专利名称：一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用液相芯片的方法检测传染性喉气管炎病毒的方法。
背景技术：
传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由抱疫病毒科ct -抱疹病毒亚科传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的一种急性、接触性上呼吸道传染病，以呼吸困难、咳出血样粘液、喉部和气管黏膜水肿出血继而糜烂为主要特征。由于引起产蛋下降和鸡群死亡而造成严重的经济损失，并且该病可感染各种日龄和品种的鸡。本病通常突然暴发，并很快在鸡群中传播，感染率约为90% 100%，致死率5% 70%，一般在10 20%之间。May等1925年在美国首次报道该病，现已遍及世界许多养鸡地区。我国自50年代以来大部分地区有不断发生的报道，多呈地方流行性，并且发病的日龄有提前的趋势。最早发病可见 20-40日龄,给养鸡业造成严重损失,是集约化养鸡场的重要疫病之一。目前传染性喉气管炎的实验室诊断主要是病毒分离、血清学诊断、酶联免疫吸附试验、核酸探针、聚合酶链式反应等。病毒分离、血清学诊断和酶联免疫吸附试验这些方法虽然经典，但费时费力且敏感性差，不能检测亚临床感染，而传染性喉气管炎亚临床感染占有重要地位。PCR技术虽具有快速、特异、敏感和易于操作的特点，在畜禽传染病的检测、鉴别诊断方面得到了广泛应用但是不能进行高通量检测，不能满足高通量检疫的要求，更不利于大量通关样品的检疫和疫情暴发时大批量样品的紧急筛查，因而需要建立一套简便、快速、准确的传染性喉气管炎筛查和检验技术，以满足日常检测的要求。液相芯片(xMAP)技术是20世纪90年代中期发展起来的高通量检测技术。它是既可进行免疫学检测也可进行核酸检测的一种集流式技术、激光、荧光微球和数字信号处理为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。液相芯片技术最突出的优点在于仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。具体说来，与常规免疫学或核酸检测方法相比，它具有高通量、样品需求量小、操作简单、灵敏度高、检测范围广、特异性强、重复性好的显著优点。液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的微球分别染成上百种不同的荧光色(固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码)。应用时，把针对不同检测物的微球混合后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。液相芯片技术平台具有高效性因为上百种颜色的微球可以在同一个反应体系内，所以一小份标本(血，或其它体液，组织)可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性每个乳胶微球上都可以满满地(以共价键牢固结合的方式)包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一种快速检测方法因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法；本发明的目的还在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片试剂盒。查阅相关文献疱疹病毒的TK基因是高度保守的，ILTV不同毒株之间更加保守，英国株(Throne)和美国株￠32株)TK基因仅相差3个连续的核苷酸。从GenBank(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov)中收集传染性喉气管炎TK基因序列,利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选传染性喉气管炎的特异性保守序列。 本发明在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中发表的传染性喉气管炎TK基因序列组序列(登录号EF552574)，应用DNAStar、Primer5. O、和Bioedit软件分别对其进行初步分析筛选，设计了传染性喉气管炎的特异性引物和探针，分别对下游引物进行生物素标记，对探针进行氨基修饰。本发明提供了一对用于检测传染性喉气管炎病毒的引物，其核苷酸序列为 ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素标记。本发明提供了与上述引物配合使用的检测传染性喉气管炎病毒的探针，其核苷酸序列为5，-GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3，，在其 5，端用氨基修饰。本发明提供了一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片，是将上述检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。进一步地，所述液相芯片中，每6. 25X IO5个荧光微球加入浓度为O. Inmol/yL的探针2 μ L。本发明提供了一种用液相芯片检测传染性喉气管炎病毒的方法，其特征在于，用本发明提供的引物，对样品DNA进行PCR扩增，PCR产物与偶联在荧光微球上的探针分子杂交后，检测突光值，确定样品中是否含有传染性喉气管炎病毒。具体地，包括下列步骤I)提取样本中传染性喉气管炎病毒DNA;2)以步骤I)提取的样本DNA为模板，以上述引物(ILTV-F和ILTV-R)进行PCR反应；3)将上述氨基修饰的探针与荧光标记微球偶联；4)杂交将带有生物素标记的步骤2)中的PCR产物与步骤3)中偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；5)检测荧光值，以平均荧光值大于200且为阴性对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。本发明提供了一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片检测试剂盒，含有一对引物和本发明提供的上述液相芯片，所述引物核苷酸序列为ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素标记。本发明提供的液相芯片检测试剂盒中，使用上述引物进行PCR扩增的25μ L工作体系为IOxbuffer 2. 5 μ L, IOmmoI/L dNTP 2. O μ L, taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，DNA 模板2. 0 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 ILTV-F O. 5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 ILTV-R l.OyL,不含 RNA 酶的 ddH20 16. 5 μ L0其中，PCR扩增的工作条件为95°C预变性5min ;94°C变性40s，58°C退火40s，72°C延伸40s，共35个循环;72°C延伸IOmin0其中，PCR扩增产物与液相芯片杂交的工作条件为95°C变性5min后，54°C杂交30mino本发明提供了引物在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用，所述引物核苷酸序列为 ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素标记。本发明提供了探针在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用，所述探针的核苷酸序列为5 ’ -GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3 ’，且在其 5 ’ 端用氨基修饰。本发明提供了用于检测传染性喉气管炎病毒的生物素标记引物和特异性探针，利用该引物和探针建立一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法，该方法具有速度快，操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合于临床标本中传染性喉气管炎病毒的检测。
图I为ILT病毒TK基因PCR扩增电泳结果，其中泳道1_6分别为传染性喉气管炎病毒阳性样品，7为阴性对照，M为DL2000DNA Marker。图2为样品检测柱状图，其中X1-5分别代表感染ILTV样品DNA。图3为PCR方法对传染性喉气管炎病毒不同浓度模板的TK基因敏感性电泳图，其中M为DL2000DNA Marker,泳道1_4分别为传染性喉气管炎病毒模板浓度Ing/ μ L，O. Ing/μ L，0. Olng/μ L，0. OOlng/μ L，5 为阴性对照。图4为ILTV病毒液相芯片敏感性柱状图，其中X1-X6对应模板浓度分别为Ing/μ L，0. lng/μ L，0. oing/μ L, O. OOlng/μ L, O. OOOlng/μ L，0. OOOOlng/μ L，C 为阴性对照，B
为空白对照。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。实施例I探针和引物的设计与修饰从GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集传染性喉气管炎病毒 TK 基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选传染性喉气管炎病毒特异性保守序列。在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank中发表的传染性喉气管炎病毒的TK基因组序列(登录号EF552574)，应用DNAStar、Primer5. O和Bioedit软件分别对其进行初步分析筛选。 本发明经过反复研究，多次试验，设计了一对传染性喉气管炎病毒的特异性引物以及特异性探针，分别对下游引物进行生物素标记，对探针进行氨基(NH2)修饰。引物和探针的序列如下表所示表I传染性喉气管炎病毒液相芯片引物和探针
权利要求
1.一种检测传染性喉气管炎病毒的引物,其核苷酸序列为ILTV-F:5， -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3，， ILTV-R:5’ -ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3’，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素标记。
2.一种与权利要求I所述引物配合使用的检测传染性喉气管炎病毒的探针，其核苷酸序列为 5’ -GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3’，在其 5’ 端用氨基修饰。
3.一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片，其特征在于，是权利要求2所述的检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。
4.如权利要求3所述的液相芯片,其特征在于,姆6.25X IO5个突光微球加入浓度为O.Inmol/μ L的探针2 μし
5.一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求I所述的引物和权利要求3或4所述的液相芯片。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求I所述的引物进行PCR扩增的25μ Lエ作体系为10 X buffer 2. 5 μ L, IOmmoI/L dNTP2. O μ L，taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，DNA 模板.2.O μ L, 10 μ mol/L 上游引物 ILTV-F O. 5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 ILTV-R l.OyL,不含 RNA酶的 ddH20 16. 5 μ L0
7.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求I所述的引物进行PCR扩增的工作条件为95°C预变性5min ;94°C变性40s，58°C退火40s，72°C延伸40s，共35个循环;72°C延伸IOmin0
8.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求I所述的引物的PCR扩增产物与液相芯片杂交的工作条件为95°C变性5min后，54°C杂交30min。
9.权利要求I所述的引物在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用。
10.权利要求2所述的探针在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法，通过对传染性喉气管炎病毒的TK基因组序列的比对和分析，找出保守区域，设计了传染性喉气管炎病毒的特异性引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物对传染性喉气管炎病毒DNA进行PCR扩增，同时将探针与微球偶联；PCR扩增产物和偶联到荧光微球上的探针进行分子杂交，通过检测荧光值，建立了检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点。
文档编号C12N15/11GK102851395SQ20121033780
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者王慧煜, 韩雪清, 林祥梅, 梅琳, 李志辉 申请人:中国检验检疫科学研究院