一种高密度发酵多杀菌素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种高密度发酵多杀菌素的方法。本发明提供了培养真核微生物的方法包括通过菌种的诱变和基因筛选、培养基改进、发酵工艺的精确调控和改进以及提取工艺的改进，使得多杀菌素的发酵效价可以达到6500mg/L以上，多杀菌素纯度可以达到98％。
【专利说明】一种高密度发酵多杀菌素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，涉及一种高密度发酵多杀菌素的方法
【背景技术】
[0002]多杀菌素是一种新型的绿色光谱生物杀虫剂属于微生物源生物化学农药，多杀菌素兼有生物农药的安全性和化学农药的快速效果，喷药后当天即可见效，中国和美国农业部登记的安全采收期都只是一天，最适合无公害蔬菜的生产已被广泛用于农业害虫与动物寄生虫防治，成为目前国际上最具发展前景的生物杀虫剂。，因其低毒、低残留、对昆虫的天敌安全，自然分解快而获得连续三次获得美国"总统绿色化学品挑战奖"。多杀菌素有很多优点:在日益注重环保和安全意识的今天，多杀菌素作为一种优质的绿色生物农药，有着巨大的发展和应用前景。目前多杀菌素生产主要采用生物发酵的方法，使用传统的自然选育，诱变育种等多种方法对多杀菌素产量的提高相对有限。多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌发酵生产，多杀菌素分子结构中的两个糖基，即鼠李糖及福勒糖胺，它们有共同的前体NDP-4-酮-6脱氧-D-葡萄糖。该共同前体的合成步骤是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤。并且该NDP-4-酮-6脱氧-D-葡萄糖合成酶基因和NDP-葡糖糖还原酶基因与刺糖多孢菌细胞壁中鼠李糖合成共用一套基因，不在多杀菌素基因簇中。陶氏益农公司通过同源探针，倍增了这个共同前体的整个cosmid合成基因，在野生菌株的基础上，多杀菌素的产量有了显著的提高，多杀菌素具有降解完全，对哺乳动物、鸟类、鱼类甚至大多数益虫具有宽广的安全界限。多杀菌素选择毒性比高于其他常用农药，比阿维菌素大300-400倍。
[0003]目前，制约多杀菌素实现产业化和广泛推广应用的主要问题在于发酵工艺和发酵液中的多杀菌素效价偏低；主要原因:菌种没有筛选，菌种退化严重；发酵培养基效果不佳，同时刺糖多孢菌发酵过程中菌体呈丝状增长，且多杀菌素的生物合成需要脂肪酸作为前体，发酵生产中常添加一定的油脂、糖和其他物质等其他物质，由于发酵调控工艺过于简单，导致菌体发酵液十分粘稠，造成供氧不足，无法满足工业化生产.
【发明内容】
[0004]1、发酵时间的缩短
[0005]2、采用稀料配方，大大减低了发酵液的粘稠度，增加了发酵液的溶氧效果，从而对空气设备及电机耗能减少，使发酵过程的能减低20以上
[0006]3、降低了糖的消耗
[0007]4、降低了发酵液中COD的含量
【具体实施方式】
[0008]下面用实例以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定
[0009]实例一:
[0010]1、下述实施例的菌种选用多杀菌素菌种:生产使用的菌种来源为母瓶富集液体培养基，发酵液培养3-5天，镜检无杂菌，菌体形态为粗壮，无断裂的情况，经过三批验证后，淀粉酶的活性高，孢子数量多的为工程菌株，采用工程菌种进行后续的发酵。
[0011]2、在51发酵罐中的一级种子培养基灭菌并冷却至311，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的多杀菌素菌种子接种到一级种子罐进行培养，接种量控制在31以内。一级种子培养过程中，一级种子培养条件30-341，罐压0.05-0.07^/(^2,通气量1.2-1.8^^111，邱为6-7之间，培养3-5天。种子培养前10小时，罐温控制在30-31。。，11小时至一级种子培养结束，罐温控制在32-331 ；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在8011)0以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少50%以上。
[0012]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度:葡萄糖208/1，黄豆粉108/1，棉籽粉58/1，酵母膏68凡，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.5〖凡，硫酸铵3〖凡，碳酸韩28凡，维生素81 6呢凡；维生素86 7呢凡；维生素8120.15呢/1，硫酸锰3呢/1，硫酸锌3.5呢凡钥酸钠0.02^/1,氯化钴0.04呢/1，硫酸亚铁消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2卯!II，培养基液体灭菌后的邱值为:6.0-6.8
[0013]在301发酵罐中的二级种子培养基灭菌并冷却至311，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8^！！！，邱为6-7.4之间，罐压0.05-0.071^/(^2 ；0~10小时，罐温控制在30-311，11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-331；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在8011)0以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0014]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖108/1，淀粉158/1，黄豆粉108/1，棉籽粉58/1，酵母膏68/1，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.5^/1,硫酸铵38凡，碳酸钙28凡，维生素816呢/1 ；维生素86 7呢/1；维生素812 0.15呢/1，硫酸锰3呢/1，硫酸锌3.5呢/1钥酸钠0.021118/1，氯化钴0.04呢凡，硫酸亚铁10呢凡，消泡剂:甲基环氧乙烧与环氧乙烧和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2卯III
[0015]在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖108/1，淀粉158/1，黄豆粉108/1，棉籽粉58凡，酵母膏68/1，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.5^/1,硫酸铵38/1，碳酸I丐2^/1,维生素81 6^/I ；维生素86 7111^/1 ；维生素812 0.15呢/1，硫酸锰3呢/1，硫酸锌3.5呢/1钥酸钠0.02^/[，氯化钴0.04呢/1，硫酸亚铁10呢/1，消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2卯III，培养基液体灭菌后的邱值为:6.0-6.8
[0016]在1001发酵罐中的三级种子培养基灭菌并冷却至311，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8^！！！，邱为6.8-7.2之间，罐压0.04-0.081^/(^2 ；0-10小时，罐温控制在30-31。。，11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-331 ；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制根据溶氧水平调整，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0017]发酵结果:发酵到216小时，细胞菌体浓度为43%，多杀菌素含量为7200ug/L。
[0018]实例二:
[0019]1、下述实施例的菌种选用多杀菌素菌种:生产使用的菌种来源为母瓶富集液体培养基，发酵液培养3-5天，镜检无杂菌，菌体形态为粗壮，无断裂的情况，经过三批验证后，淀粉酶的活性高，孢子数量多的为工程菌株，采用工程菌种进行后续的发酵。
[0020]2、在30L发酵罐中的一级种子培养基灭菌并冷却至31°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的多杀菌素菌种子接种到一级种子罐进行培养，接种量控制在3L以内。一级种子培养过程中，一级种子培养条件30-34°C，罐压0.05-0.07Kg/cm2，通气量1.2-1.8vvm，pH为6-7之间，培养3-5天。种子培养前10小时，罐温控制在30-31。。，11小时至一级种子培养结束，罐温控制在32-33°C ;搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在SOrpm以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少50%以上。
[0021]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度:葡萄糖20g/L，豆粉10g/L，棉籽粉5g/L，酵母膏6g/L，谷氨酸钠10g/L，磷酸二氢钾为1.5g/L，硫酸铵3g/L，碳酸钙2g/L，维生素BI 6mg/L;维生素B6 7mg/L ;维生素B12 0.15mg/L,硫酸猛3mg/L,硫酸锌3.5mg/L钥酸钠0.02mg/L,氯化钴0.04mg/L,硫酸亚铁10mg/L，消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2ppm，培养基液体灭菌后的PH值为:6.0-6.8
[0022]在200L发酵罐中的二级种子培养基灭菌并冷却至31 °C，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8vvm，pH为6-7.4之间，罐压0.05-0.07Kg/cm2 ；0-10小时，罐温控制在30_31°C，11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-33°C;搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在SOrpm以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0023]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖10g/L，淀粉15g/L，黄豆粉10g/L，棉籽粉5g/L，酵母膏6g/L，谷氨酸钠10g/L，磷酸二氢钾为1.5g/L，硫酸铵3g/L，碳酸钙2g/L，维生素B16mg/L ;维生素B6 7mg/L;维生素B12 0.15mg/L，硫酸锰3mg/L，硫酸锌3.5mg/L钥酸钠0.02mg/L,氯化钴0.04mg/L,硫酸亚铁10mg/L,消泡剂:甲基环氧乙烧与环氧乙烧和1,2,3-丙3三醇的混合物，用量为2ppm
[0024]在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖10g/L，淀粉15g/L，黄豆粉10g/L，棉籽粉5g/L，酵母膏6g/L,谷氨酸钠10g/L,磷酸二氢钾为1.5g/L,硫酸铵3g/L,碳酸I丐2g/L,维生素BI 6mg/L ;维生素B6 7mg/L ;维生素B12 0.15mg/L，硫酸猛3mg/L，硫酸锌3.5mg/L钥酸钠0.02mg/L，氯化钴0.04mg/L，硫酸亚铁10mg/L，消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2ppm，培养基液体灭菌后的pH值为:6.0-6.8
[0025]在2000L发酵罐中的三级种子培养基灭菌并冷却至31°C，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8vvm,pH为6.8-7.2之间，罐压0.04-0.081^/(^2 ；0-10小时，罐温控制在30-31。。，11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-331 ；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制根据溶氧水平调整，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0026]发酵结果:发酵到216小时，细胞菌体浓度为43%，多杀菌素含量为6500118/1。
[0027]实例三:
[0028]1、下述实施例的菌种选用多杀菌素菌种:生产使用的菌种来源为母瓶富集液体培养基，发酵液培养3-5天，镜检无杂菌，菌体形态为粗壮，无断裂的情况，经过三批验证后，淀粉酶的活性高，孢子数量多的为工程菌株，采用工程菌种进行后续的发酵。
[0029]2、在501发酵罐中的一级种子培养基灭菌并冷却至311，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的多杀菌素菌种子接种到一级种子罐进行培养，接种量控制在31以内。一级种子培养过程中，一级种子培养条件30-341，罐压0.05-0.07^/(^2,通气量1.2-1.8^^111，邱为6-7之间，培养3-5天。种子培养前10小时，罐温控制在30-31。。，11小时至一级种子培养结束，罐温控制在32-331 ；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在8011)0以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少50%以上。
[0030]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度:葡萄糖208/1，豆粉108/1，棉籽粉58/1，酵母膏68凡，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.58/1，硫酸铵如/1，碳酸钙况/1，维生素81 6呢/1；维生素86 7呢/1 ；维生素812 0.巧呢/[，硫酸猛308/[，硫酸锌3.巧呢/[钥酸钠0.021^/[，氯化钴0.041^/[，硫酸亚铁10呢/1，消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2卯!II，培养基液体灭菌后的邱值为:6.0-6.8
[0031]在5001发酵罐中的二级种子培养基灭菌并冷却至311，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8^！！！，邱为6-7.4之间，罐压0.05-0.071^/(^2 ；0~10小时，罐温控制在30-311，11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-331；搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制在8011)0以内，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0032]除非特别指出，在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖108/1，淀粉158/1，黄豆粉108/1，棉籽粉58/1，酵母膏68/1，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.5^/1,硫酸铵38凡，碳酸钙28凡，维生素816呢/1 ；维生素86 7呢/1；维生素812 0.15呢/1，硫酸锰3呢/1，硫酸锌3.5呢/1钥酸纳0.021118/1，氯化钴0.04呢凡，硫酸亚铁川呢/匕消泡剂:甲基环氧乙烧与环氧乙烧和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2卯III
[0033]在本文实施案例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中数字指出的目标浓度，二级种子培养基成分如下:葡萄糖108/1，淀粉158/1，黄豆粉108/1，棉籽粉58凡，酵母膏68/1，谷氨酸钠108/1，磷酸二氢钾为1.5^/1,硫酸铵38/1，碳酸I丐2^/1,维生素81 6^/I ；维生素86 7111^/1 ；维生素812 0.15呢/1，硫酸锰3呢/1，硫酸锌3.5呢/1钥酸钠0.02^/[，氯化钴0.04呢/1，硫酸亚铁10呢/1，消泡剂:甲基环氧乙烷与环氧乙烷和1，2，3-丙3三醇的混合物，用量为2ppm，培养基液体灭菌后的pH值为:6.0-6.8
[0034]在5000L发酵罐中的三级种子培养基灭菌并冷却至31°C，并用无菌空气保压，将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，，通气量1.2-1.8vvm,pH为6.8-7.2之间，罐压0.04-0.08Kg/cm2:0-10小时，罐温控制在30-31°C, 11小时至二级种子培养结束，罐温控制在32-33°C ;搅拌方式:0-10小时，采用气体自动翻动代替机械搅拌，11小时至一级种子培养过程中，启动机械搅拌，转速控制根据溶氧水平调整，在整个一级培养过程中的溶氧水平维持在至少40%以上。
[0035]发酵结果:发酵到216小时，细胞菌体浓度为43%，多杀菌素含量为6900ug/L。
【权利要求】
1.一种高密度发酵多杀菌素的方法，以放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa) CGMCC为发酵菌株，通过高密度发酵工艺，提高多杀菌素的发酵水平，其特征在于，包括以下步骤: . 1)种子培养:将保存在甘油管中的放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)CGMCC或斜面培养的放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) CGMCC接种到一种液体种子培养基中，一级种子培养条件30-34 °C，罐压0.05-0.07Kg/cm2，通气量.1.2-1.8vvm, pH为6_7之间，培养3_5天。二级种子培养条件28_30°C，发酵液中的溶氧水平维持在至少50%以上，罐压0.04-0.06Kg/cm2，通气量1.1-1.5vvm, pH为6-7.5之间，培养2-3天，发酵液中的溶氧水平维持在至少50%以上。 其中一二级液体种子培养基配方为:葡萄糖20-40g/L，黄豆粉10-15g/L，酵母膏.6-10g/L,谷氨酸钠5g/L-10g/L,磷酸二氢钾为1.5g/L_3g/L,硫酸铵3_5g/L,碳酸I丐2g/L_4g/L,维生素 BI 2mg/L-8mg/L ;维生素 B6 2mg/L_8mg/L ;维生素 B12 0.1-0.4mg/L。 .. 2)将二级液体种子移种到发酵培养基中培养,培养条件28-30°C,发酵液中的溶氧水平维持在至少50%以上，罐压0.04-0.06Kg/cm2，通气量1.1-1.5vvm, pH为6.8-7.2之间，培养2-3天，发酵液中的溶氧水平维持在至少30%以上。 .3)按照步骤二所述包括生物量高密度提高阶段和目的产物诱导阶段，其中高密度发酵阶段包括添加所述碳源和所述限制性营养源，该目的产物诱导阶段包括所述碳源，不加或很少加入所述限制性营养源以诱导产生营养源限制性条件，该条件可以诱导产生多杀菌素。 . 4)步骤二所述，发酵培养基配方: (a)向发酵培养基中添加碳源和限制性营养源，并是发酵液中的溶氧水平维持在至少.50%以上，pH保持在6-7.5之间。 (b)碳源为葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉、异丁醇、正丁醇或其组合，含量为30g/L-60g/L0 (c)氮源为酵母膏、酵母粉、黄豆粉、谷氨酸钠、棉籽粉、酪蛋白胨，含量为20g/-30g/L。 (d)植物油，为菜籽油、大豆油、棉籽油、葵花油，含量为5g/L-10g/L，植物油为改性的植物油，加入脂肪酶进行改性。 ((e)硫酸镁2g/L-5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L_4g/L,碳酸氢钠0.lg/L-0.6g/L,碳酸氢隹丐.0.lg/L-0.6g/L，氯化钠 2g/L-6g/L。 (f)维生素类营养源:维生素BI2mg/L-8mg/L ;维生素B6 2mg/L-8mg/L ;维生素B12.0.1-0.4mg/L。 (g)硫酸猛2mg/L-5mg/L,硫酸锌 3mg/L_7mg/L 钥酸钠 0.02mg/L-0.06mg/L,氯化钴.0.02mg/L-0.06mg/L,硫酸亚铁 5_15mg/L。
【文档编号】C12P19/62GK104388500SQ201410456028
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】张兰波, 葛勇 申请人:张兰波, 中北国技(北京)科技有限公司