专利名称：一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法
技术领域：
本发明属于生物工程制备技术领域，涉及一种通过液态发酵和固态发酵制备高浓度枯草芽胞杆菌固态微生态制剂的工艺，特别是一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法。
背景技术：
动物微生态学是近20年来发展起来的新兴学科，它是研究正常微生物与动物体内环境，动物体与外界环境和正常微生物之间三者的相互关系，以动物体内微生态的平衡与失调等理论为核心的，具有细胞学水平和分子水平的生命科学，微生物作为活菌饲料添加剂是微生态学的又一发展，有关饲料行业的专家和营养学专家定义为微生态饲料添加剂是用已知有益的微生物经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人、畜安全有益的活菌制齐U，并用于饲料的添加剂，一般简称为微生态制剂，或简称为微生态，目前市售的微生态制 剂有液态和固态两种。中国农业部于1999年6月公布了 12种可直接饲喂动物的饲料级微生物菌种，枯草芽胞杆菌是其中之一。微生态制剂的质量标准通常是以单位重量g或体积ml中活菌的数量来确定，有关具体的含量数量，除光合细菌外，其他益生菌均无部颁标准，一般只有企业标准，通常认为菌数越高，质量越好。现有的固态微生态制剂特别是枯草芽胞杆菌固态微生态制剂的方法通常有两种工艺技术方案，一种是先进行液态深层发酵，最后加入固态载体吸附，干燥而成；而液态发酵培养虽可得到较纯菌体，但成本高，发酵易受产物反馈控制，难以得到高浓度菌株，所以该方法有效菌数含量较低；另一种是常规固态发酵的模式；但现有的这些技术工艺方法普遍存在着工艺步骤复杂，制备成本高，产品收率低、杂菌含量高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种制备高浓度枯草芽胞杆菌固态微生态制剂的方法，先对枯草芽孢杆菌进行液态发酵至对数生长期，再配用同重量的固体发酵基质相混合，实现大剂量菌液接种，然后再次进行固体发酵而制得高浓度菌体制剂，称之为液固双重发酵法；枯草芽胞杆菌从海参肠道和周围生活环境中分离的在体外对海参腐皮综合症致病菌有拮抗作用的土著菌株，对海参腐皮综合症有针对性的作用，其应用有着非常广阔的市场。为了实现上述目的，本发明的主体工艺步骤包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个功能性过程，其具体工艺步骤包括(I)平板培养枯草保存菌种划线接种至平板培养基，其培养基配料为大豆蛋白胨3g, NaC120g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g,胰蛋白胨17g,琼脂15g,蒸懼水1000ml, pH值为 7，121°C灭菌，37°C培养 24h ；(2)试管接种取生长良好、菌落典型的菌株接种10ml，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养40h ；(3)三角瓶接种100ml，其培养基同步骤(2)，121°C灭菌，37°C培养36h ;(4)三角瓶接种1000ml，其培养基同步骤(3)；(5) IOL种子发酵罐，培养液7. 5L，培养基同步骤(3)，pH值为7，121°C灭菌30分钟，培养温度为37°C，时间为24h，转速150r/min，通气量O. 4vvm,指每分钟通入单位发酵体积m3的空气体积m3 ；(6) 100L种子发酵罐，培养液75L，培养基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，淀粉lg，30. 8mg/L的硫酸锰lg，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾I. 5g，硫酸镁O. 5g,酵母膏O. 2g，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，按步骤(5)方法培养；(7) 2000L发酵罐，培养液为1500L，培养基同步骤(6)，发酵方法同步骤(5)，培养36h ;得发酵液 (8)选择固体基质为豆柏粉1000kg，蒸煮灭菌，待冷却至35°C时，加入步骤(7)中的发酵液900kg，固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温40°C，通风，浅盘发酵36小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得产品高密度微生态制剂。本发明与现有技术相比，其制备工艺简单并易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，后加工成本低，生产环境友好。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I :制备IOOkg枯草芽胞杆菌微生态制剂(I)菌种平板培养枯草菌保存菌，划线平板培养，平板培养基；大豆蛋白胨3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养 24h ；(2)试管接种菌液10ml，培养基配制大豆蛋白胨3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养40h ；(3)三角瓶接种100ml，培养基及培养方法按照步骤(2)进行；(4)三角瓶接种IOOOmL,培养基及培养方法按照步骤(3)进行；(5)接种IOL种子发酵罐，培养液为7. 5L，培养基同步骤(4)，pH值为7，121。。灭菌，等温度降至37°C后接种菌种，培养温度37°C，时间24h，转速为150r/min，通气量为
O.4vvm ；(6) 200L种子发酵罐，接种发酵液100L，培养基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，淀粉Ig, 30. 8mg/L的硫酸猛Ig,磷酸氢二钾3g,磷酸二氢钾I. 5g,硫酸镁O. 5g,酵母膏O. 2g,氯化钠20g,水IOOOml的配比配制，121°C灭菌30min,通气量O. 4vvm,转速150r/min,温度37°C，时间24h ;培养制得液体发酵液；(7)固体基料豆柏粉100kg，通蒸汽，121°C灭菌30min，冷却至35°C;固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温40°c，通风，浅盘发酵36小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得枯草芽胞杆菌固态微生态制剂100kg，测得活菌浓度I. 8X109cfu/g。
实施例2 :培养5吨枯草芽胞杆菌固态微生态制剂(I)菌种平板培养枯草芽孢杆菌划线接种至平板培养基，其培养基配方为大豆蛋白胨3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养24h ；(2)试管接种菌液10ml，培养基配制大豆蛋白胨3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养40h ；(3)接种三角瓶100ml，培养基及培养方法按照步骤(2)进行；(4)接种三角瓶IOOOmL,培养基及培养方法按照步骤(3)进行；(5)接种IOL种子发酵罐，培养液为7. 5L，培养基同步骤(4)，pH值为7，121。。 灭菌，等温度降至37°C后接种菌种，培养温度37°C，时间24h，转速为150r/min，通气量为
O.4vvm ；(6)100L种子发酵罐，接种发酵液75L，培养基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，淀粉lg，30. 8mg/L的硫酸锰lg，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾I. 5g，硫酸镁O. 5g，酵母膏O. 2g，氯化钠20g，水IOOOml的配比配制，121°C灭菌30min，通气量O. 4vvm,转速150r/min，温度37°C，时间24h ;培养制得液体菌液；(7)10吨发酵罐，接种发酵液为5吨，培养基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，淀粉lg，30. 8mg/L的硫酸锰lg，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾I. 5g，硫酸镁O. 5g，酵母膏O. 2g，氯化钠20g，水IOOOml的配比配制，121°C灭菌30min，通气量O. 4vvm,转速150r/min，温度37°C，时间24h ;培养制得液体菌液；(8)固体基料豆柏粉5吨，通蒸汽，121°C灭菌30min，冷却至35°C ;固体基质重量与液体发酵液重量比约为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温40°C，通风，浅盘发酵36小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得枯草芽胞杆菌固态微生态制剂100kg，测得活菌浓度I. 7X109cfu/g。
权利要求
1.一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法，其特征在于包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个功能性过程，其具体工艺步骤包括 (1)平板培养枯草保存菌种划线接种至平板培养基，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaC120g,葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水IOOOml，pH值为7，121°C灭菌，37°C培养 24h ； (2)试管接种取生长良好、菌落典型的菌株接种10ml，其培养基配料为大豆蛋白胨3g, NaC120g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g,胰蛋白胨17g,琼脂15g,蒸懼水1000ml, pH值为 7，121°C灭菌，37°C培养 40h ； (3)三角瓶接种100ml，其培养基同步骤(2)，121°C灭菌，37°C培养36h； (4)三角瓶接种1000ml，其培养基同步骤(3)； (5 ) IOL种子发酵罐，培养液7. 5L，培养基同步骤(3 )，pH值为7，121°C灭菌30分钟，培养温度为37°C,时间为24h,转速150r/min,通气量O. 4vvm,指每分钟通入单位发酵体积m3的空气体积m3 ； (6)100L种子发酵罐，培养液75L，培养基按葡萄糖1.58，豆柏粉38，淀粉lg，30. 8mg/L的硫酸锰lg，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾I. 5g，硫酸镁O. 5g,酵母膏O. 2g，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，按步骤(5)方法培养； (7 ) 2000L发酵罐，培养液为1500L，培养基同步骤(6 )，发酵方法同步骤(5 )，培养36h ；得发酵液 (8)选择固体基质为豆柏粉1000kg，蒸煮灭菌，待冷却至35°C时，加入步骤(7)中的发酵液900kg，固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温40°C，通风，浅盘发酵36小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得产品高密度微生态制剂。
全文摘要
本发明属于生物工程制备技术领域，涉及一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法，包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个功能性过程，先对枯草芽孢杆菌进行液态发酵至对数生长期，再配用同重量的固体发酵基质相混合，实现大剂量菌液接种，然后再次进行固体发酵而制得高浓度菌体制剂，称之为液固双重发酵法；枯草芽胞杆菌从海参肠道和周围生活环境中分离的在体外对海参腐皮综合症致病菌有拮抗作用的土著菌株，对海参腐皮综合症有针对性的作用，其应用有着非常广阔的市场；其制备工艺简单并易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，加工成本低，生产环境友好。
文档编号C12N1/20GK102823716SQ20121033128
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月9日 优先权日2012年9月9日
发明者张 浩, 李超, 徐权汉, 夏伟 申请人:青岛中仁药业有限公司