专利名称：一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵工程领域，具体涉及高密度发酵生产谷胱甘肽的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(glutathione, GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。谷胱甘肽作为一种活性三肤，广泛存在于大多数动物、植物和微生物中，是生物体内最重要的一种非蛋白琉基化合物。谷胱甘肽分为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种，在生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，它在细胞内主要作为抗氧化剂、免疫增加剂和解毒剂参与了许多生理活动，对生物机体的生化防御体系起着重要作用。
生物体内谷胱甘肽的生成主要通过合成和还原两条途径谷胱甘肽生物合成由两步依靠三磷酸腺苷的酶促反应构成，首先谷氨酸和半胱氨酸在Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y -glutamylcysteine synthetase)催化下合成Y -谷氨酰半胱氨酸,合成的原料由细胞外转运或通过谷氨酰转肽酶反应而来，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase)作用下，Y -谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。而谷胱甘肽还原途径可由谷胱甘肽还原酶作用于氧化性谷胱甘肽(GSSG)而获得，参与还原作用的NADPH由磷酸戊糖途径而来。在正常生理情况下，反应主要向GSH方向进行，但GSH和GSSG这两种形态可以相互转化。自从谷胱甘肽被发现以来，它不仅作为试剂广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定中，并且已成为一种极其重要的生物化学药物。根据国外情报机构预测，谷胱甘肽作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，它的需求量正日益增大。随着谷胱甘肽的生理生化功能和性质被不断研究发现，人们对其在医药工业、食品工业、体育运动领域及有关生物研究领域上的兴趣将日益增长，对其需求量也将不断增加。所以，谷胱甘肽具有一个极其广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于运用高密度发酵生产谷胱甘肽，可以大幅度提高谷胱甘肽产量，并有效地降低发酵成本。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德毕赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)为发酵菌株,通过一级培养和二级培养后的二级种子接种于酵母培养基进行发酵培养，当发酵液OD达到100 200后，补加谷胱甘肽的前体氨基酸，控制发酵液中的碳源浓度在O. 01 O. 02mol/L,培养至48 64h为止。本发明选用巴斯德毕赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)进行优化培养。巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。所选用的巴斯德毕赤酵母其特征在于所要求的菌株为高产生物工程改造菌。
进一步在上述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法中，所述的一级培养和二级培养是指从新鲜斜面上挑取巴斯德毕赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)发酵菌株的菌体，接入装有50±5ml培养液的250ml摇瓶中，100±5rpm，32±2°C振荡培养10 12h ;再以10%的接种量将一级种子接入二级种子培养液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培养12 14h后得二级种子，所述的一、二级培养液均是本领域技术人员常用的菌种培养液。二级种子接入到酵母培养基的接种量为O. 5 5%。优选的接种量为1. 5%。接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例，接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物 合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。酵母培养基的碳源为葡萄糖、甲醇、糖蜜、麦芽汁、蔗糖中的至少一种，酵母培养基的氮源为酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一种酵母培养基的碳源优选的是糖蜜，酵母培养基的氮源优选的是蛋白胨。在酵母培养基中的发酵培养pH为5. O 8. 0，发酵培养温度为25 32°C。在酵母培养基中最优的发酵培养pH为6. 5，最优的发酵培养温度为30°C。谷胱甘肽的前体氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一种，优选的是L-半胱氨酸。与现有技术相比,本发明选用巴斯德毕赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)进行优化培养。巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。所选用的巴斯德毕赤酵母其特征在于所要求的菌株为高产生物工程改造菌。所以本方法能大幅度提高谷胱甘肽产量，并有效地降低发酵成本。
具体实施例方式为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步介绍，但需要说明的是，本发明所要求的保护的范围并不局限于实施例所表述的范围。实例I发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量O. 5 3. OM3,转速100 700rpm，pH7. 0，温度32°C，培养63h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为4. 32g/L。实例2发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1. 5% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量0. 5
3.0M3，转速100 700rpm，pH7. 0，温度32°C，发酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸，培养54h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为
4.81g/L。实例3发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将2. 5% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量O. 5 3. OM3,转速100 700rpm，pH7. O,温度32°C，发酵后期加入L-半胱氨酸，培养52h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为4. 53g/L。实例4发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1. 5% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量O. 5 3. 0M3，转速100 700rpm，pH6. 0，温度32°C，发酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培养55h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为5. 43g/L。实例5发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1. 5% (v/v)接种 量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量O. 5 3. 0M3，转速100 700rpm，pH6. 5，温度32°C，发酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培养55h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为5. 74g/L。实例6发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1. 5% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量0. 5 3. 0M3，转速100 700rpm，pH6. 5，温度30°C，发酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培养53h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为6. 33g/L。实例7发酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)经过一级、二级培养后,将1. 5% (v/v)接种量接种至含有糖蜜和蛋白胨的发酵培养基中，使用50升发酵罐进行培养发酵，风量0. 5
3.0M3，转速100 700rpm，pH6. 5，温度25°C，发酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培养55h，通过ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法测定发酵液中的谷胱甘肽含量，结果谷胱甘肽产率为5. 84g/L。
权利要求
1.一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于包括以巴斯德毕赤酵母 (Pichia. pastoris SL1220)为发酵菌株，通过一级培养和二级培养后的二级种子接种于酵母培养基进行发酵培养，当发酵液OD达到100 200后，补加谷胱甘肽的前体氨基酸，控制发酵液中的碳源浓度在O. 01 O. 02mol/L，培养至48 64h为止。
2.根据权利要求1所述的高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的一级培养和二级培养是指从新鲜斜面上挑取巴斯德毕赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)发酵菌株的菌体，接入装有50±5ml培养液的250ml摇瓶中，100±5rpm，32±2°C振荡培养10 12h ;再以10%的接种量将一级种子接入二级种子培养液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培养12 14h后得二级种子。
3.根据权利要求2所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于二级种子接入到酵母培养基的接种量为O. 5 5%。
4.根据权利要求3所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于优选的接种量为1. 5%ο
5.根据权利要求3所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培养基的碳源为葡萄糖、甲醇、糖蜜、麦芽汁、蔗糖中的至少一种，酵母培养基的氮源为酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一种。
6.根据权利要求5所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培养基的碳源优选的是糖蜜，酵母培养基的氮源优选的是蛋白胨。
7.根据权利要求3所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培养基中的发酵培养pH为5. O 8. 0，发酵培养温度为25 32°C。
8.根据权利要求7所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培养基中的发酵培养pH为6. 5,发酵培养温度为30°C。
9.根据权利要求3所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前体氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一种。
10.根据权利要求9所述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前体氨基酸是L-半胱氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris SL1220)为发酵菌株，通过一级培养和二级培养后的二级种子接种于酵母培养基进行发酵培养，当发酵液OD达到100～200后，补加谷胱甘肽的前体氨基酸，控制发酵液中的碳源浓度在0.01～0.02mol/L，培养至48～64h为止。本方法能大幅度提高谷胱甘肽产量，并有效地降低发酵成本。
文档编号C12R1/84GK103014104SQ201210574778
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者朱义福, 周新荣, 吴平刚, 黄健华 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司