专利名称：：一种简单的用可注射软骨细胞进行同源软骨细胞移植的方法
技术领域：
：本发明是关于通过注射来移植软骨治疗剂(Chondron:体外培养可用于同源软骨细胞移植的软骨细胞)的一种方法。更明确的说，本发明是一种移植软骨治疗剂的方法，包括混合并移植包含有血纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白等构成软骨的主要成分的基质，从而解决了传统的骨骨膜移植方法的不便，使治疗大范围软骨缺损及更严重的关节炎成为可能，这种简单的外科手术方法减轻病人的负担，更加迅速有效的促进了软骨的再生并使消费者更加满意。
背景技术：
：近来，众所周知分子生物学、细胞生物学、发育生物学和组织工程学在对损伤组织和器官的功能改进、维持和恢复方面，通过改进方法对提高人们的健康和生活水平作出了巨大的贡献。组织工程是通过控制细胞粘附力、细胞生长和细胞分化，分裂活性以及细胞基质间相互作用的生长因素来制造组织替代物从而分泌细胞内的信号传导物质。早期的组织工程工作主要只关注细胞的利用或者利用基质复合物制造细胞的细胞治疗，因此在应用上有很大的局限，所以发展更高级的组织替代物已成为迫切的需要，由此引发了利用软骨细胞和基质混合物来进行软骨治疗方法的发展。已经证明关节和半月板加速磨损以及关节表面的损伤都具有不稳定性。此外，关节软骨一旦损伤，在体内是不能完全再生的。损伤的关节软骨在慢性刺激下会引发关节痛并且进一步限制了关节的活动，最终导致更严重的退化性关节炎。软骨细胞在体内没有增生性，通过体外调节培养条件而实现分化增殖可有效的用于关节再生。结果，移植的软骨细胞获得了像正常关节软骨一样的组织和机械特性，并且大于90%的病人没有观察到移植排异和組织破坏。其中，同源软骨细胞移植(ACT)是一种有效的治疗关节软骨损伤的方法。其他传统治疗方法，例如磨损关节形成术、钻孔和微破裂、骨膜和软骨膜自体移植等是用不具备透明软骨的坚固特性的纤维软骨或纤维软骨组织替代损伤的关节软骨。不管用何种方法，与其他传统技术相比同源软骨细胞移植(ACT)最重要的优点就是使用了透明软骨。尽管有如此卓越的优势，同源软骨细胞移植技术依然受到技术和理论难点的限制，如图1所示首先，这种同源软骨细胞移植技术需要较大的外科切口用于收集骨膜。这种较大的切口会导致术后的剧烈疼痛并减少了膝部的运动性。第二、在软骨损伤区域的边界缝合骨膜补片需要非常复杂的外科技术，有报道称有时会导致骨膜过度增大和关节内粘联。缝合骨膜在引导同源软骨细胞移植的外科手术中是最耗时的程序。此外，再复原过程中，例如外科手术后的膝部练习时，可能会发生软骨细胞从移植位点的泄漏，移植的软骨细胞在移植位点呈液相，并且由于重力的作用停留在一侧，这会导致其不平均的分配和软骨的异类生长，这是同源软骨细胞移植的不利之处。为了解决以上问题，在利用具有生物降解性和生物兼容性的聚合物作为载体或手脚架方面进行了大量的研究。例如关于软骨的体内、体外的组织工程学大量研究被积极展开，利用自然形成的聚合物(例如胶原蛋白、透明酸和血纤维蛋白)作为生物材料，或者利用聚乳酸或聚乙醇酸等合成材料。手脚架通过保持气孔结构在细胞生长繁殖和软骨细胞显型方面起到非常重要的作用。正如上面所提到的，血纤维蛋白和透明酸是非常适合用于手脚架的材料。血纤维蛋白是自然产生的物质，是非常适合用于作为软骨细胞移植的生物载体。此外，曾有报道血纤维蛋白具有生物兼容性、生物降解性和结合软骨(在结构上临近软骨下方)的优点。而且血纤维蛋白能被很容易的改进成所需的形状用于注射。同时，透明酸是一种润滑剂，它被发现存在于润滑关节的液体中，行使控制关节内容物湿度的作用。然而，依然有一个问题存在。既然大部分用于组织工程的手脚架是固相的，例如补片、海绵体和薄片，用于组织工程治疗的软骨很难与其临近的自然软骨结合。这是一个非常重要的事实，软骨治疗在软骨损伤区域的移植使区域边界处不能完全彻底治愈。
发明内容本发明是提供一种通过注射来软骨治疗移植方法，以解决现有技术中等问题。因此，本发明的首要目的是通过混合并移植包含有血纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白等构成软骨的主要成分的基质，解决了传统的骨膜移植方法的不便。第二个目的是通过利用可注射的软骨治疗剂可迅速凝胶的特性(大约1-5分钟)，提供了一种方便的原位移植方法。第三本发明能够使移植位点与临近的自身软骨完全结合，因此可广泛用于各种软骨损伤以及严重的关节炎治疗。第四个目的是通过简单的外科手术减轻患者的负担。第五个目的是本发明可更加快速有效的促进软骨再生，从而通过简单的外科手术提高客户的满意度。根据本发明的一方面所述，上文所提及的目的可通过对同源软骨细胞移植可注射的软骨细胞来实现，包括用注射器的前端混合构成动物软骨主要成分的血纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白作为基质，并将其注入损伤的软骨区域。根据本发明的另一方面所述，对同源软骨细胞进行可注射的软骨细胞移植包括将1号瓶(红色)内的软骨细胞培养物lml放入lml灭菌注射器中，将注射器垂直插入装有白色或浅黄色血纤蛋白原冻干粉末的的2号瓶(蓝色)，并将软骨细胞培养物注入2号瓶；将注射器垂直插入3号瓶中，緩慢的将lml1号瓶(红色)中的细胞培养物(红色液体)注入含有白色冻干粉末(凝血酶)的3号瓶(红色，小瓶)中；用lml注射器从含有lml内容物的3号瓶(红色，小瓶)中收集0.1cc内容物，然后注入4号瓶(黄色)的底部；用lml灭菌注射器将两个小瓶中的软骨细胞悬浮物全部加入4号瓶(黄色)中，然后用注射器将其反复混合2-3次；确认2号瓶(蓝色)中的物质完全溶解后将其全部注入lml注射器中。将4号瓶(黄色)中混合好细胞治疗剂注入lml注射器中，将两支装满2号瓶(蓝色)和4号瓶(黄色)内容物的lml注射器置于固定的支架上，并将一个螺旋头置于注射器上，当要将最终混合物通过注射移植到动物损伤的软骨区域时，使用注射器前端的螺旋头混合注射器内的物质。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明通过混合并移植由软骨主要成分纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白组成的基质，解决了传统骨膜移植的不便之处；可广泛用于治疗软骨损伤和严重关节炎；通过简单的外科手术方法减轻患者负担；更加快速有效的促进软骨再生从而提高客户满意度。图1是移植软骨治疗剂常规方法的图片；图2是本发明移植可注射的软骨治疗剂方法的图片；图3是本发明移植软骨治疗剂方法的图片；图4是本发明通过注射器来移植可注射的软骨治疗剂方法的图片；图5是本发明所涉及的可注射软骨治疗剂的物理属性的图片；图6是本发明治疗的犬类软骨再生3个月的图片；图7是电子显樣t镜下软骨治疗剂移植8周后的图片；图8是电子显微镜下软骨治疗剂移植12周后的图片；图9是本发明治疗的犬类软骨再生12周的图片；图10是采用本发明的软骨治疗后的组织学检查结果的图片；图11是本发明的软骨治疗后的免疫组织学检查结果的图片。具体实施方式图2至12展示了本发明通过注射来进行软骨治疗剂移植的各个环节。本发明中与消费者或者制造者意图不同的用于解释功能的术语将被描述。因此，这里的术语是基于本发明整篇说明书来定义的。本发明的特征在于用注射器的前端混合构成动物软骨主要成分的血纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白作为基质，并将其注入损伤的软骨区域。就是说本发明可达到如下所述可注射的软骨治疗剂具有可迅速凝胶的特性(可注射的软骨治疗剂可在大约1-5分钟内形成胶体)使原位移植更加方便；能够使移植位点与临近的自身软骨完全结合，因此可广泛用于各种软骨损伤以及严重的关节炎治疗；通过简单的外科手术方法减轻了患者的负担；因此更加迅速有效的促进了软骨的再生。进一步说，依照下面的实施例，本发明提供了一种通过注射来移植软骨治疗剂的方法。在这个实施例中，实验采用动物(犬类)软骨细胞并按下面的顺序实施，三个月后进行实验结果评估。如图2所示1.将软骨损伤区域的异源组织边缘修剪整齐并测量尺寸，然后按下面步骤执行。2.将1号瓶(红色)的铝盖去掉，并将铝盖和瓶表面用70%乙醇洗涤。其中1号瓶(红色)含有淡红色的培养细胞悬浮物。(软骨细胞培养物+透明质酸+抑肽酶等)。3.将2号瓶(蓝色)的铝盖去掉，并将铝盖和瓶表面用70%乙醇洗涤。其中2号瓶(蓝色)是透明瓶含有白色或淡黄色的血纤蛋白原冻干粉末。4.将lml1号瓶(红色)中的内容物转移到lml无菌注射器中并将注射器针头插入垂直放置的2号瓶(蓝色)。其中，注射器内物质要直接注射至冻干粉末上，不要沿瓶内壁注射，其间要小心防止针头与冻干粉末接触。将2号瓶(蓝色)用手轻摇至2号瓶(蓝色)中的冻干粉末全部溶解。5.将3号瓶(红色、小瓶)的铝盖去掉，并将铝盖和瓶表面用70%乙醇洗涤。其中，3号瓶(红色、小瓶)是透明的含有白色冻干粉末(凝血酶)。6.将lml1号瓶(红色)中的溶液转移到注射器中并将注射器针头插入垂直放置的3号瓶(红色、小瓶)，然后逐渐注入红色液体。7.将4号瓶(黄色)的铝盖去掉，并将铝盖和瓶表面用70%乙醇洗涤，然后用lml注射器从含有lml内容物的3号瓶(红色、小瓶)中收集O.lcc内容物，并将其注入4号瓶(黄色)底部。8.用lml灭菌注射器将两个小瓶中的软骨细胞悬浮物全部加入4号瓶(黄色)中，然后用注射器将其反复混合2_3次。9.确认2号瓶(蓝色)中的物质完全溶解后将其全部注入lml注射器中。10.将4号瓶(黄色)中混合均匀的细胞治疗剂注入lml注射器中。11.将两支装满2号瓶(蓝色)和4号瓶(黄色)内容物的lml注射器分别置于固定的支架上。12.并将一个螺旋头置于注射器上，然后安装螺旋头和活塞支持物。13.装配完成后，开始移植。如果可能，尽量将软骨治疗剂一次注完，不要停止。14.移植完成5分钟后，将移植部位的异源组织边》彖^修建整齐。下面表1是本发明与传统同源软骨细胞移植的比较表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>无平均分配(由于液项中含有悬浮状态的细胞，重力作用可能产生局部软骨不平衡的再生)平均分配(由于具有1-5分钟内快速凝胶的特点，所以可表现出均一的软骨再生能力)缝合(在外科手术过程中是非常复杂耗时的步骤)无缝合操作时间长操作时间短通过流血产生纤维软骨用骨蜡控制流血(主要产生透明软骨)增加了柱状产生过程(见软骨治疗剂的组分及使用)移植无须考虑损伤形状不完全缝合减轻了细胞泄漏骨膜缝合减少了承受重量的时间其间，用于本发明的细胞培养基可由DMEM、Ham'sF-12、DMEM/F-12,IMDM、McCoy's5A培养基、MEMalpha画MEM、RPMI1640、Leibovitz,sL-15培养基和Eagle'sbasal培养基组成，这些都是常用培养基。血纤蛋白原冻干粉末的浓度最合适的范围是10mg/mL至200mg/mL。血纤蛋白原浓度低于10mg/mL将不能在基质中发挥其性能。反之，如果蛋白原浓度高于200mg/mL,将很难溶解，并且由于粘性很高将很难使用。所以，血纤蛋白原的首选浓度范围是10mg/mL至200mg/mL。此外，白色冻干粉末(凝血酶)的最适浓度范围是1IU/mL至200IU/mL。凝血酶的浓度低于1IU/mL将不会形成纤维蛋白，因此几分钟内将不会完成凝胶化。反之，凝血酶的浓度高于200IU/mL，在未混合前将迅速产生固化这对于可注射治疗剂的使用是不合适的。所以，凝血酶的首选浓度范围是1IU/mL至200IU/mL。此外，抑肽酶的最适浓度范围是100KIU/mL至20,000KIU/mL。抑肽酶浓度低于100KIU/mL，对于组织纤维蛋白分解无辅助作用。反之，抑肽酶浓度高于20,000KIU/mL将产生细胞毒素。所以抑肽酶的首选浓度范围是100KIU/mL至20,000KIU/mL。近一步说，透明质酸的最适用量范围是0.01%至2%(中量体积比)，透明质酸浓度低于0.01%将很难在基质中发挥其功能。反之，透明质酸浓度高于2%,结合纤维蛋白的能力将受到结构上影响，从而影响基质的强度和硬度。所以，透明质酸的首选浓度范围是0.01%至2%。更进一步说，2型胶原蛋白的最适用量范围是50巡/mL至lmg/mL。2型胶原蛋白的浓度低于50巡/mL,将很难充分发挥其功能。反之，2型胶原蛋白的浓度高于1mg/mL,结合纤维蛋白的能力将受到结构上影响，从而影响基质的强度和硬度。所以，2型胶原蛋白的首选浓度范围是50俾/mLto1mg/mL。以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思的的变化都应落入本实用新型的保护范围。权利要求1、一种用可注射软骨细胞进行同源软骨细胞移植的方法，其特征在于，包括当向软骨损伤区域注射基质时，用注射器前端的混合头混合构成动物软骨主要组分的纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白做为基质。2、一种用可注射软骨细胞进行同源软骨细胞移植的方法，其特征在于，包括将l号瓶(红色)内的软骨细胞培养物lml放入lml灭菌注射器中，将注射器垂直插入装有白色或浅黄色血纤蛋白原冻干粉末的的2号瓶(蓝色)，并将软骨细胞培养物注入2号瓶，血纤蛋白原的最终浓度范围是IOmg/mL至200mg/mL;将注射器垂直插入3号瓶(红色，小瓶)中，緩慢的将lmll号瓶(红色)中的细胞培养物(红色液体)注入含有白色冻干粉末(凝血酶)的3号瓶(红色，小瓶)中；用lml注射器从含有lml内容物的3号瓶(红色，小瓶)中收集0.1cc内容物，然后注入4号瓶(黄色)的底部，凝血酶的浓度范围是IU/mL至200IU/mL;用lml灭菌注射器将两个小瓶中的软骨细胞悬浮物全部加入4号瓶(黄色)中，然后用注射器将其反复混合2-3次；确认2号瓶(蓝色)中的物质完全溶解后将其全部注入lml注射器中；将4号瓶(黄色)中混合均匀的细胞治疗剂注入lml注射器中；将两支装满2号瓶(蓝色)和4号瓶(黄色)内容物的lml注射器置于固定的支架上，并将一个螺旋头置于注射器上，当要将最终混合物通过注射移植到动物损伤的软骨区域时，使用注射器前端的螺旋头混合注射器内的物质。3、如权利要求2所述一种用可注射软骨细胞进行同源软骨细胞移植的方法，其特征在于，注射步骤是通过用注射器针头进行注射，要将注射物质直接注入冻干粉末上，不要延瓶内壁注射，其间要小心防治针头与冻干粉末接触。4、如权利要求2所述一种用可注射软骨细胞进行同源软骨细胞移植的方法，其特征在于，l号瓶(红色)中的培养细胞含有0.01%至2%(W/V)的透明质酸，100至20，000KIU/mL的抑肽酶，50維/mL至lmg/mL2型胶原蛋白或其混合物。全文摘要本发明是关于一种用移植可注射软骨细胞来进行同源软骨细胞移植的方法。为此本发明提供了一种用移植可注射软骨细胞来进行同源软骨细胞移植的方法，包括当向软骨损伤区注射基质时，用注射器前端混合动物软骨细胞主要组分血纤维蛋白、透明质酸和胶原蛋白作为基质。进一步说，发明提供了一种用移植可注射软骨细胞来进行同源软骨细胞移植的方法，包括将1号瓶(红色)内的软骨细胞培养物1ml放入1ml灭菌注射器中，将注射器垂直插入装有白色或浅黄色血纤蛋白原冻干粉末的2号瓶(蓝色)，并将软骨细胞培养物注入2号瓶，纤维蛋白源的最终浓度范围是10mg/mL至200mg/mL；将注射器垂直插入3号瓶中，缓慢的将1ml1号瓶(红色)中的细胞培养物(红色液体)注入含有白色冻干粉末(凝血酶)的3号瓶(红色，小瓶)中；用1ml注射器从含有1ml内容物的3号瓶(红色，小瓶)中收集0.1cc内容物，然后注入4号瓶(黄色)的底部，凝血酶的浓度范围是IU/mL至200IU/mL；用1ml灭菌注射器将两个小瓶中的软骨细胞悬浮物全部加入4号瓶(黄色)中，然后用注射器将其反复混合2-3次；确认2号瓶(蓝色)中的物质完全溶解后将其全部注入1ml注射器中；将4号瓶(黄色)中混合好细胞治疗剂注入1ml注射器中，将两支装满2号瓶(蓝色)和4号瓶(黄色)内容物的1ml注射器置于固定的支架上，并将一个螺旋头置于注射器上，当要将最终混合物通过注射移植到动物损伤的软骨区域时，使用注射器前端的螺旋头混合注射器内的物质。文档编号A61K35/32GK101247815SQ200580051089公开日2008年8月20日申请日期2005年9月23日优先权日2005年7月20日发明者崔正龙,张在德,张晶皓,李恩永,金评敏,高畅权申请人:世源世龙股份有限公司