专利名称：一株生产柠檬酸的菌株及其发酵生产柠檬酸的方法
技术领域：
本发明涉及发酵技术领域，具体地说，涉及一株高温发酵生产柠檬酸的菌株以及利用该菌株发酵生产柠檬酸的方法。
背景技术：
黑曲霉属半知菌亚门、丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中ー个常见种，广泛分布于世界各地，是传统的制酱、酿酒、制醋的主要菌种，也是现代发酵エ业中重要的发酵エ业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等产品。天然柠檬酸在自然界中分布很广。在植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中都含有柠檬酸。1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸，通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。柠檬酸的生产方法有水果提取法、化学合成法和生物发酵法等。水果提取法是指从柠檬、桔子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取，成本较高，不利于エ业化生产，而化学合成法主要利用丙酮、ニ氯丙酮或こ烯酮，エ艺复杂、成本高，安全性低。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年C.韦默尔发现青霉(属)菌能积累柠檬酸。1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的エ厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大規模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。现在柠檬酸エ业中普遍采用的发酵温度为37°C，由于在发酵过程中产生大量的发酵热，使得夏季尤其是南方地区，发酵温度控制较为困难，降温水用量大，能耗高。迫切需要ー种能够有效降低降温水用量的生产柠檬酸的方法，以节约能耗。`
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够高温环境下发酵生产柠檬酸的菌株。本发明的另ー目的在于提供利用该菌株高温发酵生产柠檬酸的方法。本发明提供了一株能够发酵生产朽1檬酸的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株FYCA8561，其保藏编号为 CGMCC No. 6466。该菌株已于2012年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi1:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为黑曲霉，拉丁文名Aspergillus niger，保藏号为CGMCC No. 6466。本发明提供了含有黑曲霉菌株FYCA8561的菌剂。本发明还提供了黑曲霉菌株FYCA8561在利用淀粉质原料发酵生产柠檬酸中的应用。本发明提供ー种高温发酵生产柠檬酸的方法，含有以下步骤(I)将菌株FYCA8561经平板或斜面扩大培养；
(2)FYCA8561孢子接入麸曲种子培养基中，培养得到麸曲孢子；(3)将麸曲孢子接种于种子培养基中，培养种子；(4)将培养好的种子接入发酵培养基中进行高温发酵培养，发酵生产出柠檬酸发酵液，发酵液经过分离提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸結晶。其中，步骤(I)所述的平板或斜面为麦芽汁琼脂平板或麦芽汁斜面培养基。其中，步骤(2)所述的麸曲种子培养基为将麸皮按35% 45%的质量百分比用自来水配制，培养条件为36 40°C。进ー步地，步骤(2)的培养条件为36 38°C。更进ー步地，步骤(2)的培养条件为37°C。其中，步骤(3)所述的种子培养基为玉米粉按10% 15%的质量百分比用自来水配制，IL种子培养基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL进行液化后，使含糖量达到8% 12%，进入种子罐中灭菌。优选地，所述种子培养基中含糖为10%。其中，步骤⑶培养条件为36 40°C，通风培养20 30h。进ー步地，步骤⑶培养条件为36 38°C，通风培养22 26h。更进ー步地，步骤(3)培养条件为37°C，通风培养24h。其中，步骤⑷所述的发酵培养基为玉米粉按15% 20%的质量百分比用自来水配制；IL发酵培养基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL进行液化后，使含糖量达到13% 17%，在发酵培养基中添加质量百 分比0. 05% 0. 2%硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵条件为36 40°C，通风比为1: 0. 3 0. 5，搅拌转速为200 450r/min，培养时间60 90h。优选地，所述发酵培养基中含糖15%。进ー步地，步骤⑷的发酵条件为38 41 °C，通风比为1: 0. 3 0. 5，搅拌转速为250 350r/min，培养时间65 80h。更进一歩地，步骤(4)的发酵条件为40°C，通风比为1: 0. 3，搅拌转速为300r/min，培养时间72h。其中，步骤(4)的发酵液可以经过提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸結晶。本发明提供了ー种高温发酵生产柠檬酸的菌株，其为黑曲霉FYCA8561，此菌株已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 6466。并提供了采用该株黑曲霉为生产菌株高温液体发酵生产柠檬酸的方法。使用本发明中保藏的菌株及公开的发酵培养方法发酵生产朽1檬酸时，菌株性能稳定。300m3发酵罐64小时发酵产酸达到14. 7%,转化率95%，粮耗为1. 75T/T，与现有技术的发酵产酸率、转化率和生产周期相比，在上述各方面均取得了预料不到的技术效果，可望大規模用于生产，进一歩降低生产成本和周期、提高产率，并大幅度降低了降温用水量，节约能源，尤其在夏季高温季节优势特别突出，因而有重要的市场前景。
图1为黑曲霉FYCA8561菌株发酵温度为40°C时醪液HPLC色谱图。图2为黑曲霉菌株FYCA2358发酵温度为40°C时醪液HPLC色谱图。
图3为发酵罐发酵温度为37°C、40°C时降温水用量比较。
具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，本发明实施例包括说明书中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“ ％”，若未特别说明，是指质量百分比。实施例1菌株诱变和分离1、菌株驯化以黑曲霉FYCA2358(来自丰原发酵技术工程研究有限公司)为出发菌，经进行60Cov射线及亚硝基胍复合诱变获得一株柠檬酸高温液体发酵菌株。其诱变过程如下I)菌悬液的制备将出发菌株的孢子转接与麦芽汁斜面上于37°C培养7 8d，长好孢子后，用生理盐水将孢子洗下，转入小三角瓶中，用玻璃珠震荡打散，然后通过脱脂棉过滤，滤液即为单孢子悬浮液。2) 6tlCo Y射线诱变处理将黑曲霉的菌悬液IOml置于50ml比色管中，将该比色管置于6°Co Y射线下照射，剂量为1200Gy，照射后的孢子悬浮液梯度稀释，取0. 05ml涂平板。3)亚硝基胍诱变处理将亚硝基胍配制成0. lmg/ml的丙酮溶液，将孢子悬浮液0. 9ml于37°C恒温水浴中预热5min,加入0.1ml浓度的2mg/ml的亚硝基胍溶液,在水浴中保温处理30min,取出后以3000r/min离心分离,弃去上清液,用预先冷却的无菌生理盐水进行洗漆离心15次,用生理盐水定容至Iml后，进行平板分离。4)挑出目的菌落。成熟时菌落中央稍微隆起，出现绒毛状覆盖物；分生孢子梗短分生孢子头大，圆形黒色，老熟时开花状；次生小梗少，大部分不分枝，同时，对该菌株进行了生理生化鉴定，确定为黑曲霉。最终得到一株产柠檬酸的黑曲霉突变株FYCA8561，它能利用淀粉质原料在40°C发酵生产柠檬酸。该菌株已于2012年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi1:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为黑曲霉，拉丁文名Aspergillusniger，保藏号为CGMCCNo. 6466 o另保藏菌株FYCA8561于斜面试管中备用。实施例2麸曲瓶、种子罐、发酵罐不同的培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸影响利用黑曲霉FYCA8561进行发酵生产柠檬酸的步骤如下1.平板或斜面培养将柠檬酸产酸菌黑曲霉FYCA8561接种到麦芽汁琼脂平板上 培养；2.麸曲培养将培养后的柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561斜面上钩ー环孢子接入麸曲种子培养基中(配方为将麸皮按35%质量百分比用自来水配制，并灭菌)；在麸曲瓶中进行培养。3.种子培养种子培养基的配制玉米粉按10%的质量百分比用自来水配制。IL种子培养基中加a-淀粉酶0.2mL进行液化后，使含糖量达10%，置于种子罐中灭菌后。再于灭菌后的种子培养基中接入麸曲孢子，在种子罐中进行种子培养；4. 50L发酵罐发酵培养最后将培养好的种子罐液体种子接入发酵培养基中。本实施例的发酵培养基配方为玉米粉按15%的质量百分比用自来水配制；1L发酵培养基中加a-淀粉酶0.3mL进行液化后，使含糖量达到15 %，在发酵培养基中添加质量百分比0. 1%硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵通风比为1: 0.3，搅拌转速为300r/min。将柠檬酸菌种黑曲霉FYCA8561进行上述操作后，不同的培养温度对产酸影响见表I。表I不同的培养温度对黑曲霉FYCA8561产酸的影响
权利要求
1.一株黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 FYCA8561，其保藏编号为 CGMCC No. 6466。
2.含有权利要求1所述菌株FYCA8561的菌剂。
3.权利要求1所述的菌株FYCA8561在利用淀粉质原料发酵生产柠檬酸中的应用。
4.ー种高温发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于，含有以下步骤 (1)将权利要求1的菌株FYCA856经平板或斜面扩大培养； (2)FYCA856孢子接入麸曲种子培养基中，培养得到麸曲孢子； (3)将麸曲孢子接种于种子培养基中，培养种子； (4)将培养好的种子接入发酵培养基中进行高温发酵培养，发酵生产出柠檬酸发酵液，发酵液经过分离提取后得到无水柠檬酸或一水柠檬酸結晶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的平板或斜面为麦芽汁琼脂平板或麦芽汁斜面培养基。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的麸曲种子培养基为麸皮按35% 45%的质量百分比用自来水配制，培养条件为36 40°C。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的种子培养基为玉米粉按10% 15%的质量百分比用自来水配制，IL种子培养基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL进行液化后，使含糖量达到进入种子罐中灭菌。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)培养条件为36 40°C，通风培养20 30h。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的发酵培养基为玉米粉按15% -20%的质量百分比用自来水配制，IL发酵培养基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL进行液化后，使含糖量达到13% 17%，在发酵培养基中添加质量百分比0. 05% 0.2%硫酸铵的无机氮源，进入发酵罐灭菌后进行发酵，发酵条件为36 40°C，通风比为1: 0.3 0.5，搅拌转速为200 450r/min,培养时间60 90h。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中发酵温度为40°C，通风比为I 0. 3，搅拌转速为300r/min，培养时间72h。
全文摘要
本发明涉及一种高温液体发酵生产柠檬酸的黑曲霉菌株FYCA8561，其保藏编号为CGMCC.NO.No.6466，本发明还提供了利用该菌株发酵生产柠檬酸的方法，利用该方法生产的柠檬酸在发酵高峰期降温水需求量低、节约能源，尤其在夏季高温季节优势特别突出，能够显著降低降温水的使用量。
文档编号C12N1/14GK103045487SQ201210510660
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者李荣杰, 穆晓玲, 李维理, 常珠侠 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司