专利名称：甘露聚糖酶Man23及其基因改造的制作方法
技术领域：
本发明涉及提取自枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶Man23，克隆出其编码基因man23后经生物学软件设计和筛选获得耐高温和pH适应性好的突变体，重组到表达载体pHY-p43后转化入短短芽孢杆菌的制备方法，属于微生物工程技术领域。
背景技术：
甘露聚糖酶是一类兼具半纤维素酶和纤维素酶活性的胞外酶，能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖，它以内切方式断开β-1，4-糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖。甘露聚糖酶普遍存在于植物、动物和微生物组织中，已发现的甘露聚糖酶植物源有 Coffeaarabica, Daucus carota, Lactuca sativa, Lycopersicon esculentum,Amorphaphallus KonjacC. Koch等。动物源种类较少，而且大多数属于软体动物，如·Haliotis discus hannai, Littorinabrevicula,Mytilus edulis 等。甘露糖酶的微生物源种类最为丰富，初步统计已发现的可产生甘露聚糖酶的微生物将近100种，其中芽孢杆菌属微生物是研究最多的产甘露聚糖酶的类群，如Bacillus subtilis,Bacillus circulans
坐寸ο通常甘露聚糖酶分为二类,一为内切甘露聚糖酶(endo-mannanase),这类酶作用于高聚糖分子内部的非结晶区，随机水解甘露糖苷键，截短长链分子，产生大量带非还原性末端的小段糖链。二为外切甘露聚糖酶(exo-mannanase),这类酶作用于高聚糖线性分子末端，水解产物为一个二糖分子。甘露聚糖酶在医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤、石油开采及生物技术等诸多领域正逐渐得到广泛关注和应用，如甘露聚糖酶可用作某些植物源饮料制品的添加剂，防止饮品出现沉淀，提高品质；甘露聚糖酶是对玉米/豆柏型日粮最有效的饲用酶制剂，甘露聚糖酶与其它半纤维素酶合用可以消除饲料中的抗营养因子，极大提高饼柏尤其是豆柏的能量消化率，降低食糜粘度，起到促进肠道有益菌生长和提高畜禽免疫力等作用，有望作为抗生素的替代产品；甘露聚糖酶可与其它酶制剂复配增强洗涤效果；甘露聚糖酶可降解天然纤维素中的半纤维素胶质，替代化学脱胶；甘露聚糖酶还可以用于调控植物的生长发育与繁殖，增强其抗病、抗逆性，是一类新型的植物激素；甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂，它既可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，又能够促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；甘露聚糖酶是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良好工具酶，生成具有增殖双歧杆菌生理功效的低聚糖。甘露聚糖酶多数是一个单链结构的蛋白分子，一般以胞外诱导酶的形式存在，而且该酶几乎都是外泌型的，具有易于分离获得，简化下游工艺的优势，对于外泌型的酶蛋白来说，芽孢杆菌表达系统被认为是一种较为理想的异源蛋白质表达系统，不过，芽孢杆菌中有些菌种的分泌系统存在一些不容忽视的问题。如芽孢杆菌自身能产生并分泌多种蛋白酶，以枯草芽孢杆菌为例，其产生的蛋白酶有七种，分属于丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，其中的中性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶为主要蛋白酶，它们的酶活加起来占总酶活的95%以上。短短芽孢杆菌(B. brevis)是一种几乎不分泌蛋白酶的野生菌株，它有较强的异源蛋白分泌能力，而且胞外蛋白酶活性很弱，如B. brevis 47的胞外蛋白酶活性水平是B. subtilis的I. 6%, B. brevis HPD31的蛋白酶活性几乎检测不到。利用B. brevis的这些特点，已构建成功多个有效的外源蛋白分泌载体，尤其用于真核生物蛋白的生产，比其它枯草杆菌更具优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐高温高酶活的甘露聚糖酶Man23和其突变体，其中所述甘露聚糖酶及其突变体的DNA序列分别为SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，核苷酸序列分别为 SEQID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。本发明提供了新的重组甘露聚糖酶，该酶的基因序列包含表达载体pHY_p43和所述突变甘露聚糖酶的编码序列，所述重组基因的表达宿主细胞为短短芽孢杆菌。 酶活实验结果表明，本发明提供的甘露聚糖酶具有较高的酶活和较好的稳定性。突变酶的催化活力较原始酶活提高了近3倍，催化效率提高了 10. 8倍，最适反应温度由原来的50°C提高至65°C，80°C时酶的半衰期提高了近7倍，同时酶可在更为宽泛的酸碱范围内保持活力。本发明还提供了一种制备重组甘露聚糖酶的方法，该方法包括(a)提取枯草芽孢杆菌B23的基因组DNA ；(b)以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(c)将PCR扩增产物克隆入载体pBS-T后转化大肠杆菌；(d)对大肠杆菌中的重组质粒进行点突变，获得突变库；(e)筛选获得的高活性突变体基因克隆入表达载体pHY_p43 ；(f)将得到的重组表达载体转化表达宿主短短芽孢杆菌；(g)分离、鉴定并纯化表达产物。本发明中所述克隆入载体pBS-T的编码基因扩增中使用的引物对为Pl :5’-ATGCCTACTAAGT-3’和 P2 :5’_TGATTCA GCTATCTGTG-3’。扩增条件为104°C加盖5min，94°C预变性5min，循环程序为94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环，最后72°C延伸IOmin。本发明中所诉克隆入表达载体pHY_p43的编码基因扩增中使用的引物对为P3. 5’ -CGCGGATCCATGCCTACTAAGT-3，(下划线部分为 BamH I 酶切位点)和P4 5，-CGGAATTCTGATTCAGCTATCTGTG-3，(下划线部分为 EcoR I 酶切位点)。扩增条件为104°C加盖5min，94°C预变性5min，循环程序为94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。本申请用生物学软件PdbViewer、Insight II和UniProt Swiss-Prot数据库对所述酶编码基因和核苷酸序列进行了同源序列比对，并与化学修饰法结合对酶活性中心进行预测，同时对可提高酶活力和稳定性的相关位点进行了突变预测。通过筛选，发现了影响甘露聚糖酶活性和稳定性的重要位点。本发明提供了对来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶的23个位点进行突变的突变酶。这23个位点位于54、58、62、63、122、129、144、155、160、178、181、190、198、207、211、231、270、299、311、340、341、348、354。这些位点氨基酸残基的突变造成酶活和酶稳定性的较大差异，为甘露聚糖酶的半理性设计提供了参考。本发明还提供了一种测定甘露聚糖酶的测定方法，该方法包括在0.9ml O. 5% (g/100ml)魔芋葡甘聚糖底物(pH 5. 8，O. 2mol/L磷酸缓冲液配制)中，加入适当稀释的酶液O. lml，50°C水浴反应3min，立即放入100°C水浴终止反应，用DNS法测定产生的还原糖量。酶活力单位定义为在上述反应条件下，每分钟释放出Iymol甘露糖的酶量为一个活力单位。甘露聚糖酶活(U/ml)= 5. 56CeVde/VJeVst5· 56 :1. Omg甘露糖的物质的量，μ molCe :根据样液的吸光度由标准曲线计算出甘露糖的含量，mg
Vde :酶液的定容体积，mlVje 向底物中加入酶液的体积，mlVs :加入底物的体积，mlt:时间，min甘露聚糖酶比活力(U/mg)=酶活(U/ml)/蛋白浓度(mg/ml) = 5. 56 CeVde2/CpVjeVstCp :根据样液的吸光度由标准曲线计算出蛋白质的含量，mg蛋白含量测定参考Bradford法。
图I重组质粒pHY-p43_man23构建示意2突变甘露聚糖酶的最适温度和pH
上图示突变酶对原始酶的最适温度，Man23为原始酶，M0710为突变酶。
下图示突变酶对原始酶的最适pH，Man23为原始酶，M0710为突变酶。
实施例实施实例I枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶基因man23的克隆I. I枯草芽孢杆菌菌株中总DNA的提取接种本实验室筛选保存的枯草芽孢杆菌菌株于液体培养基中，摇床培养IOh后离心，收集沉淀。用0.15mol/L NaCl与O. lmol/L EDTA(pH 8. 0)缓冲液洗细胞并制成悬浮液。离心细胞悬液，将细胞再悬浮于50mmol/L Tris-HCl-5mmol/L EDTA(pH 8.0)缓冲液中，加溶菌酶至终浓度为0. 5 lmg/ml，置37°C水浴30min。加浓度20%的SDS母液至终浓度2%，60°C水浴lOmin，继续加入5mol/L NaClO4至终浓度为lmol/L，加入等体积的Tris饱和酹-氯仿-异戍醇(25 : 24 : I),振荡lOmin。10000r/min离心lOmin。吸取含DNA的上清水层，加2倍体积的95%乙醇，收集DNA沉淀，并溶于TE缓冲液中(pH 8.0)中，加终浓度为50 μ g/ml的RNA酶，置37°C水浴摇床30min。加等体积Tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25 : 24 : I),振荡lOmin, 10000r/min离心5min。吸取水相,加2倍体积的95%乙醇，收集DNA沉淀。向沉淀中加0. 54倍体积的异丙醇，5min后于8000r/min离心IOmin收集DNA沉淀，并用70%乙醇洗沉淀若干次，最后沉淀溶于TE缓冲液中。1.2目的基因克隆
以I. I中提取的总DNA为模板，由引物Pl (5，-ATGCCTACTAAGT-3’ )和P2(5’ -TGATTCAGCTATCTGTG-3’ )克隆目的基因，PCR 反应条件为104°C加盖 5min，94°C预变性5min，循环程序为94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。获得目的基因man23。实施实例2甘露聚糖酶基因的重组及在短短芽孢杆菌中的表达2. I 表达质粒 pHY—p43-man23 的构建按照说明书提取质粒pHY_p43基因，用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切质粒基因。以I. I中所述总DNA为模板，利用P3 :5’ -CGCGGATCCATGCCTACTAAGT-3’ (下划线部分为 BamH I 酶切位点)和 P4 :5’ -CGGAATTCTGATTCAGCTATCTGTG-3，(下划线部分为 EcoRI酶切位点)克隆出目的基因man23，并以EcoR I和BamH I进行双酶切，然后将酶切过的质粒基因和目的基因按I : 5的摩尔数比混合，加入T4 DNA连接酶和缓冲液，16°C下连接I小时或过夜。·
2. 2重组基因转化短短芽孢杆菌短短芽孢杆菌接种于T2培养基中，37 °C下200r/min过夜培养，取培养物以1%的接种量转入5ml的T2培养基中，37°C下200r/min培养至对数生长末期，回收菌体，室温下用 5ml50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 7. 5)洗涤一次，5ml 50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8. 5)悬浮，37°C振荡培养Ih重新收集菌体，将其在O. 5ml TP培养基中悬浮，加入溶于100 μ I缓冲液(TE : TP = I : I)的2. I中所述连接产物DNA后再加入I. 5ml的PEG溶液，立即混匀。37°C振荡温育IOmin后回收菌体，并用Iml的MT培养基悬浮，37 °C继续振荡温育30min，加入少量抗生素后继续温育2h，取100 μ I的转化物涂布于含抗生素Amp和Tet的Τ2平板培养基上，37°C培养12 16h。回收在抗性培养基上生长的单菌落并提取质粒，用Eco R I和BamH I双酶切，酶切产物进行电泳检测。实施实例3甘露聚糖酶突变库的建立和筛选3. I基因man23在大肠杆菌中的转化对1.2中所述目的基因man23进行纯化，按照说明书，向离心管中加入纯化后的PCR产物15μ 1，加A反应液4μ l，Taq酶1μ 1，在72°C保温20 30min。加A后的PCR产物直接用于连接反应，载体PBS-T与加A产物片段以摩尔比I : 5混合。连接反应液置于22 26°C水浴中反应5min。取连接产物pBS-T_man23加到100 μ I的大肠杆菌TOPlO感受态细胞中，冰浴30min,再将混合液置于42°C水浴90s,取出后立即置于冰浴中静置2 3min。向混合液中加入300 μ I经37°C预热的LB (不含抗生素)培养基，37°C下，180r/min振荡培养45min。制备含有相应抗生素的固体培养基平板，将16 μ I的IPTG(50mg/ml)和40 μ I的X-gal (20mg/ml)在表面均匀涂开，置于37°C中避光放置3h。吸取100 μ I转化产物均匀平铺到含相应抗生素的LB固体培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培养12 16h。挑取平板培养基上的单菌落接种到3 5ml的LB液体培养基(含50 μ g/ml Amp)中，37°C, 200r/min下振荡培养约12h至对数生长后期。回收菌体。3. 2全质粒定点突变PCR以3. I中所述质粒pBS-T_man23为模板，根据突变位点附近的序列设计了若干对包含突变位点的引物，利用全质粒PCR方法构建点突变库。PCR反应体系为Pfu Turbo (5U/μ I) I μ I, IOX Buffer 5 μ I, dNTP Mixture (2. 5nmol/L) 4 μ I, primer (n) 0. 5 μ I,primer (n，)0. 5 μ 1，质粒 pBS-T_man23 5 μ I。PCR 反应条件94°C, Imin ；45°C,45s ；72°C,IOrnin0共18个循环。3. 3点突变库的建立和筛选3. 2中所述的PCR产物进行Dpn I酶消化，并进行平板初筛。挑取单克隆接种到每孔含200 μ I LB培养基(内含lmg/ml Amp)的96孔细胞培养板中，每孔对应一种突变体。37°C下，200r/min摇床培养约20h。回收菌体后提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进一步做酶切鉴定并测序，确定点突变和转化是否成功。以上述含有目的基因及其突变体的pBS-T_man23为模板，按照实施例2中所述条件克隆出编码基因，与表达载体pHY-p43连接，并转化短短芽孢杆菌中表达。各突变体表达质粒经平板初筛后，挑取单菌落接种到每孔含200 μ I液体发酵培养基的96孔细胞培养板上，每孔对应一个突变体，同时以野生型重组表达质粒为对照，37°C下，200r/min振摇培养20h后分别于4°C下，5000r/min离心5min，取100 μ I上清至96孔酶标板对应孔中，然后加 入100μ I含O. lmol/L葡甘聚糖的磷酸缓冲液(50mmol/L，pH5. 8)，混匀，立即在酶标仪上检测0D450吸光值，于50°C反应lOmin，反应结束后在酶标仪上再次测定0D45(I。计算每个突变体(反应前OD450-反应后OD45tl) /OD600的数值，以对照为参考，将结果高于对照的突变体挑出。取筛选获得的高活性突变体菌液10μ 1，转入新鲜的液体发酵培养基中。37°C下，200r/min振摇培养过夜。实施实例4酶学性质分析在0.9ml 0. 5% (g/100ml)魔芋葡甘聚糖底物(pH 5. 8，0. 2mol/L磷酸缓冲液配制)中，加入适当稀释的酶液0. lml，50°C水浴反应3min，立即放入100°C水浴终止反应，用DNS法测定产生的还原糖量。酶活力单位定义为在上述反应条件下，每分钟释放出Iymol甘露糖的酶量为一个活力单位。甘露聚糖酶活(U/ml)= 5. 56CeVde/VJeVst5. 56 1. Omg甘露糖的物质的量，μ molCe :根据样液的吸光度由标准曲线计算出甘露糖的含量，mgVde :酶液的定容体积，mlVje 向底物中加入酶液的体积，mlVs :加入底物的体积，mlt:时间，min甘露聚糖酶比活力(U/mg)=酶活(U/ml)/蛋白浓度(mg/ml) = 5. 56CeVde2/CpVjeVstCp :根据样液的吸光度由标准曲线计算出蛋白质的含量，mg蛋白含量测定参照Bradford法。
权利要求
1.一种来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)B23的β -甘露聚糖酶Man23，其完整的DNA序列为SEQID NO :1，突变体DNA序列为SEQ ID NO :2。
2.如权利要求I所述的β-甘露聚糖酶Man23，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3，其突变体核苷酸序列为SEQID NO :4。
3.—种重组表达质粒，其中含有权利要求I所述的DNA分子。
4.一种表达宿主，该宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达质粒。
5.权利要求4所述的表达宿主细胞为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)。
6.一种制备重组甘露聚糖酶的方法，该方法包括 (a)提取枯草芽孢杆菌B23的基因组DNA； (b)以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增； (c)将PCR扩增产物克隆入载体pBS-T后转化大肠杆菌； (d)对大肠杆菌中的重组质粒进行点突变，获得突变库； (e)筛选获得的高活性突变体基因克隆入表达载体pHY-p43； (f)将得到的重组表达载体转化表达宿主短短芽孢杆菌； (g)分离、鉴定并纯化表达产物。
全文摘要
本发明属于微生物工程技术领域。本发明通过对甘露聚糖酶Man23及其基因改造，提供了耐热的高酶活甘露聚糖酶Man23及其突变体。本发明提供了从枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis B23中克隆得到的甘露聚糖酶基因man23及其编码的甘露聚糖酶Man23，并利用生物信息学分析了该酶的活性中心和空间结构特点，结合软件预测和活性测定对该酶进行了多位点的突变，获得了耐热性好、pH适应性好高活性甘露聚糖酶突变体。本发明提供的甘露聚糖酶具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102943068SQ20121033716
公开日2013年2月27日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者周海燕, 吴永尧 申请人:周海燕, 吴永尧