专利名称：裂殖壶菌及其高密度发酵生产dha的方法
技术领域：
本发明涉及一种裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法，属于微生物应用技术领域。
背景技术：
二十二碳六烯酸(DHA，C22:6-4 , 1Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)是大脑、视网膜的重要结构物质，还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。长期以来，DHA的主要来源是从鲱鱼、鲭鱼、鲑鱼和鰛鱼等富含油脂的鱼类中提取出来的鱼油。鱼油带着浓烈的、难闻的、特征性的海腥味，其品质因提取鱼油所用的鱼种及捕捞季节和地点的不同而差异很大，还因环境污染而降低，在食品和医药中的应用因而受到严重限制。鱼油所含的脂肪酸很复杂，其链长和饱和度各不相同，从中提取和纯化DHA的成本很高。人 们因此需要寻找替代来源(Sijtsma L, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64:146 - 153)。裂殖壶菌无论在实验中还是商业上都是DHA的卓越生产者(Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003)。它不致病、不产毒，人类通过食物链中的贻贝和蛤直接摄食之，美国FDA将其列为公认安全级(GRAS,Generally Recognized asSafe)。自上个世纪90年代FAO和WHO等机构推荐在婴、幼儿食品配方中添加DHA以来，裂殖壶菌发酵生产DHA受到更加广泛的关注，技术水平不断提高。S. Iimacinum SR21 培养 5 d，DHA 生产率 0. 8 g/ (L · d) (Yokochi T, et al.Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72 - 76)。51. mangrovei Raghu Kumar 培养107 hr, DHA 生产率 0. 5 g/ (L · d) (Bowles R D, et al. J Biotechnol, 1999，70: 193-202)。一株5 mangrovei 培赛 hr，DHA 生产率 I. 27 g/(L *d) (Fan K ff, et al. JInd Microbiol Biotechnol, 2001, 70: 199 - 202)。S. aggregatum ATCC 28209 培养96 hr，DHA 生产率 3. 42 g/(L ·(!)(姜悦，等·中国专利 1218035C, 2005)。5 limacinum0UC88培养5 (1，0拟生产率1.65 g/(L*d)(张学成，等.中国专利1264967C, 2006)。S.limacinum G13/2S培养110 hr(葡萄糖初始浓度150 g/L，60 hr后再添加65 g/L)，DHA生产率 3 g/(L · d) (Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 - 1564)。S.WZU4771 培养 5 d，DHA 生产率 2. 76 g/(L .d)(赵肖为，等.中国专利 100503811C, 2009)。一株裂殖壶菌培养5 d (葡萄糖初始浓度125 g/L，降至10 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在10 20 g/L)，DHA生产率1.66 g/(L*d)(陈丽珠，等.厦门大学学报自然科学版，2009，48(1) : 84 - 88)。S. CCTCC M209059 在 5000 L 发酵罐中培养 5 d (葡萄糖初始浓度100 g/L，降至10 20 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在50 100 g/L)，DHA生产率2. 59 g/(L ·(!)(黄和，等.中国专利101575584B，2010);在1000 L发酵罐中培养132 hr (葡萄糖初始浓度40 g/L，降至15 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在15 40 g/L), DHA 生产率 2. 86 g/(L · d) (Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010)。S. limacinum ATCC 20888在500 L发酵罐中培养90 hr (葡萄糖初始浓度45 g/L，降至35 g/L时流加葡萄糖)，DHA生产率4.86 g/(L*d)(徐从英，等·中国专利101519676B，2011)。一株裂殖壶菌在8000 L发酵罐中培养5 d (葡萄糖初始浓度120 g/L，然后流加葡萄糖以维持其浓度在8 10 g/L)，DHA生产率6 g/(L · d)(钟惠昌，等.中国专利101812484B, 2012)。上述现有技术的DHA生产率虽然不断攀升，但还不够高，因此，DHA由裂殖壶菌发酵生产替代从鱼油中提取的关键在于进一步提高DHA生产率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中DHA生产率过低。为了解决上述技术问题，本发明提供一种裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法，进一步提高DHA生产率，以利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。本发明提供一株裂殖壶菌,所述菌株为裂殖壶菌sp. )WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。 上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法，包括如下步骤
1)种子活化a、将所述裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水山、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养；c、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养；d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种；
2)种子培养将步骤I)得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物；
3)发酵生产将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L ;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。优选地，步骤1)&中活化条件201 30°C活化2 6 d，更优选为25°C活化4CL优选地，步骤l)b中取步骤a得到的封盖海水以体积比5% 10%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。更优选地，步骤I) b中取步骤a得到的封盖海水以体积比5%的接种量转接入活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。优选地，步骤l)c中取步骤b得到的菌种液以体积比5% 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。更优选地，取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm,培养时间 48 hrο优选地，步骤l)d中取步骤c得到的菌种液以体积比5% 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。更优选地，取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm,培养时间 48 hrο优选地，步骤2)中将步骤I)所得活化菌种以体积比5% 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20°C 30°C，通气量5 50 L/min，搅拌转速250 450 rpm，培养时间24 60 hr，得种子培养物。更优选地，步骤2)中将步骤I)得到的活化菌种以体积比10%的接种量转接入种子培养基，培养温度25°C，通入无菌空气，通气量5 50 L/min，搅拌转速250 450 rpm，培养时间48 hr，得种子培养物。优选地，步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比5% 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。更优选地，步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比10%(v/v)的接种量转接入发酵培养基，发酵温度25°C，初始搅拌转速50 450 rpm，初始通气量5 450 L/min。流加葡萄糖以维持其浓度在5 10 g/L ;调节通气量和搅拌转速以控制DO值低于4% 10%。发酵60 64 hr放罐。优选地，步骤I)中所述活化培养基的配方10 30 g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制；更优选地，所述活化培养基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。优选地，步骤2)中所述种子培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母 粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3 g/L玉米浆，用人工海水配制；更优选地，所述种子培养基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米衆,用人工海水配制。优选地，步骤3)中所述发酵培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3 g/L玉米浆，营养液5 15 mL/L ;更优选地，所述发酵培养基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米衆,营养液10mL/L。其中，所述营养液的配方1.5 3. 5 11^凡肌醇、0.05 O. 15 11^凡硫胺素、0.05 O. 15 11^/1钴胺素、0.05 O. 15 11^/1泛酸钙、0.05 O. 15 11^/1烟酸、0.05 O. 15 mg/L核黄素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配制。优选地，所述人工海水由如下浓度的成分构成Na2SO4 24g/L、MgSO4 · 7H20 4 g/UK2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 I. 3 g/L、KCl I g/L、CaCl2 · 2H20 0. 34 g/L、FeSO4 · 7H20 20 mg/L、MnCl2 · 4H20 6 mg/L、ZnSO4 · 7H20 6 mg/L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 08 mg/L。本发明能够达到以下有益效果本发明以裂殖壶菌WZU6961高密度培养生产DHA，裂殖壶菌WZU6961经过多次充分活化后，转接入种子培养基培养，然后转接入发酵培养基发酵生产，得到的发酵液中生物量浓度92. 4 103.2 g/L，生物量中DHA含量20. 9% 21. 9%，DHA生产率达到7. 2 8. 5 g/ (L · d)，高于现有技术，有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
图I是裂殖壶菌种子培养的生长曲线；
图2是不同种龄的裂殖壶菌种子培养物的细胞形态(400 X )；
图3是裂殖壶菌流加发酵的生物量和DHA变化曲线。菌株的保藏
本发明的裂殖壶菌sp. )WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369，保藏日期为2012年7月20日。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。本发明的裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA的方法，包括如下步骤
I)种子活化a、将裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水，活化条件20°C 30°C活化2 6 d。b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养。具体步骤为，取步骤a得到的封盖海水以体积比5% 10%的接种量转接入新鲜的活化 培养基，培养温度20°C 30°C,培养时间24 48 hr。C、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养。具体步骤为，取步骤b得到的菌种液以体积比5% 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种。具体步骤为，取步骤c得到的菌种液以体积比5% 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。活化培养基的配方10 30 g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。2)种子培养将步骤I)得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物。具体步骤为，步骤2)中将步骤I)所得活化菌种以体积比5% 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20°C 30°C，通气量5 50 L/min，搅拌转速250 450 rpm，培养时间24 60 hr，得种子培养物。种子培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3 g/L玉米浆，用人工海水配制。3)发酵生产将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。具体步骤为，步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比5% 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L ;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。发酵培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3 g/L玉米浆，营养液5 15 mL/L，用人工海水配制，其中，营养液的配方1.5 3. 5 mg/L 肌醇、O. 05 O. 15 mg/L 硫胺素、O. 05 O. 15 mg/L 钻胺素、O. 05 O. 15 mg/L泛酸钙、O. 05 O. 15 mg/L烟酸、O. 05 O. 15 mg/L核黄素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配制。以下列举优选实施例以进一步对本发明进行说明。实施例I
a、将保藏于-70°C的裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加适量人工海水封盖，25°C活化4 d,得封盖海水。b、取步骤a得到的封盖海水以体积比5% (v/v)的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr ;c、取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr ;d、取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25°C，摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr,得活化菌种。其中，活化培养基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制。人工海水由如下浓度的成分构成Na2SO424g/L、MgSO4 · 7H20 4 g/L,K2H2PO4 2 g/U(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 I. 3 g/L、KCl I g/L、CaCl2 · 2H20 0. 34 g/L、FeSO4 · 7H20 20 mg/L、MnCl2 · 4H20 6 m g/L、ZnSO4 · 7H20 6 mg/L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 08 mg/L。本实施例中，裂殖壶菌WZU6961分离自浙江省乐清市雁荡山麓西门岛红树林，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。将活化菌种以体积比10%的接种量转接入5 L种子培养基，培养温度25°C，通入无菌空气，通气量5 L/min，搅拌转速450 rpm，培养，得种子培养物。其中，种子培养基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米衆,用人工海水配制。裂殖壶菌的种子培养物的生长曲线见图1，不同种龄的种子培养物的细胞形态见图2。由图I可以看出，种龄为24 32 hr的种子培养物进入对数期末期。但是，将种龄为24或32 hr的种子培养物转接入发酵培养基，发酵过程容易出现不稳定状态，生长情况经常异常。由图2可以看出，种龄为48 hr的种子培养物与种龄为24或32 hr的种子培养物的细胞形态明显不同，而种龄大于48 hr的种子培养物的细胞形态无明显变化。将种龄为48 hr的种子培养物转接入发酵培养基，其发酵过程非常稳定。因此，本实施例优选的种子培养物的种龄为48 hr。实施例2
将实施例I得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10% (v/v)的接种量转接入5L所述发酵培养基，发酵温度25°C，通入无菌空气，通气量5 L/min，搅拌转速450 rpm。其中，发酵培养基的配方10、20、30、40和50 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、
2g/L玉米浆，营养液10 mL/L，用人工海水配制。其中，营养液的配方I. 5 3.5 mg/L肌醇、O. 05 O. 15 mg/L 硫胺素、O. 05 O. 15 mg/L 钴胺素、O. 05 O. 15 mg/L 泛酸钙、O. 05 O. 15 mg/L烟酸、O. 05 O. 15 mg/L核黄素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配制。裂殖壶菌在不同葡萄糖浓度下的比生长速率列于表I。由表I可以看出，葡萄糖浓度对菌体生长具有抑制作用，低浓度葡萄糖更有利于菌体生长。表I葡萄糖浓度对裂殖壶菌生长的影响
葡萄糖浓度/g/L 比生长速率/hr—1ToO. 153—
20O. 149—
30O. 140—
40O. 133—
50|θ· 126—
考虑到生产过程中葡萄糖检测的实际问题，优选的葡萄糖维持浓度为5 10 g/L。实施例3
将实施例I得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10% (v/v)的接种量转接入5L发酵培养基(发酵培养基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆，营养液10 mL/L，用人工海水配制)，发酵温度25°C，通入无菌空气，初始通气量5L/min,初始搅拌转速450 rpm。当葡萄糖浓度降至10 g/L以下时,流加葡萄糖以维持其浓度在5 10 g/L。调节通气量和搅拌转速以控制DO值分别维持在4% 10%、10% 20%和
30% 40%ο裂殖壶菌在不同溶氧水平下的发酵结果列于表2。由表2可以看出，在不同溶氧水平下，发酵终止时生物量比较接近；随着DO值升高，发酵时间缩短，生物量中DHA含量下降，DHA生产率下降，说明高溶氧利于菌体生长而不利于DHA积累。表2溶氧水平对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响
权利要求
1.一株裂殖壶菌，其特征在于，该菌株为裂殖壶菌sp. )WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。
2.权利要求I所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法，其特征在于，包括如下步骤 O种子活化a、将所述裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水；b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养；c、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养；d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种； 2)种子培养将步骤I)得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物； 3)发酵生产将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L ;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤I)a中活化条件20°C 30°C活化2 6 cL
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤l)b中取步骤a得到的封盖海水以体积比5% 10%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48hr。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤l)c中取步骤b得到的菌种液体积比5% 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤l)d中取步骤c得到的菌种液体积比5% 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20°C 30°C，培养时间24 48 hr。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中将步骤I)所得活化菌种按体积比5% 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20°C 30°C，通气量5 50 L/min，搅拌转速250 450 rpm，培养时间24 60 hr，得种子培养物。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物按体积比5% 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 30 g/L ;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% 40%，发酵60 64 hr放罐，即得。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤I)中所述活化培养基的配方10 30g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制；步骤2)中所述种子培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3g/L玉米浆，用人工海水配制；步骤3)中所述发酵培养基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白胨、I 3 g/L玉米衆,营养液5 15 mL/L,其中,所述营养液的配方1.5 3. 5 11^凡肌醇、0.05 O. 15 11^凡硫胺素、0.05 O. 15 mg/L钴胺素、O. 05 O. 15 mg/L泛酸钙、O. 05 O. 15 mg/L烟酸、O. 05 O. 15 mg/L核黄素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配制。
10.根据权利要求2 9任一项所述的方法，其特征在于，所述人工海水由如下浓度的成分构成=Na2SO4 24g/L、MgS04 ·7Η20 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KC1 I g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 34 g/L,FeSO4 ·7Η20 20 mg/L,MnCl2 ·4Η20 6 mg/L、ZnSO4 ·7Η206mg/ L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20·0.08 mg/Lo
全文摘要
本发明公开了一株裂殖壶菌，该菌株为裂殖壶菌(Shizochytrium sp.)WZU6961，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6369。本发明还公开了上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法。以裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA，得到的发酵液中生物量浓度92.4~103.2g/L，生物量中DHA含量20.9%~21.9%，DHA生产率达到7.2~8.5g/(L·d)，高于现有技术，有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
文档编号C12N1/14GK102899254SQ20121033801
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者赵肖为, 周茂洪 申请人:温州大学