专利名称：一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及毕赤酵母表达重组蛋白发酵液的分离纯化方法。
背景技术：
毕赤酵母表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点。目前该系统已经成为广泛用于重组蛋白的生产，如重组人血白蛋白及其融合蛋白，工业用酶等。随着毕赤酵母高密度发酵技术的成熟与发展，提高发酵密度已经成为提高蛋白表达量的一种重要策略，目前毕赤酵母发酵菌体含量可达总发酵液的40 50%，甚至更高，这为毕赤酵母总发酵液的固液分离提出了更高的要求，特别是在工业化生产过程中。目前 常用的毕赤酵母固液分离方法主要有板框压滤法、膜分离法、扩张床层析法、离心法等。板框压滤法主要采用板框压滤机，通过添加助滤剂降低过滤阻力实现粗分离的方法，具有回收率高、操作简便、成本低等优势，但该方法所用设备占地面积大、澄清度低、过滤效果不稳定、不易封闭操作，且需要添加复杂成分的助滤剂，不利于杂质控制；膜分离法是在20世纪初出现、在60年代后迅速崛起的一门新技术，用该方法进行毕赤酵母粗分离，澄清度较高，操作方便，易于自动化，但是需要将样品稀释3 4倍后操作，操作时间过长，剪切力偏大，不适用于不稳定蛋白的分离[郭振友等，中空纤维微孔滤膜(PVDF)在发酵行业生产中的应用，中国生物工程杂志，2004，24 (4)，81 85];扩张床层析法作为毕赤酵母初步分离方法，能够取代固液分离、浓缩和初步纯化等三步操作，具有提高效率、缩短操作时间等优点，目前已经在毕赤酵母的产业化生产中得到应用，但是该方法对设备要求高、投资大、成本高[Sumi A. et al Purification of recombinant human serum albumin efficientpurification using STREAMLINE,Bioseparation, 1999 ;8(1_5) :195 200];离心法是目前毕赤酵母最常用的固液分离方法，用不同的离心设备可以满足各种规模的分离要求，但是此法能耗偏大、周期长，回收率低，分离不彻底，往往需要稀释或者多次离心。因而迫切需要一种新型的固液分离方法，用于工业化生产。絮凝分离技术是通过添加絮凝剂，使溶液中的颗粒聚集，利用双电层的压缩和电荷的中和作用、桥连作用、沉淀物网捕作用等机理把溶液中的微小胶体、颗粒及悬浮物除去并分离的技术[郝少莉等，沉淀分离技术在蛋白质处理方面的应用，粮食与食品工业，2007，14(1)，20 22]。絮凝剂主要分为无机絮凝剂及高分子絮凝剂，常用的铁、铝无机絮凝剂及以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子类絮凝剂存在效果不好或有毒性等问题，故不宜采用。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，广泛存在于昆虫、虾、蟹壳动物外壳及真菌、藻类的细胞壁中。壳聚糖的化学名是I，4_2_胺基-2_脱氧-B-D-匍萄糖，因材料和制备方法的不同相对分子量从数十万到数百万不等。壳聚糖分子中含有大量的游离氨基，在适当条件下，能够表现出阳离子型聚电解质，因此具有强烈的絮凝作用，是一种很有发展前途的天然高分子絮凝剂。因其具有天然、无毒、无味等特性，壳聚糖被广泛应用于饮用水的净化、重金属回收、糖蜜及果汁的澄清等。在发酵产品絮凝方面，偶见采用壳聚糖作为絮凝剂进行微生物发酵小分子产品固液分离的报道，但是由于壳聚糖絮凝对于蛋白质有一定吸附作用，所以此方法未在毕赤酵母发酵液粗分离中得到广泛应用。张明政等公开了一种采用壳聚糖对苏云金芽孢杆菌发酵液进行絮凝的方法，添加
O.0025%壳聚糖，pH5. O 6. 0，温度30 35°C时，550rpm搅拌5min，可除去发酵液中大部分水及有色杂质，并使发酵液中的杀虫蛋白晶体和芽孢得到了很好地浓缩[张明政等，壳聚糖对BT发酵液的絮凝作用，中国生物防治，2009，25 (2)，133 137]。刘秉涛等公开了一种采用壳聚糖处理含蛋白废水的方法，添加O. 01 O. 02%的壳聚糖，PH为6. O时，进行絮凝，可以有效去除蛋白废水中的蛋白质，去除率可达95%以上。[刘秉涛等，壳聚糖对BT发酵液的絮凝作用，中国生物防治，2009，25 (2)，133 137]。王秋京等公开了一种采用壳聚糖去除大豆蛋白发酵液中的菌体的方法，结果显示·壳聚糖在PH值为4时絮凝效果最好，同时发酵液中的大豆多肽浓度没有显著降低。[王秋京等，壳聚糖对大豆蛋白发酵液的絮凝研究，大豆通报，2007，1(86)，21-24]。本发明采用壳聚糖为絮凝剂，通过控制溶液温度及pH值、絮凝剂添加量、亲水性有机溶剂添加量，形成了一种独特的适用于工业化生产的毕赤酵母发酵液的固液分离方法，提高了絮凝效率，大大降低了分离难度，减少了操作时间和成本，同时本发明的方法在保证目的蛋白高回收率的同时，对于高分子杂质蛋白的去除也具有较好的效果。
发明内容
本发明提供了一种全新的毕赤酵母发酵液的固液分离方法，能有效解决毕赤酵母高密度发酵液中菌体去除困难、固液分离成本高等问题。本发明通过以下技术方案解决上述问题一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，包括以下步骤I)提供一种溶有壳聚糖的溶液；2)将步骤I)的溶液与含有重组蛋白质发酵产物的毕赤酵母发酵液混合均匀；3)用碱性物质调节步骤2)所得混合液的pH值至6 12，搅拌使壳聚糖絮凝；4)将步骤3)所得溶液离心或过滤，获得含有重组蛋白质的溶液。其中，可采用本领域技术人员公知的方法配制步骤I)所述的溶有壳聚糖的溶液，例如，将壳聚糖溶于盐酸或醋酸后形成的壳聚糖的盐酸溶液或壳聚糖的醋酸溶液，或者将水溶性壳聚糖直接溶于水形成的溶液。其中，步骤I)进一步包括a)将一种亲水性有机溶剂加入到步骤I)所述的溶有壳聚糖的溶液中。亲水性有机溶剂与壳聚糖溶液的体积比为I : 9 I : 99，亲水性有机溶剂选自乙醇，正丙醇，异丙醇，或它们的混合物，优选乙醇。步骤2)所得混合液中壳聚糖的含量为O. 04% 1% (w/v, g/ml)。 步骤3)所述的碱性物质为氢氧化钠，碳酸钠，碳酸氢钠，或它们的混合物。pH值优选8 10。该步骤是在2°C 25°C，优选为5°C 15°C的温度下进行的。通过搅拌使壳聚糖絮凝，絮凝的壳聚糖交联菌体形成较大颗粒，最后通过过滤或离心去除颗粒，获得含有重组蛋白质的溶液。
所述重组蛋白质为重组人血白蛋白及其融合蛋白，优选重组人血白蛋白/白介素-I融合蛋白。本发明的优势在于，通过壳聚糖的絮凝作用，使菌体结成较大颗粒，更易实现固液分离，同时，添加少量亲水性有机溶剂可增加菌体分散度，提高蛋白回收率。与现有分离技术相比，本发明的方法分离时间短、分离成本低，操作可控范围宽，最后所得溶液澄清度高，更适于工业化生产。此外，本发明对于一些蛋白的高分子杂质具有明显的去除效果，可降低下游纯化工艺压力。
图I为实施例I所得上清液的HPLC分析结果。图2为实施例4所得上清液的HPLC分析结果。 图3为实施例7所得样品的HPLC分析结果。图4为在不同的壳聚糖含量下，菌体去除率及重组蛋白回收率比较图，其中，横坐标代表壳聚糖含量，纵坐标代表百分比，“- 代表重组蛋白回收率，“-■ 代表菌体去除率。
具体实施例方式实施例中菌体浓度P测定方法取Iml发酵液12000rpm离心15min，上清液过滤后进行HPLC分析，确定蛋白含量为C1，另取500ul发酵液，精确加入500ul纯化水混合均匀后，12000rpm离心15min，上清液过滤后进行HPLC分析，确定蛋白含量为C2，菌体浓度p =(Cr2C2)/(C1-C2) X 100%。实施例中蛋白总量计算方法为A1XVX (Ι-p)，其中V为发酵液体积。实施例中蛋白回收率计算方法为固液分离后上清液中蛋白总量/发酵液中蛋白总量X 100%。菌体去除率测定采用分光光度法，在600nm下分别测定发酵液和固液分离后上清液的OD值，菌体去除率为，发酵液和上清液的OD值之差与发酵液OD值的比值。实施例中采用安捷伦1200高效液相色谱进行高分子杂质含量测定，方法参考《中国药典》2010年版三部附录VI Q人血白蛋白多聚体测定方法。实施例I (对比例)采用自有菌种及发酵技术在100L发酵罐中进行重组人血白蛋白生产，测定发酵液的0D600为421，离心后检测上清液中目的蛋白含量C1为9. 5g/L，稀释后检测C2为3. 5g/L，计算菌体浓度P为41. 7 %。发酵结束后取400ml重组人血白蛋白发酵液(计算蛋白总量为2. 2g)，置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min,获得上清液210ml,检测上清液中蛋白含量为8. lg/L(蛋白总量为I. 70g)，高分子杂质含量为7. 5% (附图I中RT = 8. 853和9. 451两个杂质峰)，离心后发酵液0D600为22. 3，计算菌体去除率为94. 7%，蛋白回收率为77. 3%。实施例2将O. 176g壳聚糖溶于39. 6ml I %的醋酸溶液中，接着加入O. 4ml无水乙醇，搅拌均匀，然后加入到实施例I中所述400ml重组人血白蛋白发酵液中，控制操作温度15°C，搅拌30min，加入碳酸氢钠，调节pH至9. 5，搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min，获得上清液250ml，检测上清液中蛋白含量为7. 06g/L(蛋白总量为I. 765g)，高分子杂质含量为3. O %，离心后发酵液0D600为2. 8，计算菌体去除率为99. 3 %，蛋白回收率为80. 2 %。实施例3将O. 44g壳聚糖溶于40ml I %的醋酸溶液中，然后加入到实施例I中所述400ml重组人血白蛋白发酵液中，控制操作温度15°C，搅拌30min，加入碳酸钠，调节pH至8. 5，搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min,获得上清液250ml，检测上清液中蛋白含量为7. 2g/L(蛋白总量为I. 8g)，高分子杂质含量为3. 3 %，离心后发酵液0D600为I. I，计算菌体去除率为99. 7%，蛋白回收率为81. 8 %。
实施例4将O. 44g壳聚糖加入到38ml I %的醋酸溶液中，接着加入2ml无水乙醇，搅拌混匀，然后加入到实施例I中所述400ml重组人血白蛋白发酵液中，控制操作温度15°C，搅拌30min,加入碳酸钠,调节pH至8. 5,搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min,获得上清液250ml，检测上清液中蛋白含量为7. 5g/L(蛋白总量为I. 875g)，高分子杂质含量为3. I % (附图2RT = 8. 866及9. 447两个杂质峰)，离心后发酵液0D600为I. 2，计算菌体去除率为99. 7%，蛋白回收率为85. 2%。实施例5将2. 2g壳聚糖溶于36ml I %的醋酸溶液中，接着加入4ml异丙醇，搅拌混匀，然后加入到实施例I中所述400ml重组人血白蛋白发酵液中，控制操作温度5°C，搅拌30min，加入碳酸钠，调节PH至8. O，搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min,获得上清液245ml，检测上清液中蛋白含量为7. 8g/L(蛋白总量为I. 91g)，高分子杂质含量为2.8%，离心后发酵液00600为1.0，计算菌体去除率为99.8%，蛋白回收率为86.9%。实施例6将4. 4g壳聚糖溶于38ml O. 5 %的盐酸溶液中，接着加入2ml无水乙醇,搅拌混匀，然后加入到实施例I中所述400ml重组人血白蛋白发酵液中，控制操作温度10°C，搅拌30min,加入碳酸钠,调节pH至10,搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min,获得上清液240ml，检测上清液中蛋白含量为8. Og/L (蛋白总量为I. 92g)，高分子杂质含量为2. 7%，离心后发酵液0D600为I. O，计算菌体去除率为99. 8%，蛋白回收率为87. 3 %。实施例7将实施例5获得的含有重组人血白蛋白的上清液按照CN201010154987. 4公开的方法进行纯化操作，获得重组人血白蛋白浓缩液，采用HPLC方法分析其纯度为99. 6% (附图3, RT = 14. 808),宿主蛋白< O. Olppm,用硫酸苯酹法分析壳聚糖残留不高于O. 2%。结果表明，本发明可以有效的除去菌体，且经过下游纯化操作，可以获得高质量的重组蛋白，加入的壳聚糖分子也很容易去除。实施例8构建表达重组人血白蛋白/白介素-I融合蛋白的重组酵母生产菌株，在100L发酵罐中进行发酵，获得含有重组人血白蛋白/白介素-I融合蛋白的发酵液，测定发酵液的0D600为330，高分子杂质含量为6 %，上清液中目的蛋白含量C1为O. 2g/L，稀释后检测蛋白含量C2为O. 082g/L,计算菌体浓度为30. 5 %。将2. 2g水溶性壳聚糖溶于38ml纯化水中，接着加入2ml无水乙醇，搅拌混匀，然后加入到上述400ml含有重组人血白蛋白/白介素-I融合蛋白的发酵液中(目的蛋白总量55. 6mg)，控制操作温度15°C，搅拌30min，加入碳酸钠，调节pH至8. 5，搅拌使壳聚糖絮凝。
将上述混合液置于离心杯中，在4°C下在Beckman离心机中IOOOOrpm离心5min，获得上清液275ml，检测上清液中蛋白含量为O. 17g/L(蛋白总量为46. 75mg)，高分子杂质含量为2.0%，离心后发酵液00600为I. 2，计算菌体去除率为99.6%，蛋白回收率为84. 1%。实施例9采用自有菌种及发酵技术在5000L发酵罐中进行重组人血白蛋白生产，发酵结束后获得发酵液3800L，测定发酵液的0D600为450，高分子杂质含量为8. 4%，上清液中目的蛋白含量C1为9. 8g/L，稀释后检测C2为3. 6g/L，计算发酵液中菌体浓度为41. 9%，发酵液中目的蛋白总量为21. 64kg。将41.81^壳聚糖溶于3611^ I %的醋酸溶液中，接着加入19L无水乙醇，搅拌混匀，将3800L壳聚糖溶液转入上述重组人血白蛋白发酵液中，控制发酵罐温度15 °C，搅拌30min，加入碳酸氢钠，调节pH至9. 5，搅拌使壳聚糖絮凝。将上述混合液加入I %硅藻土，混合均匀，开启输送泵，将发酵液泵入板框压滤机内去除去菌体，过滤完毕后通入压缩空气将板框中的残留液吹干，保持过滤压力不超过O. 5MPa。过滤后总计获得上清液2100L，检测上清液中蛋白含量为8. 6g/L(蛋白总量为18. 06kg)，高分子杂质含量为2. 5%，离心后发酵液0D600为3. 6，计算菌体去除率为99. 2%，蛋白回收率为83. 5%。实施例1-6和实施例8、9中各项参数检测结构见附表I。附表I壳聚糖浓度高分子杂质含蛋白回收率菌体去除率
(w/v) 量(%) (%)(%)
实施例 I 0% 7.5 77.394.722.3
实施例 2 0.04% 3.0 80 ^99.32.8
实施例 3 0.1% 3.3 81.899.71,1实施例 4 0 1/ 3.1 85.299.71,2实施例 5 0.5% 2.8 86.999.81.0实施例 6 1% 2.7 87.399.81.0实施例 8 0.5% ">υ 84.199.6P·实施例 9 1% I' 8 S99.23.6·从附表I的检测结果可知，通过在毕赤酵母发酵液中加入凝絮剂壳聚糖，可有效提高菌体去除率及目标蛋白的回收率，降低高分子杂质的含量。实施例3与实施例4的比较结果表明添加少量亲水性有机溶剂能提高蛋白回收率。
权利要求
1.一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，包括以下步骤 1)提供一种溶有壳聚糖的溶液； 2)将步骤I)的溶液与含有重组蛋白质发酵产物的毕赤酵母发酵液混合均匀； 3)用碱性物质调节步骤2)所得混合液的pH值至6 12，搅拌使壳聚糖絮凝； 4)将步骤3)所得溶液离心或过滤，获得含有重组蛋白质的溶液。
2.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，步骤I)所述的溶有壳聚糖的溶液选自壳聚糖的盐酸溶液，壳聚糖的醋酸溶液，或者将水溶性壳聚糖直接溶于水形成的溶液。
3.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，步骤I)进一步包括 a)将一种亲水性有机溶剂加入到步骤I)所述的溶有壳聚糖的溶液中。
4.根据权利要求3所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，所述亲水性有机溶剂与壳聚糖溶液的体积比为I : 9 I : 99。
5.根据权利要求3或4所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，所述亲水性有机溶剂选自乙醇，正丙醇，异丙醇，或它们的混合物，优选乙醇。
6.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，步骤2)所得混合液中壳聚糖的含量为O. 04% 1% (w/v, g/ml)。
7.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，所述的碱性物质选自氢氧化钠，碳酸钠，碳酸氢钠，或它们的混合物。
8.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，步骤3)所述PH值为8 10。
9.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，步骤3)是在2°C 25°C，优选为5°C 15 °C的温度下进行的。
10.根据权利要求I所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，所述重组蛋白质为重组人血白蛋白及其融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其特征在于，所述重组人血白蛋白及其融合蛋白为重组人血白蛋白/白介素-I融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种毕赤酵母发酵液的固液分离方法，其包括将壳聚糖溶液与毕赤酵母发酵液混合均匀，调节pH并搅拌，使壳聚糖在毕赤酵母发酵液中发生絮凝，最终通过离心或过滤方法去除菌体及高分子杂质，获得含有重组蛋白质的溶液。采用本发明公开的方法，使得毕赤酵母菌体去除率和重组蛋白回收率都有了显著提高，分离时间短，分离成本低，所得溶液澄清度高，更适合工业化生产。
文档编号C07K14/765GK102838655SQ201210322338
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者徐杰, 徐有富, 聂磊, 王海彬, 杨仲毅, 李丹, 张赛平, 徐期, 白骅 申请人:浙江海正药业股份有限公司