用于治疗和诊断卵巢癌的组合物和方法

专利名称：用于治疗和诊断卵巢癌的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及卵巢癌疗法。更具体地说，本发明涉及包括卵巢癌蛋白质的至少一部分的多肽类并涉及编码这类多肽的多核苷酸以及特异性识别这类多肽的抗体和免疫系统细胞。可以将这类多肽、多核苷酸、抗体和细胞用于治疗卵巢癌的疫苗和药物组合物中。
背景技术：
卵巢癌在美国和全世界范围内是危害妇女健康的一个显著问题。尽管在检测和治疗这种癌症方面已经取得了发展，但是目前尚未获得用于预防或治疗的疫苗或其它普遍成功的方法。控制这种疾病目前依赖于将早期诊断与攻击性治疗结合起来的方法，所述的攻击性治疗包括诸如外科手术、放疗、化疗和激素疗法这样各种疗法中的一种或多种。通常以包括分析特异性肿瘤标记在内的各种预后参数为基础来选择针对特定癌症的治疗过程。然而，使用确定的标记通常产生难以解释的结果且在许多癌症患者中观察到持续发生高死亡率。
免疫疗法具有基本上改善癌症治疗和存活率的潜能。这类疗法可以包括对卵巢癌抗原产生或增强免疫反应的过程。然而，迄今为止，了解到的卵巢癌抗原相对较少且尚未证实对抗原产生的免疫反应对治疗有利。
因此，本领域中存在对鉴定卵巢肿瘤抗原和在卵巢癌疗法中使用这类抗原的改进方法的需求。本发明满足了这些需求并进一步提供了其它相关的优点。
发明概括简单地说，本发明提供了用于治疗诸如卵巢癌这样的癌症的组合物和方法。在一个方面中，本发明提供了包括卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式的多肽类，使得该变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱。在某些实施方案中，所述的卵巢癌蛋白质包括由选自SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391组成的组的多核苷酸序列和这类多核苷酸的互补物编码的序列。
本发明进一步提供了编码如上所述的多肽或其部分的多核苷酸、包括这类多核苷酸的表达载体和用这类表达载体转化或转染的宿主细胞。
在其它方面中，本发明提供了药物组合物和疫苗。药物组合物可以包括生理上可接受的载体或赋形剂以及下列物质中的一种或多种(i)一种包括卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式的多肽，使得该变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白质包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的序列；(ii)一种编码这类多肽的多核苷酸；(iii)一种与这类多肽特异性结合的抗体；(iv)一种表达这类多肽的抗原呈递细胞；和/或(v)一种与这类多肽发生特异性反应的T细胞。疫苗可以包括非特异性免疫反应增强剂和下列物质中的一种或多种(i)一种包括卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式的多肽，使得该变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白质包括内多核苷酸编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的序列；(ii)一种编码这类多肽的多核苷酸；(iii)一种被特异性结合这类多肽的抗体所特异性结合的抗独特型抗体；(iv)一种表达这类多肽的抗原呈递细胞；和/或(v)一种与这类多肽发生特异性反应的T细胞。
在其它方面中，本发明进一步提供了包括如上所述的至少一种多肽的融合蛋白以及编码这类融合蛋白的多核苷酸。
在相关的方面中，本发明提供了包括融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸以及生理上可接受的载体的药物组合物。
在其它方面中，本发明进一步提供了包括融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸以及非特异性免疫反应增强剂的疫苗。
在其它方面中，本发明提供了用于抑制患者体内癌症发生的方法，该方法包括给患者施用如上所述的药物组合物或疫苗的步骤。
在其它方面中，本发明进一步提供了用于刺激和/或扩充T细胞的方法，该方法包括使T细胞与下列物质接触的步骤(a)一种多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列包括以SEQ IDNOs1-387或391中任意一种描述的序列；(b)一种编码这类多肽的多核苷酸；和/或(c)一种在足以刺激和/或扩充T细胞的条件和时间下表达这类多肽的抗原呈递细胞。这类多肽、多核苷酸和/或抗原呈递细胞可以存在于药物组合物或疫苗内以便用于刺激和/或扩充哺乳动物体内的T细胞。
在其它方面中，本发明提供了用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用如上所述制备的T细胞的步骤。
在其它方面中，本发明提供了用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括下列步骤(a)用下列物质中的一种或多种培养分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞(i)一种多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的序列；(ii)一种编码这类多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达这类多肽的抗原呈递细胞；从而使T细胞增殖；和(b)给患者施用有效量的增殖的T细胞并由此抑制患者体内卵巢癌的发生。可以在对患者给药前克隆增殖的细胞。
在其它方面中，本发明还提供了用于鉴定分泌的肿瘤抗原的方法。这类方法包括下列步骤(a)将肿瘤细胞植入免疫缺陷型哺乳动物体内；(b)在足以使肿瘤抗原分泌入血清的一定时间后从免疫缺陷型哺乳动物体内获得血清；(c)给免疫活性哺乳动物免疫接种该血清；(d)从免疫活性哺乳动物体内获得抗血清；和(e)用该抗血清筛选肿瘤表达文库且由此鉴定分泌的肿瘤抗原。一种用于鉴定分泌的卵巢癌抗原的优选方法包括下列步骤(a)将卵巢癌细胞植入SCID小鼠体内；(b)在足以使卵巢癌抗原分泌入血清的一定时间后从SCID小鼠体内获得血清；(c)给免疫活性免疫小鼠接种该血清；(d)从免疫活性小鼠体内获得抗血清；和(e)用该抗血清筛选卵巢癌表达文库且由此鉴定分泌的卵巢癌抗原。
本发明的这些和其它方面在参照下面的具体描述和所附的附图时将变得显而易见。将本文所公开的所有参考文献的全部内容引入本文作为参考，就如同将它们分别引入作为参考一样。
附图简述附

图1A-1S(SEQ ID NOs1-71)描述了编码有代表性的分泌的卵巢癌抗原的多核苷酸的部分序列。
附图2A-2C描述了附图1克隆中的三种的全插入序列。附图2A表示命名为07E的序列(11731；SEQ ID NO72)；附图2B表示命名为09E的序列(11785；SEQ ID NO73)且附图2C表示命名为08E的序列(13695；SEQ ID NO74)。
附图3提供了对命名为08E的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图4提供了编码卵巢癌序列的多核苷酸部分序列(命名为3gSEQID NO75)，其中所述的卵巢癌序列是一种位于人T-细胞白血病I型病毒癌蛋白质TAX与骨粘连蛋白之间的剪接融合体。
附图5提供了命名为3f(SEQ ID NO76)的卵巢癌多核苷酸。
附图6提供了命名为6b(SEQ ID NO77)的卵巢癌多核苷酸。
附图7A和7B提供了命名为8e(SEQ ID NO78)和8h(SEQ ID NO79)的卵巢癌多核苷酸。
附图8提供了命名为12c(SEQ ID NO80)的卵巢癌多核苷酸。
附图9提供了命名为12h(SEQ ID NO81)的卵巢癌多核苷酸。
附图10描述了对命名为3f的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图11描述了对命名为6b的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图12描述了对命名为8e的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图13描述了对命名为12c的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图14描述了对命名为12h的卵巢癌序列的显微排列表达分析结果。
附图15A-15EEE描述了编码有代表性的分泌的卵巢癌抗原的附加的多核苷酸的部分序列(SEQ ID NOs82-310)。
附图16是说明全长序列内各种部分08E序列的位置的示意图。
发明详述如上所述，本发明一般涉及用于治疗诸如卵巢癌这样的癌症的组合物和方法。本文所述的组合物可以包括免疫原性多肽类、编码这类多肽的多核苷酸、诸如与多肽结合的抗体这样的结合剂、抗原呈递细胞(APCs)和/或免疫系统细胞(例如T细胞)。
本发明的多肽类一般包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或其变化形式。已经使用免疫测定技术鉴定了某些卵巢癌蛋白质且在本文中将其称作卵巢癌抗原。“卵巢癌抗原”是一种以比正常卵巢细胞水平至少高两倍水平的卵巢肿瘤细胞(优选人体细胞)表达的蛋白质。某些卵巢癌抗原以可检测到的方式(在一种诸如ELISA或蛋白质印迹这样的免疫测定中)与针对来自植入了人卵巢肿瘤的免疫缺陷型动物的血清而产生的抗血清发生反应。这类卵巢癌抗原从卵巢肿瘤中排出或分泌入免疫缺陷型动物的血清。因此，本文所提供的某些卵巢癌抗原是分泌抗原。本发明主题的某些核酸序列一般包括编码全部或部分这类多肽的DNA或RNA序列或与这类序列互补。
本发明进一步提供了使用评价卵巢肿瘤内表达改变的技术所鉴定的卵巢癌序列。这类序列可以是多核苷酸或蛋白质序列。正如使用本文提供的有代表性的测定法所测定的，一般在卵巢肿瘤中表达卵巢癌序列的水平至少高于正常卵巢组织内的表达水平两倍、且优选至少高5倍。本文提供了某些卵巢癌多核苷酸的部分序列。还将由包括这类多核苷酸序列(或其互补物)的基因编码的蛋白质看作是卵巢癌蛋白质。
抗体一般是如本文描述的能够结合至少部分卵巢癌多肽的免疫系统蛋白质或其抗原结合片段。可以在本文提供的组合物中使用的T细胞一般是对这类多肽具有特异性的T细胞(例如CD4+和/或CD8+)。本文所述的某些方法进一步使用了表达如本文所提供的卵巢癌多肽的抗原呈递细胞(诸如树突细胞或巨噬细胞)。卵巢癌多核苷酸本发明包括编码如本文所述的卵巢癌蛋白质或其部分或其其它变化形式的任意多核苷酸。优选的多核苷酸包括至少15个连续的核苷酸、优选至少30个连续的核苷酸且更优选至少45个连续的核苷酸，它们可编码卵巢癌蛋白质的一部分。更优选地，一种多核苷酸编码诸如卵巢癌抗原这样的卵巢癌蛋白质的免疫原性部分。本发明还包括与任意这类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义的)或双链的且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。附加的编码或非编码序列可以(但并不需要)存在于本发明的多核苷酸内且多核苷酸可以(但并不需要)与其它分子和/或支持物连接。
多核苷酸可以包括天然序列(即编码卵巢癌蛋白质或其部分的内源性序列)或可以包括这类序列的变化形式。多核苷酸变化形式可以含有一种或多种取代、缺失、添加和/或插入，使得所编码的多肽的免疫原性相对于天然卵巢癌蛋白质来说不会被削弱。一般可以如本文所述评价对所编码的多肽的免疫原性的作用。变化形式优选表现出与编码天然卵巢癌蛋白质或其部分的多核苷酸序列至少约70％的同一性、更优选至少约80％的同一性且最优选至少约90％的同一性。
两种多核苷酸或多肽序列的同一性百分比可以通过使用本领域技术人员众所周知的诸如Megalign这样的应用默认参数的计算机算法对序列进行比较而方便地测定。两种序列之间的比较一般通过比较用于鉴定和比较序列相似性的局部区域的比较窗口内的序列来进行。本文所用的“比较窗口”指的是至少约20个相邻位置、通常30-约75或40-约50个相邻位置的区段，其中可以在使两种序列进行最佳排列后对序列与相邻位置的相同数量的参考序列进行比较。例如，可以使用应用默认参数的生物信息学软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)Lasergene组中的Megalign程序对用于比较的序列进行最佳排列。优选通过对至少20个位置比较窗口内的两种最佳排列的序列进行比较来测定序列同一性的百分比，其中窗口内的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括相对于参考序列(不含添加或缺失)来说为20％或20％以下、通常为5-15％或10-12％的添加或缺失(即缺口)。同一性百分比可以通过如下方法来计算测定相同核酸碱基或氨基酸残基在两种序列中出现的位置的数目得到配对位置的数目，将配对位置的数目除以参考序列中位置的总数(即窗口大小)并将结果乘以100得到序列同一性百分比。
此外或另一方面，变化形式可以基本上与天然基因或其部分或其互补物同源。这类多核苷酸变化形式能够在中等严格条件下与天然出现的编码天然卵巢癌蛋白质的DNA序列(或互补序列)杂交。合适的中等严格条件包括在5％X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃下、5X SSC条件下杂交过夜；随后在65℃下用含有O.1％SDS的2X、O.5X和O.2X SSC洗涤共两次、每次20分钟。
本领域技术人员可以理解存在编码本文所述的多肽的许多核苷酸序列作为遗传密码简并的结果。这些多核苷酸中的某些与任意天然基因中的核苷酸序列具有最低限度的同源性。尽管如此，但是本发明特别关注因密码子选择上的差异而改变的多核苷酸。此外，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因属于本发明的范围。等位基因是作为一种或多种诸如核苷酸缺失、添加和/或取代这样的突变结果而改变的内源性基因。所得的mRNA和蛋白质可以(但并不需要)具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
使用任意不同的技术可以制备多核苷酸。例如，正如下面更详细地描述的，在给免疫活性小鼠注射来自植入了晚期传代卵巢肿瘤的SCID小鼠血清后，可以通过用针对这类小鼠血清产生的抗血清筛选晚期传代卵巢肿瘤表达文库来鉴定卵巢癌多核苷酸。还可以使用用于评价不同基因表达的任意不同技术来鉴定卵巢癌多核苷酸。另一方面，可以从由卵巢肿瘤细胞制备的cDNA来扩增多核苷酸。通过聚合酶链反应(PCR)可以扩增这类多核苷酸。就这一手段而言，可以以本文提供的序列为基础设计序列特异性引物且可以商购或合成序列特异性引物。
可以使用众所周知的技术将扩增的部分用于从合适的文库(例如卵巢癌cDNA文库)中分离全长基因。在这类技术中，使用一种或多种适合于扩增的多核苷酸探针或引物来选择文库(cDNA或基因组文库)。优选将文库进行大小选择以便包括较大的分子。还可以优先选择用于鉴定基因5’和上游区的随机引物文库。优先选择基因组文库以便用于获得内含子和延伸的5’序列。
就杂交技术而言，可以使用众所周知的技术标记部分序列(例如通过切口平移或用32P末端标记)。然后通过将含有变性细菌菌落(或含有噬菌体斑的菌苔)的滤膜与标记的探针杂交来筛选细菌或噬菌体文库(参见Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)“实验室手册”(A Laboratory Manual)，美国冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratories)，纽约冷泉港，1989)。选择杂交菌落或噬菌斑并使其扩大且分离DNA用于进一步的分析。可以分析cDNA克隆以便例如通过使用来自部分序列的引物和来自载体的引物进行PCR来测定添加序列的数量。可以生成限制酶图谱和部分序列以便鉴定一种或多种重叠的克隆。然后使用标准技术可以测定完全的序列，这一过程可以包括产生一系列缺失克隆。接着将所得的重叠序列装配成单一的邻接序列。通过使用众所周知的技术连接合适的片段可以产生全长cDNA分子。
另一方面，存在大量用于从部分cDNA序列中获得全长编码序列的扩增技术。在这类技术中，扩增一般通过PCR来进行。可以将任意不同的商购试剂盒用于进行扩增步骤。例如，可以使用本领域中众所周知的软件来设计引物。优选引物具有22-30个核苷酸的长度、具有至少50％的GC含量并在约68℃-72℃的温度下与靶序列一起退火。可以如上所述测序扩增的区域并将重叠的序列装配成邻接序列。
一种这类扩增技术是反向聚合酶链反应(参见Triglia等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)168186，1988)，该技术使用限制酶来产生公知基因区域内的片段。然后通过分子内连接使该片段成环形并用作使用来源于公知区域的分歧引物进行PCR的模板。在一种可选择的手段中，可以通过使用针对接头序列的引物和对已知区域具有特异性的引物进行扩增来恢复与部分序列邻接的序列。一般使用相同的接头序列和对已知区域具有特异性的引物对扩增的序列进行第二轮扩增。关于应用两种启动从已知序列向反向延伸的引物的这一过程的变化形式描述在WO96/38591中。另外的技术包括俘获PCR(Lagerstrom等人，《实用PCR方法》(PCR Methods Applic.)1111-19，1991)和步行PCR(Parker等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)193055-60，1991)。还可以使用应用扩增的其它方法以便获得全长cDNA序列。
在某些情况中，能够通过对诸如商购自GenBank的表达序列标记(EST)数据库中提供的序列进行分析而获得全长cDNA序列。一般使用众所周知的程序可以对重叠ESTs进行检索(例如NCBI BLAST检索)且可以将这类ESTs用于产生连续的全长序列。
在附图1A-1S(SEQ ID NOS1-71)和附图15A-15EEE(SEQ ID NOs82-310)中提供了编码卵巢癌抗原部分的cDNA分子的某些核酸序列。附图1A-1S中提供的序列看起来是新的。就附图15A-15EEE中的序列而言，数据库检索显示了基本上具有同一性的配对序列。通过使用用于鉴定分泌的肿瘤抗原的技术对卵巢肿瘤cDNA表达文库进行血清学筛选来分离这些多核苷酸。简单地说，由载体λ-筛选(Novagen)中SCID-衍生的人卵巢肿瘤(OV9334)制备晚期传代卵巢肿瘤表达文库。通过给免疫活性小鼠注射来自植入了一种晚期传代卵巢肿瘤的SCID小鼠的血清而获得筛选用血清。这项技术使得鉴定编码分泌肿瘤抗原的免疫原性部分的cDNA分子成为可能。
本发明特别包括本文所述的多核苷酸、以及包括这类序列的全长多核苷酸、这类全长多核苷酸的其它部分和与这类全长分子的全部或部分互补的序列。还可以将这项技术用于鉴定分泌自其它类型肿瘤的抗原，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
附图4-9(SEQ ID NOs75-81)以及SEQ ID NOs313-384中提供了编码卵巢癌蛋白质部分的cDNA分子的其它核酸序列。通过筛选用于与肿瘤相关的表达(即正如使用本文提供的有代表性的检测试验所测定的，在卵巢肿瘤中比在正常卵巢组织中至少大5倍的表达)的cDNAs的显微排列来鉴定这些序列。使用Synteni显微排列(Palo Alto，CA)、按照制造商的说明(且主要如Schena等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)来进行这类筛选。SEQ ID NOs311和391提供了掺入这些核酸序列中的某些的全长序列。
可以将任意不同的众所周知的技术用于评价与肿瘤相关的cDNA的表达。例如，可以使用应用标记的多核苷酸探针的杂交技术。另一方面或此外，可以使用诸如实时PCR的扩增技术(参见Gibson等人，《基因组研究》(Genome Research)6995-1001，1996；Heid等人，《基因组研究》(Genome Research)6986-994，1996)。实时PCR是一种评价扩增过程中PCR产物累积水平的技术。这项技术使得在多个样品中定量评价mRNA的水平成为可能。简单地说，从肿瘤和正常组织中提取mRNA并使用标准技术制备cDNA。例如，可以使用Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)7700 Prism仪器进行实时PCR。例如，可以使用由Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)提供的引物表达程序为所关注的基因设计配对引物和荧光探针。开始可以由本领域技术人员测定引物和探针的最佳浓度且对照(例如β-肌动蛋白)引物和探针例如可以商购自Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)。为了对样品中特异性RNA的量进行定量，在使用含有所关注基因的质粒的同时生成标准曲线。可以使用实时PCR中测定的Ct值生成标准曲线，它们与检测试验中所用的起始cDNA浓度相关。10-106所关注基因的拷贝范围内的标准稀释度一般是足够的。此外，生成对照序列的标准曲线。这要求对组织样品中的起始RNA含量与用于比较目的的对照组量进行标准化。
一般可以通过包括例如通过固相亚磷酰胺化学合成法在内的本领域中已知的任意方法来制备多核苷酸的变化形式。还可以使用诸如寡核苷酸定向位点特异性诱变(参见Adelman等人，《DNA》2183，1983)这样的标准诱变技术在多核苷酸序列中引入修饰。另一方面，可以通过体外或体内转录编码卵巢癌抗原或其部分的DNA序列来生成RNA分子，条件是用合适的RNA聚合酶启动子(诸如T7或SP6)将所述DNA引入载体。如本文所述，可以将某些部分用于制备编码的多肽。此外或另一方面，可以给患者施用某一部分，使得在体内生成编码的多肽。
还可以将与编码序列互补的序列的一部分(即反义多核苷酸)用作探针或调制基因表达。也可以将可转录成反义RNA的cDNA构建体引入细胞或组织以便有利于产生反义RNA。可以如本文所述使用反义多核苷酸以便抑制卵巢癌蛋白质的表达。可以将反义技术用于通过形成三股螺旋而控制基因表达，这一过程危及到双螺旋为结合聚合酶、转录因子或调节分子而充分打开的能力(参见Gee等人，在Huber和Carr的《分子和免疫手段》(Molecular and Immunologic Approaches)，Futura PublishingCo.(Mt.Kisco，NY；1994)中所述)。另一方面，可以将反义分子设计成与基因的控制区(例如启动子、增强子或转录起始位点)杂交并阻断该基因的转录或通过抑制转录物与核糖体的结合而阻断翻译。
可以将任意多核苷酸进一步进行修饰以便增加体内的稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基硫代磷酸酯而不是磷酸二酯酶键；和/或包括诸如肌苷、queosine和wybutosine这样的非传统碱基以及乙酰基、甲基、硫代和其它修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟苷。
可以使用确立的重组DNA技术使本文所述的核苷酸序列与各种其它核苷酸序列连接。例如，可以将多核苷酸克隆入包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒在内的任意不同克隆载体。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。一般来说，载体将含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标记。其它元件将取决于所需的用途且这对本领域技术人员来说是显而易见的。
在某些实施方案中，可以配制多核苷酸以便使它们进入哺乳动物细胞并在其中进行表达。这类制剂特别可用于如下所述的治疗目的。本领域技术人员可以理解存在许多在靶细胞中表达多核苷酸的方法且可以使用任意合适的方法。例如，可以将多核苷酸引入病毒载体，诸如但不限于腺病毒、与腺相关的病毒、逆转录病毒或牛痘或其它痘病毒(例如鸟类痘病毒)。用于将DNA掺入这类载体的技术对本领域技术人员来说是众所周知的。逆转录病毒载体可以另外转移或掺入用于选择性标记的基因(以便有助于鉴定或选择转导的细胞)和/或靶向部分，诸如编码特异性靶细胞上受体的配体的基因以便使所述载体变为靶特异性载体。还可以使用抗体、通过本领域技术人员已知的方法来完成定向。
用于治疗目的的其它制剂包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、微胶囊、微球体、珠和包括水包油乳液、胶粒、混合胶粒和脂质体在内的以脂类为基础的系统。优选用作体外和体内转运载体的胶体系统是脂质体(即人工膜囊泡)。这类系统的制备方法和应用在本领域中是众所周知的。卵巢癌多肽类在本发明的上下文中，多肽类可以包括如本文所述的至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或其变化形式。如上所述，某些卵巢癌蛋白质是由卵巢肿瘤细胞表达的卵巢癌抗原且它们在免疫测定(诸如ELISA)中以可检测到的方式与针对来自植入了卵巢肿瘤的免疫缺陷型动物的血清而产生的抗血清发生反应。其它的卵巢癌蛋白质由本文所述的卵巢癌多核苷酸编码。本文所述的多肽类可以具有任意长度。可能存在来源于天然蛋白质和/或异源序列的另外的序列且这类序列可以(但并不需要)进一步具有免疫原性或抗原特性。
本文所用的“免疫原性部分”是一种被B-细胞和/或T-细胞表面抗原受体所识别(即特异性结合)的抗原的一部分。这类免疫原性部分一般包括至少5个卵巢癌蛋白质或其变化形式的氨基酸残基、更优选至少10个氨基酸残基且更优选至少20个氨基酸残基。优选的免疫原性部分由如本文所述分离的cDNA分子编码。使用众所周知的技术一般可以鉴定另外的免疫原性部分，这类技术概括在Paul的《基础免疫学》(FundamentalImmunology)第3版243-247(Rayen Press，1993)及其中的参考文献中。这类技术包括筛选能够与卵巢癌蛋白质特异性抗体、抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的多肽类。如本文所述，如果抗血清和抗体与卵巢癌蛋白质特异性结合(即它们在ELISA或其它免疫测定中与卵巢癌蛋白质反应且不与不相关的蛋白质以可检测到的方式反应)，那么它们是“卵巢癌蛋白质特异性的”。如本文所述且使用众所周知的技术可以制备这类抗血清、抗体和T细胞。天然卵巢癌蛋白质的免疫原性部分是一种以基本上不低于全长多肽反应性的水平与这类抗血清、抗体和/或T-细胞反应的部分(例如在ELISA和/或T-细胞反应性检测试验中)。这类免疫原性部分可以在这类检测试验中以类似于或高于全长蛋白质反应性的水平发生反应。一般可以使用本领域技术人员众所周知的方法来进行这类筛选，诸如那些描述在Harlow和Lane的《抗体》(Antibodies)“实验室手册”(A Laboratory Manual)，美国冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)，1988中的方法。例如，可以将多肽固定在固体支持物上并与患者的血清接触以使抗体在血清内与固定化多肽结合。然后将未结合的血清除去并使用例如125I-标记的蛋白质A来检测结合的抗体。
如上所述，一种组合物可以包括天然卵巢癌蛋白质的变化形式。本文所用的多肽“变化形式”是一种在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然卵巢癌蛋白质的多肽，使得该多肽的免疫原性基本上不会被削弱。换句话说，相对于天然卵巢癌蛋白质来说，变化形式与卵巢癌蛋白质特异性抗血清反应的能力可以得到增强或不会改变；或可以使这种能力比天然卵巢癌蛋白质降低50％以下且优选降低20％以下。一般可以通过修饰上述多肽序列之一并评价所修饰的多肽与本文所述的卵巢癌蛋白质特异性抗体或抗血清的反应性来鉴定这类变化形式。优选的变化形式包括诸如N-末端前导序列或跨膜结构域这样的一种或多种部分已经被除去的那些变化形式。其它优选的变化形式包括已经将小部分(例如1-30个氨基酸、优选5-15个氨基酸)从成熟蛋白质的N-和/或C-末端除去的变化形式。
多肽变化形式优选显示出与天然多肽具有至少约70％、更优选至少约90％且最优选至少约95％的同一性。优选一种变化形式含有保守置换。“保守置换”是一种氨基酸取代另一种具有相似特性的氨基酸的情况，使得肽化学领域的技术人员可以预测基本上未改变的多肽的二级结构和亲水性。氨基酸取代一般可以以其残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性为基础来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且带有具有相似亲水值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守性改变的其它组的氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。另外或另一方面，一种变化形式可以含有非保守性改变。例如，还(或另外)可以通过缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性具有最低影响的氨基酸来修饰变化形式。
如上所述，多肽类可以包括共同翻译或翻译后指导蛋白质转移的蛋白质的N-末端上的信号(或前导)序列。还可以使该多肽与一种接头或易于合成、纯化或鉴定该多肽(例如聚-His)或促进该多肽与固体支持物结合的其它序列结合。例如，可以使多肽与免疫球蛋白Fc区接合。
可以使用任意不同的众所周知的技术来制备多肽类。使用本领域技术人员已知的任意不同的表达载体可以方便地由DNA序列制备由如本文所述的DNA序列编码的重组多肽类。可以在已经用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的合适的宿主细胞内进行表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或诸如COS或CHO这样的哺乳动物细胞系。可以首先使用商购的滤膜浓缩来自将重组蛋白质或多肽分泌入培养基的合适的宿主/载体系统的上清液。在浓缩后，可以将浓缩物施用于诸如亲和性基质或离子交换树脂这样的合适的纯化基质。最后，可以使用一个或多个反向HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。
还可以使用本领域技术人员众所周知的技术、通过合成方式来生产具有少于约100个氨基酸且一般少于约50个氨基酸的部分和其它变化形式。例如，可以使用任意商购的固相技术、诸如Merrifield固相合成法来合成这类多肽，其中将氨基酸依次添加到不断伸长的氨基酸链上。参见Merrifield的《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。自动化合成多肽类的设备商购自诸如AppliedBioSystems，Inc.(Foster City，CA)这样的供应商且可以按照制造商的说明操作它。
在某些具体的实施方案中，多肽可以是包括本文所述的多个多肽或包括一种如本文所述的多肽和一种诸如卵巢癌蛋白质或这类蛋白质的变化形式这样的已知肿瘤抗原的融合蛋白。例如，融合配偶体可以辅助产生T辅助细胞表位(一种免疫融合配偶体)、优选由人识别的T辅助细胞表位或可以辅助以高于天然重组蛋白质的产量表达蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合配偶体既是免疫的又是表达增强的融合配偶体。可以对其它融合配偶体进行选择以便增加蛋白质的溶解性或能够将蛋白质靶向至所需的胞内区室。另外的融合配偶体包括有利于纯化蛋白质的亲和性标记。
一般可以使用包括化学结合在内的标准技术制备融合蛋白。优选将融合蛋白表达为重组蛋白质，使得在表达系统中相对于非融合蛋白来说它们产生的量增加。简单地说，可以将编码多肽成分的DNA序列单独装配并连入合适的表达载体。使用或不用肽接头将编码一种多肽成分的DNA序列的3’末端与编码第二种多肽成分的DNA序列的5’末端连接以便序列的读框处于同相中。这使得翻译成保留两种成分多肽生物活性的单一融合蛋白成为可能。
可以使用肽接头使第一种和第二种多肽成分相隔的距离足以确保使各多肽折叠成其二级结构和三级结构。使用本领域众所周知的标准技术将这类肽接头序列掺入融合蛋白。可以以下列因素为基础选择合适的肽接头(1)其采取柔性扩展构象的能力；(2)其不具有采取能与第一种和第二种多肽上功能表位发生相互作用的二级结构的能力；和(3)可能与多肽功能表位发生相互作用的疏水性或带电荷残基的缺乏。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。可以将诸如Thr和Ala这样的其它接近中性的氨基酸用于肽接头序列。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括那些概括在Maratea等人，《基因》(Gene)4039-46，1985、Murphy等人，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262，1986、美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中的序列。接头序列一般可以具有1-约50个氨基酸的长度。当第一种和第二种多肽具有可用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区时，并不需要接头序列。
将连接的DNA序列可操作地与合适的转录和翻译调节元件连接。导致表达DNA的调节元件仅位于编码第一种多肽的DNA序列的5’端。类似地，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号仅位于编码第二种多肽的DNA序列的3’端。
还提供了包括本发明多肽和不相关的免疫原性蛋白质的融合蛋白。优选所述的免疫原性蛋白质能够引起回忆反应。这类蛋白质的实例包括破伤风蛋白质、结核蛋白质和肝炎蛋白质(例如，参见Stoute等人，《新英格兰药物杂志》33686-91，1997)。
在优选的实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白质D、即一种革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白(WO91/18926)。优选蛋白质D衍生物包括约三分之一的蛋白质(例如N-末端的前100-110个氨基酸)且可以使蛋白质D衍生物脂化。在某些优选的实施方案中，在N-末端上包含脂蛋白D融合配偶体的前109个残基以便形成具有附加的外源T-细胞表位的多肽并提高大肠杆菌内的表达水平(由此起表达增强子的作用)。脂尾确保以最佳方式将抗原呈递给抗原呈递细胞。其它融合配偶体包括来自流感病毒NS1(血凝素)的非结构蛋白。一般来说，使用N-末端的81个氨基酸，不过，可以使用包括T-辅助细胞表位的不同片段。
在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是称作LYTA的蛋白质或其部分(优选C-末端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌，它可合成称作酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；《基因》(Gene)43265-292，1986)。LYTA是一种特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白质的C-末端结构域是导致与胆碱或与某些诸如DEAE这样的胆碱类似物亲和的原因。已经利用这种特性开发了用于表达融合蛋白的C-LYTA表达质粒。已经描述了在氨基末端含有C-LYTA片段的杂交蛋白质的纯化(参见《生物技术》(Biotechnology)10795-798，1992)。在一个优选的实施方案中，可以将LYTA的重复部分掺入融合蛋白。在178位残基开始的C-末端区内发现了重复部分。特别优选的重复部分含有188-305位残基。
一般来说，分离了如本文所述的多肽类(包括融合蛋白)和多核苷酸。“分离”的多肽或多核苷酸是一种来源于其原始环境中的部分。例如，如果天然存在的蛋白质分离自天然系统中某些或全部共存的物质，那么它是分离的。优选这类多肽至少具有约90％的纯度、更优选至少具有约95％的纯度且最优选至少具有约99％的纯度。例如，如果将多核苷酸克隆入不属于天然环境中的一部分的载体，那么将其看作是分离的。结合剂本发明进一步提供了诸如抗体及其抗原结合片段这样的活性剂，它们特异性结合卵巢癌蛋白质。一般认为如果本文所用的抗体或其抗原结合片段在可检测的水平上(例如在ELISA中)与卵巢癌蛋白质发生反应且在相似条件下不与不相关的蛋白质以可检测的方式发生反应，那么它与卵巢癌蛋白质“特异性结合”。本文所用的“结合”指的是两种独立分子之间的非共价结合而形成“复合物”。例如，可以通过测定形成所述复合物的结合常数来评价结合能力。结合常数是复合物的浓度除以产物成分的浓度时获得的数值。在本发明的上下文中，当形成复合物的结合常数超过约103L/mol时，一般认为两种化合物“结合”。可以使用本领域众所周知的方法测定结合常数。
使用本文提供的有代表性的检测试验，结合剂可能还能够区分患有和不患有诸如卵巢癌这样的癌症的患者。换句话说，与卵巢癌抗原结合的抗体或其它结合剂会产生一种指示至少约20％癌症患者中癌症存在的信号并产生一种指示至少约90％未患癌症个体中这种疾病不存在的阴性信号。为了测定结合剂是否能够满足这种需求，如本文所述对来自患有和不患癌症患者(如使用标准临床试验测定的)的生物样品(例如血液、血清、白细胞转移、尿和/或肿瘤活检组织)检测可结合结合剂的多肽类的存在。显然应检测患有和不患该病的具有统计学显著性数量的样品。各结合剂应满足上述标准；然而，本领域技术人员会认识到可以以组合方式使用结合剂以便改善敏感性。
满足上述要求的任意活性剂可以是一种结合剂。例如，结合剂可以是包有或不包有肽成分的核糖体、RNA分子或多肽。在一个优选的实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。可以通过本领域技术人员已知的任意不同技术制备抗体。例如，参见Harlow和Lane的《抗体》(Antibodies)“实验室手册”(A Laboratory Manual)，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988。一般来说，通过包括如本文所述生产单克隆抗体在内的细胞培养技术或通过将抗体基因转染入合适的细菌或哺乳动物细胞宿主可以生产抗体，从而产生重组抗体。在一种技术中，开始将包括多肽的免疫原注入任意不同的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)。在该步骤中，本发明的多肽类可以用作不加修饰的免疫原。另一方面，特别就相对较短的多肽类而言，如果使所述多肽与诸如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白这样的载体蛋白连接，那么可以引起优良的免疫反应。优选按照包括一次或多次加强免疫的预定方案将免疫原注入动物宿主并定期对动物取血。然后，例如可以通过使用与合适的固体支持物偶联的多肽的亲和色谱法从这类抗血清中纯化对所述多肽具有特异性的多克隆抗体。
例如，可以使用Kohler和Milstein在《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976中所述的技术及其改进技术来制备对所关注的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体。简单地说，这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即与所关注多肽的反应性)的抗体的无限增殖细胞系的步骤。例如，可以由获自如上所述免疫接种动物的脾细胞产生这类细胞系。然后，例如通过与骨髓瘤细胞融合配偶体、优选一种与免疫接种动物同基因的配偶体融合使所述的脾细胞无限增殖化。可以使用各种融合技术。例如，可以使脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子型去污剂混合几分钟且然后以低密度将它们平板接种在维持杂交细胞而不是骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)选择。在足够的时间、通常约为1-2周后，观察到杂交体集落。选择单一集落并检测其培养物上清液对所述多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可以分离自生长杂交瘤集落的上清液。此外，可以将各种技术用于提高产量，诸如将杂交瘤细胞系注入诸如小鼠这样的合适脊椎动物宿主的腹膜腔的技术。然后从腹水液或血液中收集单克隆抗体。可以通过诸如色谱法、凝胶过滤法、沉淀法和提取法这样的常规技术从所述抗体中除去污染物。可以将本发明的多肽类用于例如亲和色谱步骤中的纯化过程。
在某些实施方案中，可以优选使用抗体的抗原结合片段。这类片段包括可以使用标准技术制备的Fab片段。简单地说，可以通过蛋白质A珠柱上的亲和色谱法从家兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane的《抗体》(Antibodies)“实验室手册”(A Laboratory Manual)，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988)并通过木瓜蛋白酶将其消化而产生Fab和Fc片段。可以通过蛋白质A珠柱上的亲和色谱法分离Fab和Fc片段。
可以将本发明的单克隆抗体与一种或多种治疗剂偶联。在这方面合适的治疗剂包括放射性核素、分化诱导物、药物、毒素及其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤、嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导物包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单胞菌外毒素、志贺菌属毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。
可以以直接或间接(例如通过连接基团)的方式使治疗剂与合适的单克隆抗体偶联(例如通过共价结合的方式)。治疗剂与抗体之间的直接反应在它们各自具有能够彼此发生反应的取代基时是可能的。例如，在一种物质上的诸如氨基或巯基这样的亲核基可能能够与诸如酐或酰基卤这样的含羰基的基团或与另一种物质上的含良好的离去基团(例如卤化物)的烷基发生反应。
另一方面，可能需要通过连接基团偶联治疗剂和抗体。连接基团可以起治疗剂与抗体之间的间隔基的作用以便避免干扰结合能力。连接基团还可以用于增加治疗剂或抗体上的取代基的化学反应性且由此提高偶联功效。化学反应性的提高还可有助于治疗剂、或治疗剂上的官能基的应用，否则是不可能的。
可以将各种双功能或多功能试剂即相同和不同功能试剂(诸如在Pierce Chemical Co.，Rockford，IL目录中所述的那些试剂)用作连接基团，这对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基可以进行偶联。存在大量描述这类方法的参考文献，例如Rodwell等人的美国专利号4,671,958。
尽管治疗剂在不含本发明的免疫缀合物的抗体部分时更为有效，但是可能需要使用在摄入细胞过程中或摄入细胞时可裂解的连接基团。已经描述了大量不同的可裂解的连接基团。在胞内从这些连接基团中释放治疗剂的机理包括通过下列方式进行裂解还原二硫键(例如Spitler的美国专利号4,489,710)；照射遇光不稳定的键(例如Senter等人的美国专利号4,625,014)；水解衍生的氨基酸侧链(例如kohn等人的美国专利号4,638,045)；血清互补物介导的水解(例如Rodwell等人的美国专利号4,671,958)；和酸催化的水解(例如Blattler等人的美国专利号4,569,789)。
可能需要将一种以上的治疗剂与抗体偶联。在一个实施方案中，将多个治疗剂分子与一个抗体分子偶联。在另一个实施方案中，可以将一种类型以上的治疗剂与一种抗体偶联。无论特定的实施方案如何，可以按照不同方式制备与一种以上治疗剂形成的免疫缀合物。例如，可以将一种以上的治疗剂直接与一种抗体分子偶联或可以使用为附着提供多个位点的接头。另一方面，可以使用一种载体。
载体可以以多种方式，包括直接或通过连接基团共价结合带有治疗剂。合适的载体包括诸如白蛋白这样的蛋白质(例如Kato等人的美国专利号4,507,234)、肽类和诸如氨基葡聚糖这样的多糖类(例如Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体还可以通过非共价键或通过诸如包裹在脂质体囊泡内而带有治疗剂(例如美国专利号4,429,008和4,873,088)。对放射性核素具有特异性的载体包括放射性卤化的小分子和螯合化合物。例如，美国专利号4,735,792中公开了有代表性的放射性卤化小分子及其合成方法。可以由包括含氮和硫原子作为结合金属或金属氧化物(放射性核素)用供体原子的那些螯合化合物制成放射性核素螯合物。例如，Davison等人的美国专利号4,673,562中公开了有代表性的螯合化合物及其合成方法。
可以使用抗体和免疫缀合物的不同给药途径。一般来说，给药可以是静脉内给药、肌内给药、皮下给药或在切除肿瘤的部位给药。显然抗体/免疫缀合物的准确剂量将取决于所用的抗体、肿瘤上抗原的密度和抗体的清除率而改变。
本文还提供了模拟卵巢癌蛋白质免疫原性部分的抗独特型抗体。使用众所周知的技术，可以针对特异性结合卵巢癌蛋白质的免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段产生这类抗体。模拟卵巢癌蛋白质的免疫原性部分的抗独特型抗体是结合如本文所述可特异性结合卵巢癌蛋白质的免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段的那些抗体。T细胞免疫治疗组合物还或另一方面可以包括对卵巢癌蛋白质具有特异性的T细胞。一般可以使用标准程序在体外或体内制备这类细胞。例如，使用商购自CellPro Inc.，Bothell WA的诸如CEPRATETM系统这样的商购细胞分离系统可以使T细胞存在于骨髓(或分离自)骨髓、外周血液或骨髓部分或诸如患者这样的哺乳动物外周血液中(另外参见美国专利号5,240,856；美国专利号5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)。另一方面，T细胞可以来源于相关的或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。
可以用卵巢癌多肽、编码卵巢癌多肽的多核苷酸和/或表达这类多肽的抗原呈递细胞(APC)来刺激T细胞。这种刺激过程在足以使对所述多肽具有特异性的T细胞生成的条件和时间下进行。优选卵巢癌多肽或多核苷酸存在于诸如微球体这样的转运载体内以便促进特异性T细胞生成。
如果T细胞杀死包被有卵巢癌多肽或表达编码这类的基因的靶细胞，那么将T细胞看作对卵巢癌多肽具有特异性。使用任意不同的标准技术可以评价T细胞特异性。例如，在铬释放测定或增殖测定中，裂解和/或增殖比阴性对照增加2倍以上的刺激指数表明了T细胞的特异性。例如，可以如Chen等人在《癌症研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994中所述进行这类测定。另一方面，通过各种已知的技术可以完成对T细胞增殖的检测。例如，通过测定DNA合成的增加率(例如通过用含氚胸苷脉冲标记T细胞培养物并测定掺入DNA的含氚胸苷的量)可以检测T细胞的增殖情况。正如使用标准细胞因子检测试验所测定的，与卵巢癌多肽(200ng/ml-100μg/ml、优选100ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应导致T细胞增殖至少增加2倍和/或如上所述接触2-3小时应导致T细胞激活，其中细胞因子的释放水平(例如TNF或IFN-γ)提高2倍表示T细胞激活(参见Coligan等人《最新免疫学方案》(CurrentProtocols in Immunology)第1卷，Wiley Interscience(Greene1998))。为响应卵巢癌多肽、多核苷酸或表达卵巢癌多肽的APC已经被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。使用标准技术可以使卵巢癌多肽特异性T细胞扩充。在优选的实施方案中，T细胞来源于患者或相关或不相关的供体且在刺激和扩充后给患者施用它们。
为了治疗目的，可以使为响应卵巢癌多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T细胞在体外或体内的数量扩充。按照不同方式可以完成这类T细胞在体外的增殖。例如，可以通过添加或不添加诸如白细胞介素-2这样的T细胞生长因子和/或合成卵巢癌多肽的细胞刺激物使T细胞重新与卵巢癌多肽接触。另一方面，通过克隆可以使在有卵巢癌多肽存在的情况下增殖的一种或多种T细胞的数量扩充。用于克隆细胞的方法在本领域中是众所周知的且包括有限稀释。例如，在扩充后，可以如Chang等人在《肿瘤学与血液学标准综述》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)22213，1996中所述将所述细胞给药回患者体内。药物组合物和疫苗在某些方面中，可以将如本文所述的多肽类、多核苷酸、结合剂和/或免疫系统细胞混入药物组合物或疫苗。药物组合物包括一种或多种这类化合物或细胞和生理上可接受的载体。疫苗可以包括一种或多种这类化合物或细胞和非特异性免疫反应增强剂。非特异性免疫反应增强剂可以是增强对外源抗原的免疫反应的任意物质。非特异性免疫反应增强剂的实例包括佐剂、可生物降解的微球体(例如polylactic galactide)和脂质体(化合物混入其中；例如，参见Fullerton的美国专利号2,235,877)。例如，疫苗制品一般描述在M.F.Powell和M.J.Newman编辑的“疫苗设计(亚单位和佐剂法)”(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))、Plenum Press(NY，1995)中。本发明范围内的药物组合物和疫苗还可以含有具生物活性的或无活性的其它化合物。例如，可以将存在的其它肿瘤抗原的一种或多种免疫原性部分混入融合多肽或作为混入所述组合物或疫苗中的独立化合物。
药物组合物或疫苗可以含有编码如上所述的一种或多种多肽类的DNA，使得所述多肽在原位生成。如上所述，所述DNA可以存在于本领域技术人员已知的包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统在内的任意不同转运系统中。合适的核酸表达系统含有在患者体内表达所必需的DNA序列(诸如合适的启动子和终止信号)。细菌转运系统涉及给予表达在其细胞表面上多肽的免疫原性部分的细菌(诸如卡介苗)。在一个优选的实施方案中，可以使用可包括应用非致病性(缺陷型)复制活性病毒的病毒表达系统(例如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入所述DNA。例如，合适的系统公开在下列文献中Fisher-Hoch等人的PNAS 86317-321，1989；Flexner等人的《纽约科学院年鉴》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)56986-103，1989；Flexner等人的《疫苗》(Vaccine)817-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB2，200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner的《生物技术》(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等人的《科学》(Science)252431-434，1991；Kolls等人的PNAS 91215-219，1994；Kass-Eisler等人的PNAS 9011498-11502，1993；Guzman等人的《循环》(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等人的《循环研究》(Cir.Res.)731202-1207，1993。用于将DNA混入这类表达系统的技术对本领域技术人员来说是众所周知的。例如，正如Ulmer等人在《科学》(Science)2591745-1749，1993中描述和由Cohen在《科学》(Science)2591691-1692，1993中综述的，所述DNA还可以是“裸的”。通过将所述DNA包被在有效转运入细胞的可生物降解的珠上可以提高裸DNA的摄取。
尽管可以将本领域技术人员已知的任意合适的载体用于本发明的药物组合物中，但是载体的类型将取决于给药方式。可以为合适的给药方式来配制本发明的组合物，例如，所述的给药方式包括局部给药、口服给药、鼻部给药、静脉内给药、颅内给药、腹膜内给药、皮下给药或肌内给药。就诸如皮下注射这样的非肠道给药而言，所述的载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。就口服给药而言，可以使用任意上述载体或固体载体诸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可以将可生物降解的微球体(例如聚乳酸聚乙醇酸酯)用作本发明药物组合物的载体。例如，适宜的可生物降解的微球体公开在美国专利号4,897,268和5,075,109中。
这类组合物还可以包括缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白质、多肽类或诸如甘氨酸这样的氨基酸、抗氧化剂、诸如EDTA或谷胱甘肽这样的螯合剂、佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。另一方面，可以将本发明的组合物配制成冻干物。还可以使用众所周知的技术将化合物包裹在脂质体内。
可以将任意不同的非特异性免疫反应增强剂用于本发明的疫苗中。例如，可以包括佐剂。大多数佐剂含有用于防止抗原快速分解代谢的诸如氢氧化铝或矿物油这样的物质和诸如脂质A，即Bortadella pertussis或结核分枝杆菌衍生的蛋白质这样的免疫反应刺激物。例如，合适的佐剂是商购的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)、明矾、可生物降解的微球体、单磷酰基脂质A和quil A。还可以将诸如GM-CSF或白细胞介素-2、白细胞介素-7或白细胞介素-12这样的细胞因子用作佐剂。
在本文所提供的疫苗中，优选将佐剂组合物设计成主要诱发Th1类型的免疫反应。高水平的Th1-型细胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)倾向于促进诱发对给予的抗原的细胞介导的免疫反应。相反，高水平的Th2-型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)倾向于促进诱发体液免疫反应。在施用如本文所提供的疫苗后，患者维持包括Th1-和Th2-型反应在内的免疫反应。在一个反应主要为Th1-型反应的优选的实施方案中，Th1-型细胞因子的水平增加至高于Th2-型细胞因子水平的程度。使用标准检测试验可以方便地评价这些细胞因子的水平。就对细胞因子家族的综述而言，参见Mosmann和Coffman的《免疫学回顾年鉴》(Ann.Rev.Immunol.)7145-173，1989。
例如，用于主要引起Th1-型反应的优选的佐剂包括单磷酰基脂质A、优选3-脱氧-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合物。MPL佐剂商购自Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton，MT；参见美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。另外优选的是AS-2(SmithKline Beecham)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也可诱发主要为Th1的反应。这类寡核苷酸是众所周知的且例如描述在WO96/02555中。另一种优选的佐剂是皂苷、优选QS21，可以单独或与其它佐剂一起使用它们。例如，增强的系统包括单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合物、诸如WO94/00153中所述的QS21和3D-MPL的组合物或如WO96/33739中所述用胆固醇骤冷QS21的低反应原性组合物。其它优选的制剂包括水包油型乳液和生育酚。在水包油型乳液中包括QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂配方描述在WO95/17210中。可以使用产生抗原、免疫反应增强剂和合适的载体或赋形剂的组合物的众所周知的方法制备本文所提供的任意疫苗。
可以将本文所述的组合物作为缓释制剂(即，诸如在给药后达到缓慢释放化合物目的的胶囊或海绵状物这样的制剂)的一部分进行给药。一般可以使用众所周知的技术来制备这类制剂且例如可以通过口服、直肠或皮下植入或通过在所需靶位点植入的方式给予它们。缓释制剂可以含有分散在载体基质中和/或包含在控速膜围绕的储存器内的多肽、多核苷酸或抗体。在这类制剂中使用的载体是生物相容性的且也可以是可生物降解的；优选该制剂具有以相对恒定的水平释放活性成分的能力。在缓释制剂中含有的活性化合物的量取决于植入部位、释放速率和预计的释放期限以及所治疗或预防疾病的性质。
可以在药物组合物和疫苗中使用任意不同的转运载体以便有利于产生以肿瘤细胞为靶的抗原特异性免疫反应。转运载体包括诸如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞这样的抗原呈递细胞(APCs)和可以改造成有效APCs的其它细胞。可以但不必对这类细胞进行遗传修饰以便增加呈递抗原的能力、改善对T细胞反应的激活和/或维持T细胞反应、本身具有抗肿瘤作用和/或与受体(即配对的HLA单元型)免疫相容。APCs一般可以分离自任意不同的生物液体和器官(包括肿瘤和肿瘤外围组织)且可以是自体、同种异体、同源或异源细胞。
本发明的某些优选的实施方案使用树突细胞或其祖代细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的APCs(Banchereau和Steinman《自然》(Nature)392245-251，1998)且已经证实它们可有效地作为引起预防或治疗性抗肿瘤免疫性的生理佐剂(参见Timmerman和Levy《药物回顾年鉴》《Ann.Rev.Med.》50507-529，1999)。一般来说，正如使用标准检测试验所测定的，可以以树突细胞的典型形状(在原位为星状，具有在体外可见的显著的胞质突(树突))为基础和以缺乏B细胞(CD19和CD20)、T细胞(CD3)、单核细胞(CD14)和天然杀伤细胞(CD56)的分化标记为基础来鉴定它。当然，可以将树突细胞进行改造以便表达通常不见于体内或来自体内的树突细胞上的特异性细胞表面受体或配体且这类修饰的树突细胞是本发明所关注的。作为树突细胞的替代物，可以在疫苗中使用分泌型小泡的承载抗原的树突细胞(称作外来体)(参见Zitvogel等人《天然药物》(Nature Med.)4594-600，1998)。
树突细胞和祖代细胞可以获自外周血液、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤外围组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任意其它合适的组织或液体。例如，通过向采集自外周血液的单核细胞培养物中添加诸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα这样的细胞因子的组合物可以使树突细胞从体内分化。另一方面，通过向培养基中添加GM-CSF、IL-13、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树突细胞成熟和增殖的其它化合物的组合物可以使采集自外周血液、脐带血或骨髓的CD34阳性细胞分化成树突细胞。
将树突细胞方便地分类成“未成熟”和“成熟”的细胞，这要求存在一种用于区分两种充分表征的表型的简便方式。然而，这种命名法不应排除所有可能的分化中间阶段。未成熟树突细胞的特征在于APC具有高度摄取抗原并进行加工的能力，这一能力与高度表达Fcγ受体、甘露糖受体和DEC-205标记相关。成熟表型的特征一般在于对这些标记的表达程度较低、而对导致T细胞激活的诸如I和II型MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80和CD86)这样的细胞表面分子的表达程度较高。
一般可以用编码卵巢癌抗原(或其部分或其其它变化形式)的多核苷酸转染APCs，使得在细胞表面上表达抗原或其免疫原性部分。这类转染过程可以在体内发生且然后可以将包括这类转染细胞的组合物或疫苗用于如本文所述的治疗目的。另一方面，可以给患者施用靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因转运载体，从而导致转染在体内发生。例如，一般可以使用诸如WO97/24447中所述的方法或由Mahvi等人在《免疫学与细胞生物学》(Immunology and Cell Biology)75456-460，1997中所述的基因枪手段这样的本领域中已知的任意方法在体内和从体内转染树突细胞。通过用多肽、DNA(裸或在质粒载体内)或RNA、或用表达抗原的重组细菌或病毒(例如牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒属载体)培养树突细胞或祖代细胞可以对树突细胞进行抗原承载。在承载前，可以使所述多肽与提供T细胞辅助作用的免疫配偶体(例如载体分子)共价缀合。另一方面，可以单独或在有所述多肽存在的情况下用非缀合的免疫配偶体对树突细胞进行脉冲。癌症疗法在本发明的其它方面中，可以将本文所述的组合物用于诸如卵巢癌这样的癌症的免疫疗法。在这类方法中，一般给患者施用药物组合物和疫苗。本文所用的“患者”指的是任意温血动物、优选人。患者可以患有癌症也可以不患癌症。因此，可以将上述药物组合物和疫苗用于预防癌症的发生或治疗患有癌症的患者。在某些优选的实施方案中，患者患有卵巢癌。可以使用本领域中一般可接受的标准来诊断这类癌症、包括存在的恶性肿瘤。可以在外科手术摘除原发性肿瘤和/或诸如给予放疗或常规的化疗药这样的治疗之前或之后给予药物组合物和疫苗。
在某些实施方案中，免疫疗法可以是主动免疫疗法，其中治疗依赖于体内刺激内源性宿主免疫系统以便通过给予改进免疫反应的活性剂(诸如肿瘤疫苗、细菌佐剂和/或细胞因子)对肿瘤产生反应。
在其它实施方案中，免疫疗法可以是被动免疫疗法，其中治疗过程包括用可直接或间接介导抗肿瘤作用且不必依赖于完整宿主免疫系统的确立的肿瘤免疫反应性(诸如效应细胞或抗体)转运活性剂的步骤。效应细胞的实例包括表达本文所提供的多肽的T淋巴细胞(诸如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T-辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(诸如天然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞)、B细胞和抗原呈递细胞(诸如树突细胞和巨噬细胞)。可以将对本文所述多肽具有特异性的T细胞受体和抗体受体克隆、表达并转染入用于过继免疫疗法的其它载体或效应细胞中。还可以将本文所提供的多肽类用于生成用于被动免疫疗法的抗体或抗独特型抗体(如上文所述和美国专利号4,918,164中所述)。
一般可以通过如本文所述在体外生长而获得用于过继免疫疗法的足量的效应细胞。通过保留体内的抗原识别作用而使单一抗原特异性效应细胞扩充至几十亿总数的培养条件在本领域中是众所周知的。这类体外培养条件一般经常在有细胞因子(诸如IL-2)和非分裂性饲养细胞存在的情况下应用使用抗原的间歇刺激。如上所述，可以将本文所提供的免疫反应性多肽类用于使抗原特异性T细胞培养物快速扩充以便生成足够数量的用于免疫疗法细胞。特别地，可以用免疫反应性多肽类将诸如树突细胞、巨噬细胞或B细胞这样的抗原呈递细胞进行脉冲或使用本领域中众所周知的标准技术用一种或多种多核苷酸转染它们。例如，可以用带有适合于增加重组病毒或其它表达系统中的表达的启动子的多核苷酸转染抗原呈递细胞。用于疗法的所培养的效应细胞必须能够生长并广泛分布且在体内长期存活。研究已经证实通过用补充了IL-2的抗原反复刺激可以诱导所培养的效应细胞在体内生长并以基本数量长期存活(例如，参见Cheever等人，《免疫回顾》(Immunological Reviews)157；177，1997)。
另一方面，可以将表达本文所述的多肽的载体引入取自患者的干细胞并在体外以克隆方式增殖而用于自体移植回同一患者。
给药途径和频率以及剂量将根据个体与个体的差异而改变且可以使用标准技术方便地确定。一般来说，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、经鼻内(例如通过吸入)、口服或在切除肿瘤的部位给予所述的药物组合物和疫苗。优选可以在52周的期限内给予1-10次剂量。优选以1个月的间隔给予6次剂量且可以在此后定期给予加强接种。替代方案可能适合于个别的患者。当如上所述给药时，合适的剂量是能够促进抗肿瘤免疫反应的化合物的量且至少高于基础(即未治疗的)水平10-50％。可以通过测定患者体内的抗肿瘤抗体或通过能够杀伤体外患者肿瘤细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生来监测这类反应。这类疫苗也应能够产生免疫反应，这种免疫反应导致接种疫苗的患者比未接种疫苗的患者的临床结果改善(例如更快的缓解、完全或部分或较长的不带病的存活)。一般来说，就包括一种或多种多肽类的药物组合物和疫苗而言，存在于剂量中的各多肽的量在约100μg-5mg/kg宿主的范围。合适的剂量大小将根据患者的身材而改变，不过一般在约0.1mL-约5mL的范围。
一般来说，适宜的剂量和治疗方案提供了足以达到治疗和/或预防有益效果量的活性化合物。可以通过确定治疗患者与未治疗患者相比较改善的临床结果(例如更快的缓解、完全或部分或较长的不带病的存活)来监测这类反应。预先存在的对卵巢癌抗原的免疫反应的增加通常与改善的临床结果相关。一般可以使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子检测试验来评价这类免疫反应，所述的检测试验使用治疗前和治疗后获自患者的样品来进行。用于鉴定分泌的卵巢癌抗原的筛选本发明提供了用于鉴定分泌的肿瘤抗原的方法。在这类方法中，将肿瘤植入诸如SCID小鼠这样的免疫缺陷型动物并维持足以使肿瘤抗原分泌入血清的时间。一般来说，可以将肿瘤经皮下植入免疫缺陷型动物或植入免疫缺陷型动物的生殖腺脂垫内并维持1-9个月、优选1-4个月。一般可以如WO97/18300中所述进行植入。然后使用标准技术且如本文所述将含有分泌抗原的血清用于制备免疫活性小鼠体内的抗血清。简单地说，可以将50-100μL血清(收集自三组免疫缺陷型小鼠，各组带有不同SCID-衍生的人卵巢肿瘤)按1∶1(vol∶vol)与诸如RIBI－MPL或MPL＋TDM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)这样合适的佐剂混合并按每月一次的间隔经腹膜内注入同源免疫活性动物、总计5个月。通过在第三次、第四次和第五次免疫接种后取血可以从以这类方式免疫接种的动物体内获得抗血清。一般将所得的抗血清预先清除大肠杆菌和噬菌体抗原并用于(一般在诸如1∶200这样的稀释后使用)血清学表达筛选。
文库一般是一种含有来自植入SCID小鼠类型的一种或多种肿瘤的cDNAs的表达文库。可以用诸如λ-筛选(Novagen)这样的任意合适的载体制备这种表达文库。可以使用标准技术鉴定编码与抗血清反应的多肽的cDNAs并对其进行测序。可以进一步表征这类cDNA分子以便评价在肿瘤和正常组织中的表达情况并评价患者体内抗原的分泌情况。
本文所提供的方法具有超过发现肿瘤抗原的其它方法的优点。特别地，由这类方法鉴定的所有抗原应通过肿瘤细胞的坏死而分泌或释放。这类抗原可以在肿瘤细胞表面呈递一定的时间，这一时间足以在免疫接种后通过免疫系统起到靶向和杀伤作用。用于检测癌症的方法一般来说，可以以获自患者的生物样品(诸如血液、血清、尿和/或肿瘤活检组织)中存在的一种或多种卵巢癌蛋白质和/或编码这类蛋白质的多核苷酸为基础检测患者体内的癌症。换句话说，可以将这类蛋白质用作标记以便指示存在或不存在诸如卵巢癌这样的癌症。此外，可以将这类蛋白质用于检测其它癌症。一般本文提供的结合剂可检测与生物样品中活性剂结合的蛋白质的水平。可以将多核苷酸引物和探针用于检测编码肿瘤蛋白质的mRNA的水平，它也可指示存在或不存在癌症。一般来说，与卵巢癌相关的序列应以在肿瘤组织中比在正常组织中至少高3倍的水平存在。
就使用结合剂检测样品中的多肽标记而言，存在各种本领域技术人员已知的测定方式。例如，参见Harlow和Lane的《抗体》(Antibodies)“实验室手册”(A Laboratory Manual)，美国冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，1988。一般来说，可以通过下列步骤确定患者体内存在或不存在癌症(a)使获自患者的生物样品与结合剂接触；(b)在该样品中检测与结合剂结合的多肽的水平；和(c)比较多肽水平与预定的截断值。
在一个优选的实施方案中，测定包括使用固定在固体支持物上的结合剂以便结合多肽并从样品剩余部分中除去多肽的步骤。然后可以使用含有报道基团并特异性结合到结合剂/多肽复合物上的检测试剂检测结合的多肽。例如，这类检测试剂可以包括特异性结合多肽的结合剂或抗体或特异性结合该结合剂的其它活性剂诸如抗免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。另一方面，可以使用竞争测定，其中用报道基团标记多肽并在用样品培养结合剂后使之与固定化结合剂结合。样品中成分抑制标记的多肽与结合剂结合的程度表示含有固定化结合剂的样品的反应性。用于这类检测试验中的合适的多肽类包括如上所述的全长卵巢癌蛋白质及其结合剂结合的部分。
固体支持物可以是本领域技术人员已知的肿瘤蛋白质可以与之结合的任意物质。例如，固体支持物可以是微量滴定平板或硝化纤维素或其它合适的膜中的检测孔。另一方面，所述的支持物可以是诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳这样的珠或盘或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯这样的塑料物质。所述的支持物还可以是诸如那些公开在例如美国专利号5,359,681中的磁粉或纤维光学传感器。可以使用充分描述在专利和科学文献中的本领域技术人员已知的各种技术将结合剂固定在固体支持物上。在本发明的上下文中，术语“固定化”指的是诸如吸附这样的非共价结合和共价结合(可以是活性剂与支持物上官能基之间的直接连接或可以是通过交联剂的连接)。优选通过吸附到微量滴定平板中的孔或膜上的固定化。在这样的情况下，通过使结合剂在一种合适的缓冲液中与固体支持物接触合适的时间来实现吸附。时间随温度而改变，但一般在约1小时至约1天。一般来说，接触塑料微量滴定平板(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)孔与约10ng-约10μg且优选约100ng-约1μg量的结合剂接触足以固定适当量的结合剂。
一般可以通过首先使支持物和将与该支持物和结合剂上诸如羟基或氨基这样的官能基反应的双功能试剂反应来实现结合剂与固体支持物的共价结合。例如，可以使用苯并喹啉或通过用结合配偶体上的胺和活性氢缩合支持物上的醛基使结合剂与带有合适的聚合物涂层的支持物共价结合(例如，参见Pierce的《免疫技术目录与手册》(ImmunotechnologyCatalog and Handbook)，1991的A12-A13)。
在某些实施方案中，测定是双抗体夹层测定。本测定通过首先使已经固定在通常为微量滴定平板的孔的固体支持物上的抗体与样品接触来进行，使得样品中的多肽能够与固定化抗体结合。然后从固定化多肽-抗体复合物中除去未结合的样品并加入含有报道基团的检测试剂(优选能够与多肽上的不同位点结合的第二种抗体)。接着使用适合于特异性报道基团的方法测定保持与固体支持物结合的检测试剂的量。
更具体地说，一旦如上所述将抗体固定在支持物上，则支持物上的剩余蛋白质已合位点一般被阻断。任何合适的阻断剂对本领域技术人员来说是已知的，诸如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后用样品培养固定化抗体并使所述多肽与该抗体结合。在培养前可以将该样品用诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)这样合适的稀释剂稀释。一般来说，合适的接触时间(即培养时间)是足以检测多肽在获自患卵巢癌个体的样品中的存在的多肽的时间期限。优选的接触时间足以实现在结合与未结合多肽之间达到至少约95％的平衡的结合水平。本领域技术人员会认识到通过检测一定时间期限内发生的结合水平可以方便地测定达到平衡所必需的时间。在室温下，培养约30分钟的时间一般是足够的。
然后通过用诸如含有0.1％Tween 20TM的PBS这样合适的缓冲液洗涤固体支持物而除去未结合的样品。接着将含有报道基团的第二种抗体加入到固体支持物中。优选的报道基团包括如上所述的那些基团。
然后用固定化抗体-多肽复合物将检测试剂培养足以检测结合多肽的时间期限。一般可以通过检测在一定时间期限内发生的结合水平来测定合适的时间期限。接着将未结合的检测试剂除去并使用报道基团检测结合的检测试剂。用于检测报道基团的方法取决于报道基团的性质。就放射性基团而言，一般合适的是闪烁计数法或放射自显影法。可以将光谱法用于检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用抗生物素蛋白检测生物素、使其与不同的报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联。一般可以通过添加底物(一般持续特定的时间期限)、随后对反应产物进行光谱或其它分析来检测酶报道基团。
为了确定存在或不存在诸如卵巢癌这样的癌症，一般将由保持与固体支持物结合的报道基团检测的信号与符合预定截断值的信号进行比较。在一个优选的实施方案中，用于检测癌症的截断值是用来自未患癌症患者的样品培养固定化抗体时获得的信号平均值。一般来说，将产生三种预定截断值以上的标准偏差的信号的样品看作是癌症的阳性信号。在可替代的优选的实施方案中，使用Receiver Operator Curve、按照Sackett等人在《临床流行病学》(Clinical Epidemiology)“临床医学基础科学”(A Basic Science for Clinical Medicine)，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7中所述的方法来测定所述的截断值。简单地说，在本实施方案中，可以根据符合诊断试验结果的各种可能的截断值的真实阳性率(即敏感性)和假阳性率(100％-特异性)的配对图来测定截断值。图上最接近左上角的截断值(即包围最大面积的值)是最准确的截断值且可以将产生高于通过本方法测定的截断值的信号的样品看作是阳性的。另一方面，截断值可以沿图向左移动而将假阳性率减小到最低限度或向右移动以便将假阴性率减小到最低限度。一般来说，将产生高于通过本方法测定的截断值的信号的样品看作是癌症阳性的。
在一个所涉及的实施方案中，测定可以以一种流通或带状试验形式进行，其中将结合剂固定在诸如硝化纤维素这样的膜上。在流通试验中，当样品通过膜时，样品中的多肽与固定化结合剂结合。接着当含有第二种结合剂的溶液流过膜时，第二种标记的结合剂与结合剂-多肽复合物结合。接着如上所述检测结合的第二种结合剂。在带状试验形式中，将与结合剂结合的膜的一端浸入含有样品的溶液。样品沿膜迁移过含有第二种结合剂的区并到达固定化结合剂的区域。第二种结合剂集中在固定化抗体区域表示存在癌症。一般来说，第二种结合剂集中在该部位产生一种可以目测读取的图形诸如线条。没有这类图形表示阴性结果。一般来说，当生物样品含有足以在上述形式的双抗体夹层测定中产生阳性信号的多肽量时，对固定在膜上的结合剂的量进行选择以便产生可目测辨别的图形。用于这类测定的优选的结合剂是抗体及其抗原结合片段。优选固定在膜上的抗体的量在约25ng-约1μg且更优选在约50ng-约500ng的范围。一般可以使用极小量的生物样品来进行这类试验。
当然，存在适用于本发明肿瘤蛋白质或结合剂的大量其它的测定方案。上述描述仅是典型的。例如，本领域技术人员显然可以方便地修改上述方案以便使用卵巢癌多肽检测与生物样品中的这类多肽结合的抗体。对这类卵巢癌蛋白质特异性抗体的检测可能与存在癌症相关。
还可以或另一方面以存在的与生物样品中的卵巢癌蛋白质发生特异性反应的T细胞为基础检测癌症。在某些方法中，用卵巢癌蛋白质、编码这类多肽的多核苷酸和/或表达至少一种这类多肽的免疫原性部分的APC培养包括分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品并检测存在或不存在T细胞的特异性激活。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可以通过常规技术从患者体内分离T细胞(诸如通过对外周血液淋巴细胞进行Ficoll/Hypaque密度梯度离心)。在37℃下，可以在体外用卵巢癌蛋白质(例如5-25μg/ml)将T细胞培养2-9天(一般为4天)。需要在没有卵巢癌蛋白质存在的情况下培养T细胞样品的另一等分试样用作对照。就CD4+T细胞而言，优选通过评价T细胞的增殖来检测激活情况。就CD8+T细胞而言，优选通过评价溶细胞活性来检测激活情况。增殖水平至少高于未患病患者2倍和/或溶细胞活性水平至少高于未患病患者20％表示患者体内存在癌症。
如上所述，还可以或另一方面以编码生物样品中的卵巢癌蛋白质的mRNA水平为基础检测癌症。例如，可以将至少两种寡核苷酸引物用于以聚合酶链反应(PCR)为基础的测定以便扩增来源于生物样品的卵巢癌蛋白质cDNA的一部分，其中至少一种寡核苷酸引物对编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸具有特异性(即与之杂交)。然后使用诸如凝胶电泳这样的本领域中众所周知的技术分离并检测扩增的cDNA。类似地，可以将与编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸探针用于杂交测定以便检测生物样品中存在的编码肿瘤蛋白质的多核苷酸。
为了在测定条件下进行杂交，寡核苷酸引物和探针应包括与编码至少10个核苷酸、且优选至少20个核苷酸长度的卵巢癌蛋白质的多核苷酸的一部分具有至少约60％、优选至少约75％且更优选至少约90％同一性的寡核苷酸序列。优选寡核苷酸引物和/或探针如上所述的，在中等严格条件下与编码本文所述的多肽的多核苷酸杂交。可有用地用于本文所述诊断方法的寡核苷酸引物和/或探针优选至少具有10-40个核苷酸的长度。在一个优选的实施方案中，所述的寡核苷酸引物包括具有本文所提供序列的至少10个连续的核苷酸、更优选至少15个连续的核苷酸的DNA分子。用于以PCR为基础的测定和杂交测定的技术在本领域中是众所周知的(例如，参见Mullis等人在美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)的《数量生物学专题论丛》(Symp.Quant.Biol.)51263，1987；Erlich编辑《PCR技术》(PCR Technology)，Stockton Press，NY，1989中所述)。
一种优选的测定使用RT-PCR，其中将PCR与反转录联用。一般来说，RNA提取自诸如活检组织这样的生物样品且将其反转录以便产生cDNA分子。使用至少一种特异性引物的PCR扩增生成cDNA分子，例如，可以使用凝胶电泳将其分离并观察。可以对取自试验患者和来自未患癌症的个体的生物样品进行扩增。可以对跨度为两个数量级的cDNA的几种稀释液进行扩增反应。一般将在试验患者样品的几种稀释液中的表达比非癌症样品的相同稀释液中的表达提高2倍或2倍以上的情况看作阳性。
在另一个实施方案中，可以将编码这类蛋白质的卵巢癌蛋白质和多核苷酸用作监测癌症的进展的标记。在本实施方案中，可以在一段时间内进行如上所述用于癌症诊断的测定并评价反应性多肽水平上的改变。例如，可以将本测定每24-72小时进行一次、持续6个月至1年的期限且此后根据需要进行。一般来说，癌症在那些由结合剂所检测的多肽水平在增加一段时间内的患者中有发展。相反，当反应性多肽水平随时间保持恒定或减少时，癌症没有发展。
可以直接对肿瘤进行某些体内诊断测定。一种这样的测定包括使肿瘤细胞与结合剂接触的步骤。然后可以通过报道基团直接或间接检测所结合的结合剂。还可以将这类结合剂用于组织学应用。另一方面，可以在这类应用中使用多核苷酸探针。
如上所述，为了改善敏感性，可以在给定的样品中检测多个卵巢癌蛋白质标记。显然可以在单一测定中合并使用对本文提供的不同蛋白质具有特异性的结合剂。此外，可以同时使用多个引物或探针。可以以常规实验为基础选择肿瘤蛋白质标记以便确定产生最佳敏感性的组合。此外或另一方面，可以将用于本文提供的肿瘤蛋白质的测定与用于其它已知肿瘤抗原的测定相结合。诊断试剂盒本发明进一步提供了用于上述任意诊断方法的试剂盒。这类试剂盒一般包括进行诊断测定所必需的两种或多种成分。成分可以是化合物、试剂、容器和/或器械。例如，试剂盒内的一种容器中可以含有与卵巢癌蛋白质特异性结合的单克隆抗体或其片段。可以如上所述将这类抗体或片段附着到固体物质上。一种或多种另外的容器中可以装有诸如试剂或缓冲液这样的用于测定的成分。这类试剂盒还可以或另一方面含有如上所述的检测试剂，该检测试剂含有适合于直接或间接检测抗体结合情况的报道基团。
另一方面，可以将试剂盒设计成可检测编码生物样品中卵巢癌蛋白质的mRNA的水平。这类试剂盒一般包括至少一种如上所述的寡核苷酸探针或引物，它们与编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸杂交。例如，可以在PCR或杂交测定中使用这类寡核苷酸。可以存在于这类试剂盒中的附加成分包括第二种寡核苷酸和/或诊断试剂或容器以有利于检测编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸。
提供下列实施例是为了说明而非限定的目的。
实施例实施例1有代表性卵巢癌蛋白质cDNAs的鉴定本实施例解释了编码卵巢癌蛋白质的cDNA分子的鉴定。
将抗-SCID小鼠血清(对来自携带晚期传代卵巢癌的SCID小鼠的血清产生的)预清除大肠杆菌和噬菌体抗原并以1∶200的稀释度用于血清学表达筛选中。使用定向RH寡脱氧胸苷引导的cDNA文库构建试剂盒和λScreen载体(Novagen)由SCID-衍生的人卵巢肿瘤(OV9334)制成所筛选的文库。使用噬菌体λ筛选。筛选了约400,000pfu的扩增的OV9334文库。
分离196个阳性克隆。附图1A-1S和SEQ ID NOs1-71中提供了某些看起来是新的序列。三种完全的插入序列如附图2A-2C中所示(SEQ IDNOs72-74)。附图15A-15EEE中提供了具有已知序列的其它克隆(SEQ IDNOs82-310)。数据库检索鉴定了下列基本上与附图15A-15EEE中提供的序列相同的序列。
使用显微排列技术进一步表征这些克隆以便测定不同肿瘤和正常组织内mRNA的表达水平。使用Synteni(Palo Alto，CA)显微排列、按照制造商的说明进行了这类分析。将PCR扩增产物排列在载物片上，其中各产物在排列中具有唯一的位置。mRNA提取自所检测的组织样品、将其反转录并产生荧光标记的cDNA探针。用标记的cDNA探针探测显微排列并扫描载物片以便测定荧光强度。使用Synteni氏提供的GEMtools软件分析数据。一种克隆(13695、也称作08E)的结果如附图3中所示。实施例2使用显微排列技术鉴定卵巢癌cDNAs本实施例解释了通过PCR扣除和显微排列分析来鉴定卵巢癌多核苷酸。使用Synteni(Palo Alto，CA)显微排列、按照制造商的说明(且基本上如Schena等人在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等人在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)来分析cDNAs显微排列的卵巢癌肿瘤特异性表达。
使用包括四种卵巢肿瘤(它们中的三种是转移瘤)的cDNA的试验者和cDNA型五种正常组织(肾上腺、肺、胰腺、脾和脑)的驱动者来进行PCR扣除。对从这种扣除中回收的cDNA片段进行DNA显微排列分析，其中将所述片段进行PCR扩增、粘附到嵌片上并与来源于人卵巢肿瘤和不同正常人组织的mRNAs的荧光标记探针杂交。在这种分析中，扫描载物片并测定荧光强度且使用Synteni的GEMtools软件分析数据。一般来说，将在肿瘤细胞中显示出表达至少增加5倍(相对于正常细胞而言)的序列看作卵巢肿瘤抗原。分析荧光结果并通过DNA测序和数据库检索以便确定所述序列的新颖性而进一步表征卵巢肿瘤中显示出表达增加的克隆。
使用这类测定法鉴定了属于人T-细胞白血病I型病毒癌蛋白质TAX(参见Jin等人，《细胞》(Cell)9381-91，1998)与称作骨粘连蛋白的胞外基质蛋白之间的剪接融合体的卵巢肿瘤抗原。剪接点序列存在于融合点上。附图4和SEQ ID NO75中提供了这种克隆的序列。还从这类测定法中独立地鉴定了未剪接和未改变的骨粘连蛋白。
将由本方法鉴定的其它克隆在本文中称作3f、6b、8e、8h、12c和12h。这些克隆的序列如附图5-9和SEQ ID NOs76-81中所示。如上所述进行显微排列分析并如附图10-14中所示。通过筛选卵巢肿瘤(SCID-衍生的)cDNA文库而获得包括克隆3f、6b、8e和12h的全长序列。这种2996个碱基对的序列(命名为0772P)如SEQ ID NO311中所示且编码的914个氨基酸的蛋白质序列如SEQ ID NO312中所示。PSORT分析表明1a型跨膜蛋白位于浆膜上。除上述序列中的某些外，这种筛选鉴定了下列序列



这种筛选进一步鉴定了本文称作21013、21003和21008的克隆0772P的多种形式。PSORT分析表明21003(SEQ ID NO386；翻译成SEQ ID NO389)和21008(SEQ ID NO387；翻译成SEQ ID NO390)代表0772P的1a型跨膜蛋白形式。21013(SEQ ID NO385；翻译成SEQ ID NO388)看起来是该蛋白质的截短形式且通过PSORT分析将其推断为分泌性蛋白。
另外的序列分析产生了08E的全长克隆(2627bp，与诺慎分析观察到的信息大小一致；SEQ ID NO391)。如下获得了这种核苷酸序列发现原始08E序列(Orig08Econs)与来自EST克隆(IMAGE#1987589)的序列有33个核苷酸重叠。这种克隆在原始08E序列的上游提供了1042个另外的核苷酸。对唯一EST和08E序列(ESTx08EPCR)使用引物、通过对由卵巢原发性肿瘤文库产生的多个PCR片段进行测序证实了EST与08E之间的连接键。当锚式PCR从卵巢肿瘤文库中产生全部终止于推定起始甲硫氨酸上游的几种克隆(锚式PCRcons)、而没有产生任何另外的序列信息时，进一步证实了全长情形。附图16表示说明全长08E序列中各部分序列位置的示意图。
可以由全长08E序列翻译两种蛋白质序列。就“a”(SEQ ID NO393)而言，它开始于推定的起始甲硫氨酸。第二种形式“b”(SEQ ID NO392)包括核苷酸序列5’端的27个另外的上游残基。
尽管本文已经为解释目的描述了本发明的具体实施方案，但是显然可以根据以上描述对其进行各种修改而不脱离本发明的实质和范围。因此，除所附的权利要求外，它们并不用来限定本发明。序列表概括SEQ ID NOs1-71是附图1A-1S中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs72-74是附图2A-2C中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO75是卵巢癌多核苷酸3g(附图4)。
SEQ ID NO76是卵巢癌多核苷酸3f(附图5)。
SEQ ID NO77是卵巢癌多核苷酸6b(附图6)。
SEQ ID NO78是卵巢癌多核苷酸8e(附图7A)。
SEQ ID NO79是卵巢癌多核苷酸8h(附图7B)。
SEQ ID NO80是卵巢癌多核苷酸12e(附图8)。
SEQ ID NO81是卵巢癌多核苷酸12h(附图9)。
SEQ ID NOs82-310是15A-15EEE中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO311是卵巢癌多核苷酸0772P的全长序列。
SEQ ID NO312是0772P氨基酸序列。
SEQ ID NOs313-384是卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs385-390代表0772P形式的序列。
SEQ ID NO391是卵巢癌多核苷酸08E的全长序列。
SEQ ID NOs392-393是由08E编码的蛋白质序列。
权利要求
1.一种分离的多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(b)上述多核苷酸的互补物。
2.一种根据权利要求1所述的多肽，其中所述的多肽包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(b)这类多核苷酸的互补物。
3.一种编码权利要求1所述多肽中至少5个氨基酸残基的分离的多核苷酸，该多核苷酸包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(b)上述多核苷酸的互补物。
4.一种根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码所述多肽的免疫原性部分。
5.一种根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387、391中任意一种描述的序列或任意上述序列的互补物。
6.一种与权利要求3所述多核苷酸互补的分离的多核苷酸。
7.一种包括权利要求3或权利要求6的多核苷酸的表达载体。
8.一种用权利要求7的表达载体转化或转染的宿主细胞。
9.一种包括权利要求1的多肽和生理上可接受的载体的药物组合物。
10.一种根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述的多肽包括由一种多核苷酸编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的序列。
11.一种包括权利要求1的多肽和一种非特异性免疫反应增强剂的疫苗。
12.一种根据权利要求11所述的疫苗，其中所述的多肽包括由一种多核苷酸编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的序列。
13.一种药物组合物，它包括(a)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列的组(i)以SEQ ID NOs1-81、319-331、359、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种生理上可接受的载体。
14.一种根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、319-331、359、385-387、391中任意一种描述的序列或任意上述序列的互补物。
15.一种疫苗，它包括(a)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种非特异性免疫反应增强剂。
16.一种根据权利要求15所述的疫苗，其中所述的多核苷酸包括以SEQID NOs1-81、319-331、359、385-387或391中任意一种描述的序列。
17.一种药物组合物，它包括(a)一种与卵巢癌蛋白质特异性结合的抗体，其中所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列的组(i)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种生理上可接受的载体。
18.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用有效量的活性剂和由此抑制患者体内卵巢癌发生的步骤，所述的活性剂选自下列物质组成的组(a)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；(b)一种编码如(a)中所述的多肽的多核苷酸；以及(c)一种与卵巢癌蛋白质特异性结合的抗体，所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物。
19.一种根据权利要求18所述的方法，其中所述的活性剂存在于权利要求9、13或17中任意一项所述的药物组合物内。
20.一种根据权利要求18所述的方法，其中所述的活性剂存在于权利要求11、15或18中任意一项所述的疫苗内。
21.一种包括至少一种权利要求1的多肽的融合蛋白。
22.一种编码权利要求21的融合蛋白的多核苷酸。
23.一种包括权利要求21的融合蛋白和生理上可接受的载体的药物组合物。
24.一种包括权利要求21的融合蛋白和非特异性免疫反应增强剂的疫苗。
25.一种包括权利要求22的多核苷酸和生理上可接受的载体的药物组合物。
26.一种包括权利要求22的多核苷酸和非特异性免疫反应增强剂的疫苗。
27.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用有效量的权利要求23或权利要求25的药物组合物的步骤。
28.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用有效量的权利要求24或权利要求26的疫苗的步骤。
29.一种药物组合物，它包括(a)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；以及(b)一种药物上可接受的载体或赋形剂。
30.一种疫苗，它包括(a)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种非特异性免疫反应增强剂。
31.一种疫苗，它包括(a)一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，它们被一种与卵巢癌蛋白质特异性结合的抗体所特异性结合，其中所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；以及(b)非特异性免疫反应增强剂。
32.一种根据权利要求30或权利要求31所述的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂是一种佐剂。
33.一种药物组合物，它包括(a)一种与卵巢癌多肽发生特异性反应的T细胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；以及(b)一种生理上可接受的载体。
34.一种疫苗，它包括(a)一种与卵巢癌多肽发生特异性反应的T细胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；以及(b)一种非特异性免疫反应增强剂。
35.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用有效量的权利要求29或权利要求33的药物组合物的步骤。
36.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用有效量的权利要求30、31或34中任意一项所述的疫苗的步骤。
37.一种用于刺激和/或扩充T细胞的方法，该方法包括使T细胞与下列物质接触的步骤(a)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)这类多核苷酸的互补物；以及(b)一种编码这类多肽的多核苷酸；和/或(c)在足以刺激和/或扩充T细胞的条件和时间下表达这类多肽的抗原呈递细胞。
38.一种根据权利要求37所述的方法，其中将所述的T细胞在扩充前克隆。
39.一种用于在哺乳动物体内刺激和/或扩充T细胞的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种药物组合物且由此在哺乳动物体内刺激和/或扩充T细胞的步骤，所述的药物组合物包括(a)下列物质中的一种或多种(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；以及(b)一种生理上可接受的载体或赋形剂。
40.一种用于在哺乳动物体内刺激和/或扩充T细胞的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种疫苗且由此在哺乳动物体内刺激和/或扩充T细胞的步骤，所述的疫苗包括(a)下列物质中的一种或多种(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱；其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；和(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；以及(b)一种非特异性免疫反应增强剂。
41.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括给患者施用按照权利要求39或权利要求40所述方法制备的T细胞的步骤。
42.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括下列步骤(a)用下列物质中的一种或多种培养分离自患者的CD4+T细胞(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；从而使T细胞增殖；和(b)给患者施用有效量的增殖的T细胞并由此抑制患者体内卵巢癌的发生。
43.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括下列步骤(a)用下列物质中的一种或多种培养分离自患者的CD4+T细胞(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；从而使T细胞增殖；(b)克隆一种或多种增殖的细胞；和(c)给患者施用有效量的克隆的T细胞。
44.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括下列步骤(a)用下列物质中的一种或多种培养分离自患者的CD8+T细胞(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；从而使T细胞增殖；和(b)给患者施用有效量的增殖的T细胞并由此抑制患者体内卵巢癌的发生。
45.一种用于抑制患者体内卵巢癌发生的方法，该方法包括下列步骤(a)用下列物质中的一种或多种培养分离自患者的CD8+T细胞(i)一种卵巢癌多肽，它包括至少一种卵巢癌蛋白质的免疫原性部分或在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的其变化形式，使得该变化形式与抗原特异性抗血清反应的能力基本上不会被削弱，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和这类多核苷酸的互补物；(ii)一种编码卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一种表达卵巢癌多肽的抗原呈递细胞；从而使T细胞增殖；(b)克隆一种或多种增殖的细胞；和(c)给患者施用有效量的克隆的T细胞。
46.一种用于鉴定分泌的肿瘤抗原的方法，该方法包括下列步骤(a)将肿瘤细胞植入免疫缺陷型哺乳动物体内；(b)在足以使肿瘤抗原分泌入血清的一定时间后从免疫缺陷型哺乳动物体内获得血清；(c)给免疫活性哺乳动物免疫接种该血清；(d)从免疫活性哺乳动物体内获得抗血清；和(e)用该抗血清筛选肿瘤表达文库且由此鉴定分泌的肿瘤抗原。
47.一种根据权利要求46所述的方法，其中所述的免疫缺陷型哺乳动物是SCID小鼠且其中所述的免疫活性哺乳动物是免疫活性小鼠。
48.一种用于鉴定分泌的卵巢癌抗原的方法，该方法包括下列步骤(a)将卵巢癌细胞植入SCID小鼠体内；(b)在足以使卵巢癌抗原分泌入血清的一定时间后从SCID小鼠体内获得血清；(c)给免疫活性小鼠免疫接种该血清；(d)从免疫活性小鼠体内获得抗血清；和(e)用该抗血清筛选卵巢癌表达文库且由此鉴定分泌的卵巢癌抗原。
49.一种用于确定患者体内存在或不存在癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)使获自患者的生物样品与结合卵巢癌蛋白质的结合剂接触，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；(b)检测样品中结合所述结合剂的多核苷酸的量；和(c)比较多核苷酸的量与预定的截断值且由此确定患者体内存在或不存在癌症。
50.一种根据权利要求49所述的方法，其中所述的结合剂是一种抗体。
51.一种根据权利要求50所述的方法，其中所述的抗体是一种单克隆抗体。
52.一种根据权利要求49所述的方法，其中所述的癌症是卵巢癌。
53.一种用于监测患者体内癌症发展的方法，该方法包括下列步骤(a)在第一时间点处使获自患者的生物样品与结合卵巢癌蛋白质的结合剂及时接触，其中卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；(b)检测样品中结合所述结合剂的多肽的量；和(c)在随后的时间点处及时使用获自患者的生物样品重复步骤(a)和(b)；并且(d)将步骤(c)中检测的多肽的量与步骤(b)中检测的量进行比较且由此监测患者体内癌症的发展情况。
54.一种根据权利要求53所述的方法，其中所述的结合剂是一种抗体。
55.一种根据权利要求54所述的方法，其中所述的抗体是一种单克隆抗体。
56.一种根据权利要求53所述的方法，其中所述的癌症是卵巢癌。
57.一种用于确定患者体内存在或不存在癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)使获自患者的生物样品和与编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触，其中所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；(b)检测样品中与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和(c)将与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量与预定的截断值进行比较且由此确定患者体内存在或不存在癌症。
58.一种根据权利要求57所述的方法，其中使用聚合酶链反应测定与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量。
59.一种根据权利要求57所述的方法，其中使用杂交测定法测定与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量。
60.一种用于监测患者体内癌症发展的方法，该方法包括下列步骤(a)使获自患者的生物样品和与编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触，其中所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；(b)检测样品中与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和(c)在随后的时间点处及时使用获自患者的生物样品重复步骤(a)和(b)；并且(d)将步骤(c)中检测的多核苷酸的量与步骤(b)中检测的量进行比较且由此监测患者体内癌症的发展情况。
61.一种根据权利要求60所述的方法，其中使用聚合酶链反应测定与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量。
62.一种根据权利要求60所述的方法，其中使用杂交测定法测定与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量。
63.一种诊断用试剂盒，它包括(a)一种或多种与卵巢癌蛋白质特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种包括报道基团的检测试剂。
64.一种根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述的抗体被固定在一种固体支持物上。
65.一种根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述的固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料物质。
66.一种根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述的检测试剂包括抗免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。
67.一种根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述的报道基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒组成的组。
68.一种诊断用试剂盒，它包括(a)一种包括在中等严格条件下与编码卵巢癌蛋白质的多核苷酸杂交的10-40个核苷酸的寡核苷酸，所述的卵巢癌蛋白质包括由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列选自下列序列组成的组(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一种描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互补物；以及(b)一种用于聚合酶链反应或杂交测定的诊断试剂。
全文摘要
本发明公开了用于治疗和诊断诸如卵巢癌这样的癌症的组合物和方法。组合物可以包括一种或多种卵巢癌蛋白质、其免疫原性部分、编码这类部分的多核苷酸或对这类蛋白质具有特异性的抗体或免疫系统细胞。例如,可以将这类组合物用于预防和治疗诸如卵巢癌这样的疾病。本发明进一步提供了用于鉴定选自卵巢癌和/或其它肿瘤的肿瘤抗原的方法。可以进一步将本文提供的多肽类和多核苷酸用于诊断和监测卵巢癌。
文档编号A61K35/76GK1333830SQ99815694
公开日2002年1月30日 申请日期1999年12月17日 优先权日1998年12月17日
发明者J·L·米特查姆, G·E·金, P·A·阿尔盖特, T·N·弗鲁达奇斯 申请人:科里克萨有限公司