专利名称：一种柠檬酸生产发酵工艺的制作方法
一种柠檬酸生产发酵工艺技术领域
本发明提供了一种朽1檬酸生产发酵工艺。
背景技术：
柠檬酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，分子式C6H8O7 (无水物)，是一种广泛地应用于食品，医药和化工领域的有机酸。随着经济的发展，各行各业对柠檬酸的需求量将稳步上升，当然各企业面对的挑战与机遇也越来越多。
目前，柠檬酸生产主要有连续发酵和分批发酵。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程，由于柠檬酸发酵生产为好氧发酵，因此在连续培养过程中难以保证料液的先进先出性，从而降低营养的利用率；同时造成部分处于产酸旺盛期的黑曲霉菌种流失，而且连续发酵容易染菌，染菌后同时处理多个发酵罐非常麻烦。分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的发酵过程，但是，随着发酵的进行，发酵体系中总糖浓度逐渐降低，从而导致发酵系数低、周期长，能耗高、成本高，设备利用率低等。发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种柠檬酸生产发酵工艺一补料分批发酵，是在微生物分批发酵过程中，向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，采用本发明提高了菌种的利用率，糖酸转化率， 设备利用率，缩短了生产周期，降低了生产成本。
本发明主要是在柠檬酸发酵过程中，向发酵罐中补加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%-15%。其具体步骤为
(I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加氮源，消毒后接入生产菌孢子，进行种子液培养；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆打入发酵罐中，制备发酵培养基，并向其中加入酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液糖化，向其中添加糖蜜调整总糖和含氮量， 制得流加液；
(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，待发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
首先，将玉米液化液打入种子罐中，同时添加氮源，由于无机氮源可以被菌体快速吸收利用，而且价格相对便宜，所以本发明氮源采用无机氮源，例如硫酸铵。氮源的加入量为本领域的常规用量。添加氮源后按照本领域常规的技术进行消毒，然后接入生产菌孢子`进行种子液培养，生产菌孢子可以采用黑曲霉Co-827等，其接入量一般为每毫升种子液中接入70-80万个孢子。由于种子液种龄过大会降低接种后的产酸速率；种龄过小，导致接种后菌体生长期延长，从而延长整个发酵时间，所以本发明种子液种龄为28-30h。
制备发酵培养基时，以体积比计，过滤玉米液化液清液玉米液化液棉籽粉浆液豆柏粉浆=16 2 I 1，从而实现发酵液初始含氮量在110-120mg/100mL。发酵液初始含氮量过大会导致菌体生长过于旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，从而抑制发酵前期的产酸；过低又会导致菌体生长缓慢，甚至生长不良，降低产酸速率。另外，总糖过高则抑制菌体生长，总糖过低则菌体生长旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌体发酵前期产酸速率，因此，发酵培养基初始总糖浓度为20. 00-21. 50g/100mL。该步骤中的棉籽粉浆液和豆柏粉浆还可以提供生长因子如氨基酸、维生素和生物素等。本发明中棉籽粉浆液和豆柏粉浆液的质量分数控制在25%-30%之间。其质量分数过低会导致提供的生长因子不足，产酸代谢异常，出现后期产酸速率下降，发酵结束后发酵液残糖高，转化率降低；质量分数过高时， 既增加了生产成本，又导致后期菌体继续生长，不利于产酸和转化率的提高。
为了提高后期发酵液中氨基酸、小分子肽类物质的增加，有利于菌种快速的吸收利用氮源，加快菌种的生长与产酸，发酵培养基中加入酸性蛋白酶用于促进蛋白质的水解， 其添加量为每克干基添加10个酶单位的酸性蛋白酶。
为了提高菌种的利用率，提高糖酸转化率，本发明在发酵过程中补加流加液。本发明所述的流加液的制备过程为将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合后，糖化，然后向其中添加糖蜜调整总糖浓度为35-40g/100mL，含氮量为 45-50mg/100mL，制得流加液。含氮量过大或过小都会降低流加后的菌体产酸速率，因此，为了避免影响黑曲霉菌体的正常代谢，流加液的含氮量控制在45-50mg/100mL。流加液总糖浓度过低，则无法在理想程度范围内提高发酵产酸量，流加液总糖浓度过高，则使其粘稠度增加，增加制备难度，因此该过程中，糖蜜主要是用来提高流加液总糖浓度。由于糖蜜中含有灰分物质与过量的Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+等金属离子，不利于后期柠檬酸发酵，因此，在使用前需要采用黄血盐、粗柠檬酸等进行过滤处理。流加液中的主要成分玉米液化液和糖蜜，为后期发酵补充了氮源、碳源和生物素等营养物质。
将制备好的种子液移入发酵罐中开始发酵，本发明中加入的种子液的体积占总发酵液体积的11-13%，从而保证发酵液中菌球浓度达到38000-40000个/mL，使得发酵顺利进行。与现有技术相比，本发明中发酵可利用的总糖较现有技术提高了 10%以上，为了提高发酵指数，同时不降低转化率，通过实验证明发酵液中菌球数控制在38000-40000个/mL之间，即能保证较高的转化率，又能提高发酵指数，在较短的时间内结束发酵。低于38000个 /mL会降低发酵指数，高于40000个/mL会降低转化率，同时也增加了成本。待发酵30_32h 后，菌体生长期已经基本结束，且产酸速率出现下降趋势，因此，需要向发酵罐内流加流加液。补料过早，影响菌体生长，不利于产酸；补料过晚，菌体有衰亡趋势，也无法提高产酸。 流加体积过大，容易导致流加前后黑曲霉菌体周围生理环境变化过大，不利于黑曲霉菌体继续产酸；流加体积过小，就需要提高流加液的总糖浓度，从而提高了流加液的制备难度， 因此，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%-15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
综上所述，本发明具有以下有益效果
1、本发明通过流加技术，在发酵过程中补加流加液，即同时补充碳源、氮源和生物素等营养物质，既避免了高初糖浓度对柠檬酸发酵的抑制，又避免了发酵后期总糖浓度 过低，从而保证柠檬酸发酵持续高效进行，使发酵时间延长，提高菌种的利用率，延长了菌种的产酸时间，提高糖酸转化率与设备利用率，从而降低发酵成本。
2、与连续发酵相比，充分保证了发酵过程中营养物质的利用，避免了菌种的流失以及染菌。
具体实施方式
实施例1
一种柠檬酸生产发酵工艺，其具体步骤为
( I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积O. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为 28h ；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆按16 :2:1:1 的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为21. 50g/100mL，然后降温至37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜调整总糖浓度为37g/100mL，含氮量为45mg/100mL，制得流加液；
(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的 12%，发酵液中菌球浓度达到38000个/mL，通风发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵55h，产酸19. 93%，转化率101. 12%，发酵指数为3. 62g/L · h。
实施例2
一种柠檬酸生产发酵工艺，其具体步骤为
( I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积O. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为 29h ；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆按16 :2:1:1 的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为20. 50g/100mL，然后降温至37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜调整总糖浓度为35g/100mL，含氮量为50mg/100mL，制得流加液；
(4)将培养好的 种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的 13%，发酵液中菌球浓度达到38000个/mL，通风发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵56h，产酸20. 65%，转化率101. 82%，发酵指数为3. 69g/L · h。
实施例3
一种柠檬酸生产发酵工艺，其具体步骤为
( I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积O. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为 30h ；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆按16 :2:1:1 的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为20. 00g/100mL，然后降温至37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜调整总糖浓度为40g/100mL，含氮量为46mg/100mL，制得流加液；
(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的 11%，发酵液中菌球浓度达到38000个/mL，通风发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵57h，产酸21. 66%，转化率102. 22%，发酵指数为3. 80g/L · h。
实施例4
一种柠檬酸生产发酵工艺，其具体步骤为
(I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积O. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为28.5h ；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆按16 :2:1:1 的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为21. 00g/100mL，然后降温至37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜调整总糖浓度为36g/100mL，含氮量为47mg/100mL，制得流加液；
(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的11.5%，发酵液中菌球浓度达到38000个/mL，通风发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵60h，产酸22. 32%，转化率101. 55%，发酵指数为3. 72g/L · h。
实施例5
一种柠檬酸生产发酵工艺，其具体步骤为
( I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积0. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为29.5h ；
(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆按16 :2:1:1 的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为21. 50g/100mL，然后降温至37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按照体积比为6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜调整总糖浓度为38g/100mL，含氮量为48mg/100mL，制得流加液；
(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的12.5%，发酵液中菌球浓度达到38000个/mL，通风发酵30_32h后向发酵罐内流加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%_15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵62h，产酸22. 62%，转化率101. 75%，发酵指数为3. 65g/L · h。
比较例
目前的玉米粉分批发酵生产柠檬酸工艺， 其具体步骤为
(I)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加占培养基体积O. 025%的硫酸铵作为无机氮源，升温至121°C消毒30分钟，降温至37°C后接入孢子进行种子液培养，种子液种龄为 28h ；
(2)将过滤玉米液化清液和玉米液化液按3 I的体积比打入发酵罐中，开启搅拌使培养基混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，初始总糖浓度为21. 00g/100mL，然后降温至 37°C，加入每克干基10个酶单位的酸性蛋白酶；
(3)将培养好的种子液移入发酵罐中，种子液体积占总发酵体积的11%，使发酵液中菌球浓度达到30000个/mL，并保证通风，37 °C下发酵至发酵终了。
在此条件下，发酵54h，产酸18. 57%，转化率100. 12%，发酵指数为3. 44g/L · h。
表I本发明与现有技术指标对比
权利要求
1.一种柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于在柠檬酸发酵过程中，向发酵罐中补加流加液，流加液体积加入量为额定发酵体积的10%-15%。
2.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于其具体步骤为(1)将玉米液化液打入种子罐中，同时添加氮源，消毒后接入生产菌孢子，进行种子液培养；(2)将过滤玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉浆液和豆柏粉浆打入发酵罐中，制备发酵培养基，并向其中加入酸性蛋白酶；(3)将过滤玉米液化清液和玉米液化液糖化，向其中添加糖蜜调整总糖和含氮量，制得流加液；(4)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，待发酵30-32h后向发酵罐内流加流加液,流加液体积加入量为额定发酵体积的10%-15%，流加完毕后再次发酵至发酵终了。
3.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于步骤(I)所述种子液种龄为 28-30h。
4.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于以体积比计，步骤(2)中过滤玉米液化液清液玉米液化液棉籽粉浆液豆柏粉浆=16 2 I I;发酵培养基初始总糖浓度为 20. 00-21. 50g/100mL。
5.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于添加量为每克干基添加10个酶单位的酸性蛋白酶。
6.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于清液和玉米液化液的体积比为6-10:1。
7.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于糖浓度为 35-40g/100mL，含氮量为 45_50mg/100mL。
8.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于体积占总发酵液体积的11 -13 %。
9.根据权利要求2所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于液中菌球浓度为38000-40000个/ml。:步骤(2)中酸性蛋白酶的 :步骤(3)中过滤玉米液化 :步骤(3)所述的流加液总 :步骤(4)中加入的种子液 :步骤(4)中发酵初期发酵
全文摘要
本发明提供一种柠檬酸生产发酵工艺，其特点是在柠檬酸发酵过程中，向发酵罐中补加流加液。本发明通过补料分批发酵时流加高糖浓度的流加液提高了发酵产酸浓度，又避免了高初糖浓度对柠檬酸发酵的抑制。采用本发明后，不仅能提高发酵产酸浓度，而且能加快发酵生产强度、提高发酵糖酸转化率和设备利用率，进而提高了企业的经济效益，提升了企业的竞争力。
文档编号C12P7/48GK103060393SQ20121057474
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者寇光智, 李昌涛, 王有旭, 周一江, 周昊, 秦绪斌 申请人:日照金禾博源生化有限公司