重现表明，所述样品包 含对化疗性治疗具有抗性的卵巢癌细胞。
【文档编号】C12Q1/68GK104364390SQ201280058623
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2012年10月15日 优先权日:2011年10月14日
【发明者】C·M·克罗斯, A·维克驰欧尼 申请人:俄亥俄州立大学