专利名称：大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因与应用。
背景技术：
土壤中的磷素多数以有机态形式存在，且一半以上为植酸及其盐类，不能被植物直接吸收利用。酸性磷酸酶是一类能够分解利用土壤有机态磷、释放无机磷供植物吸收利用的酶类总称，该酶在植物生长发育过程中具有多种生物学功能，其中以参与植物磷素吸收利用最为重要。因此，挖掘与利用酸性磷酸酶基因，对于分解土壤中的有机态磷、提高植物磷素吸收利用效率、解决当前土壤有效磷供应不足、植物磷素缺乏等问题具有重要的理论和应用价值。 紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase, PAP)是一种广泛存在于动、植物体内的酸性磷酸酶类。根据其蛋白分子量大小，紫色酸性磷酸酶可分为两个亚家族，即编码低分子量(约35kD)和编码闻分子量(约55kD)的紫色酸性磷酸酶。其中，植物低分子量紫色酸性磷酸酶与动物体内的磷酸酶比较相似，而高分子量紫色酸性磷酸酶在植物中占有较大比例。紫色酸性磷酸酶一般具有5个保守基序和7个高度保守的氨基酸残基(以G/G以XI/GNH (D/E)/VXXH/GHXH:下划线字体代表保守氨基酸残基)以及一个金属离子的双核中心。动物体内的PAP —般由Fe3+-Fe2+构成双核金属中心，而植物体内的PAP —般由Fe3+-Zn2+或Fe3+-Mn2+构成双核金属中心。关于紫色酸性磷酸酶基因的克隆与应用研究，目前已有报道。Li等从拟南芥中分离得到29个PAPs基因，半定量PCR分析发现7个PAPs基因可在低磷胁迫下诱导表达；Xiao等克隆了苜蓿中的MtPAPl基因，经转化拟南芥证明该基因具有分解有机磷的功能。对拟南芥缺AtPAP26突变体的研究结果发现，AtPAP26在拟南芥有机磷利用方面起着重要作用；Wang等将拟南芥AtPAP15转入大豆，在植酸盐为唯一磷源条件下，3个转基因株系磷利用率分别提高117. 8%,56. 5%,57. 8%。Liang等从菜豆中获得了 PvPAP3基因，Real Time-PCR分析发现,低磷胁迫下,该基因在憐闻效品种G19833的表达闻于憐低效品种D0R364。由此可见，拟南介、首猜、采 等植物中的紫色酸性磷酸酶基因具有活化植株根际周围土壤中的有机态磷、促进植株体内磷素再循环利用的功能。然而，关于大豆中的紫色酸性磷酸酶基因的克隆以及根际周围有机磷利用研究，目前报道甚少。
发明内容
本发明目的是提供一种大豆紫色酸性磷酸酶及其编码基因，用于活化植株根际周围土壤中的有机态磷、促进植株体内磷素再循环利用。本发明另一目的是提供含有上述基因的载体。
本发明又一目的是提供含有上述基因或载体的宿主细胞。本发明再一目的是提供大豆紫色酸性磷酸酶及其编码基因在提高植株植酸磷利用率中的应用。大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4基因的 开放阅读框(ORF)序列，如SEQ ID NO. I所示，长度为1329bp。大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4编码的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示或该序列经替换一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，SEQIDNO. 2长度为442个氨基酸残基。应当理解，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞，利用所述宿主细胞制备大豆紫色酸性磷酸酶的方法等。所述该序列经替换一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指该序列的活性功能域之外的位点进行有限氨基酸的保护替换所得的序列仍能保持原来的活性。本发明氨基酸序列的活性功能域为135 430位，在此位点外可替换一个或几个氨基酸得到具有同等功能的氨基酸序列。比如，在非活性区段，将第123位的Ala替换为Val，或是将第440位的Leu替换为Thr，且具有同样的功能效果。本发明以磷高效大豆品种“中黄15”为材料，以拟南芥AtPAP15序列为基础，利用同源基因克隆技术，分离得到大豆中的紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4的开放阅读框(ORF)序列。采用荧光实时定量PCR技术，检测GmPAP4基因在磷高效(中黄15)与磷低效(牛毛黄)大豆品种中的差异表达，结果发现，在植酸盐为唯一磷源条件下，植酸磷处理15cT70d，GmPAP4基因在磷高效大豆品种(中黄15)中的表达量远远高于磷低效品种(牛毛黄)中的表达量，且最大差异可达8倍(植酸磷处理56cT63d)。在此基础上，通过原核表达载体的构建，实现了 GmPAP4基因在大肠杆菌BL21中的原核表达，利用His标签，分离纯化得到了诱导表达后的GmPAP4编码蛋白；经酶活检测分析发现，GmPAP4编码蛋白具有酸性磷酸酶活性，且以pH=5. O时的酸性磷酸酶活性最高。同时通过构建GmPAP4的GFP融合表达载体，采用基因枪轰击技术将构建的pCamE_GmPAP4: :GFP融合基因导入洋葱内表皮细胞，利用荧光显微镜观察该融合基因所表达蛋白在洋葱内表皮细胞中的分布情况，结果显示转化PCamE-GmPAP4: :GFP质粒的洋葱内表皮细胞的细胞膜部位有明显的荧光，说明GmPAP4编码蛋白主要分布于细胞膜。利用所构建完成的GmPAP4基因的植物超表达载体pCamE-GmPAP4,采用农杆菌介导转化技术转入Columbia型拟南芥中，经转基因拟南芥的植酸磷分解利用试验证明，GmPAP4具有分解植株根际周围植酸态磷、提高植酸磷利用效率的功能。本发明的有益效果(I)本发明首次发现了大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因，为提高植株植酸磷利用率提供了新的候选基因。(2)本发明大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4的开放阅读框及其编码蛋白能分解利用植株根际周围植酸态磷、提高转基因拟南芥植酸磷利用效率，可利用基因工程手段进一步提高植株植酸磷利用效率。
图I是“中黄15 ”低磷处理GmPAP4基因cDNA的PCR扩增的结果图；其中M为DNAMarker DL 2000 ;1为“中黄15”低磷处理cDNA的PCR扩增结果。图2是植酸磷处理下GmPAP4基因在“中黄15”与“牛毛黄”根系中的差异表达结果图；其中，横坐标表示植酸磷处理的天数，纵坐标表示GmPAP4在“中黄15”与“牛毛黄”根系表达量的比值。图3是GmPAP4基因原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果；对pET32a_GmPAP4质粒转化的BL21受体菌株进行诱导表达试验，其中箭头所示为表达目的片段61. 2KDa ;皿是蛋白标准分子量；1为不含重组质粒的空菌株；2为含有空载质粒的菌株；3为含有目的基因GmPAP4的菌株；4为分离纯化获得的GmPAP4特异蛋白。
图4是GmPAP4基因编码蛋白的酸性磷酸酶活性检测结果图；其中，pET_32a为空载体，GmPAP4为重组质粒。图5是GmPAP4基因编码蛋白在不同pH条件下的酸性磷酸酶活性检测结果图。图6是GmPAP4编码蛋白的洋葱表皮亚细胞定位观察结果；其中，A图紫外光激发下的空载体PCamE-GFP转化洋葱细胞的荧光观察结果；B图紫外光激发下的重组质粒pCamE-GmPAP4: :GFP转化洋葱细胞的荧光观察结果。图7是T3代转基因拟南芥目的基因GmPAP4的PCR检测结果图；其中，1_9为T3转基因拟南芥植株，5-9为筛选得到的含有目的基因的拟南芥阳性植株，M是DNA MarkerDL2000,10为野生型对照，11为空白对照，12为质粒阳性对照。图8是T3转GmPAP4基因拟南芥的RT-PCR检测结果图；其中，M为DNA MarkerDL2000 ；Γ4为T3代转基因拟南芥；5为野生型对照；6为空白对照；7为质粒阳性对照。图9是在植酸磷和适磷2种处理下，T3超表达转GmPAP4基因拟南芥的生长情况；其中，+Pi为适磷处理，+Po为植酸磷处理；WT为野生型，G4为T3代拟南芥。图10是T3超表达转GmPAP4基因拟南芥与野生型植株地上部生物重比较结果图；其中，+Pi为适磷处理，+Po为植酸磷处理；WT为野生型，G4为T3代拟南芥。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例lGmPAP4基因的分子克隆(I)大豆幼苗培养与缺磷处理选取饱满、整齐一致大豆品种“中黄15”种子，催芽后选择出芽一致的材料播种于石英砂中，7d后移至营养液中，待对生真叶展开后，进行缺磷胁迫(Ommol/L)处理,对照磷处理浓度为I. Ommol/L。在磷胁迫处理21d后取植株根系,液氮速冻后，_80°C超低温冰箱保存待用。(2)实时定量PCR分析所用材料处理选取饱满整齐一致的大豆品种“中黄15”和“牛毛黄”种子(购自中国农业科学院国家大豆种质资源库)，播种于蛭石。出苗7d后取植株根系作为对照(记为Od)，然后设置2个不同磷处理组(适磷、植酸磷，磷浓度均为I. Ommol/L),随后在磷处理7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d、70d，分别取植株根系样品，液氮速冻，_80°C超低温冰箱保存待用。(3)总RNA提取大豆植株总RNA(缺磷、适磷、植酸磷处理)提取参照TRNzol TotalRNA Reagent操作指南进行。(4) cDNA反转录合成植株总RNA经反转录后获得cDNA，合成过程参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 操·作指南进行。(5)PCR扩增所用引物的设计利用AtPAP15序列，在NCBI网站比对大豆EST，通过电子克隆技术拼接得到目的基因的电子序列。依据该电子序列设计引物，序列如下Fl :5，-GGTACCATGGAACTCAAACAACAAAAACTCC-3’Rl :5’ -CTCGAGTTAGGGCGTCAAAAGTGTACTTCTG-3’(6)GmPAP4基因开放阅读框(ORF)的分子克隆利用所设计的Fl与Rl引物，以缺磷处理下的反转录cDNA为模板进行PCR扩增，克隆GmPAP4基因的开放阅读框序列。PCR反
应体系及程序如下
中黄 15 cDNA1.0 μ
IOxPCR buffer (含Mg2 )2.0 μL
2.5 mM dNTPs2.0 μL
Ex Taq DNA polymerase ( 2.5 /μ .,)0.2 μL
Fl (5 μΜ)1.0 pL
Rl (5 μΜ)1.0
CidH2O12.8 μ PCR 程序95 °C IOmin
94 Γ45 s λ
58 0C45 s >- 35 cycles
72 V90s -72 °C IOminIO0C holdPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，并连接于pGM-Τ载体。反应体系为 10 X Ligation Buffer I μ L, pGM~T Vector I μ L, PCR Product 7 μ L, T4DNA LigaseI μ L，混匀后16°C连接过夜。电泳结果如图I所示，I泳道获得约I. 3kb左右的一条特异条带。(7)转化大肠杆菌，获得阳性克隆连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，进行质粒提取，酶切检测和测序，获得GmPAP4基因的开放阅读框序列见SEQ ID NO. I (长 1329bp)。实施例2GmPAP4基因在不同大豆品种中的差异表达分析以GmPAP4为目标基因，大豆组成型表达Actinll基因为内参对照，设计Realtime-PCR引物F2和R2，采用SYBRuiGreen I荧光染料法进行荧光实时定量PCR，通过比较Ct进行GmPAP4基因表达水平的相对定量分析。F2 :5， -CGACCTCTTCCTCGTAAAACC-3’R2 :5’ -GTGCTTGTCTCCTGCCAAAG-3’GmPAP4基因在不同大豆品种根系中的相对表达量=2_ΛΛετ，Δ Δ Ct= (CtGmPAP4- Ctactinll)中黄15根系-(CtGmPAP4-Ctaetinll)牛毛黄根系，结果如图2所示，植酸磷处理I5cT7Od, GmPAP4基因在“中黄15”根系的表达量远远高于“牛毛黄”中的表达量，且在植酸磷处理56飞3d时，GmPAP4在“中黄15”根系的表达量为“牛毛黄”根系中表达量的8倍。实施例3GmPAP4基因的原核表达(I)将重组质粒pGM-GmPAP4和原核表达载体pET_32a (+)采用KpnI/XhoI双酶切，并回收目的片段，将回收后的pET-32a(+)表达载体与GmPAP4酶切片段进行连接。酶切反应体系为 KpnI I μ L，XhoI I μ L, IOXL Buffer 2 μ LjH2O 11 μ L，Plasmid 5 μ L。连接反应体系为 GmPAP4Fragment 5 μ L, pET_32a (+) Vector I μ L, T4DNA Ligase I μ L, 10 X LigationBuffer I μ L, ddH20 2 μ L,混匀后 16°C连接过夜。(2)融合重组蛋白的诱导表达将上述连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR和酶切检测，将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21菌株，挑取阳性克隆，经质粒提取、酶切检测、测序鉴定，得到含有GmPAP4基因正确编码序列的阳性克隆。(3) SDS-PAGE蛋白电泳分析利用O. 8mmol/L IPTG诱导表达转有原核表达载体的BL21菌株，分别收集诱导前、诱导后12h的菌液。将收集的菌液离心后，倒出液体，分别加入200 μ L上样缓冲液，振荡混匀后，置于沸水中10分钟，瞬离；分别配置12%的分离胶，5%的浓缩胶。各取30 μ L样品上样；浓缩胶部分以80V恒压，分离胶部分以120V恒压电泳。SDS-PAGE电泳图如图3所示，经IPTG诱导，重组质粒在大约61. 2KDa的位置上出现了特异条带，与预期的表达目标蛋白大小一致。其中，pET-32a(+)载体本底表达20. 4KDa蛋白；GmPAP4基因去除信号肽为1182bp，编码393个氨基酸，表达理论上为40. 8KDa的蛋白，二者共为61. 2KDa。实施例4GmPAP4基因编码蛋白的纯化与酸性磷酸酶活性检测(l)GmPAP4基因编码蛋白的分离与纯化按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒的操作指南进行。(2) GmPAP4基因编码蛋白的酸性磷酸酶活性检测首先配制对硝基酚(P -NP)的标准溶液，在405nm波长下比色测定吸光值，以对硝基酚含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。然后以0-册？为底物，反应体系包括10臟01/1 MgCl2,10mmol/L P-NPP，50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液和20 μ L GmPAP4,反应总体积I. 5mL, 37°C水浴，反应30min，加入0. 5mL lmol/L NaOH溶液终止反应,测定405nm下的吸光值,根据标准曲线计算反应产生的P -NP的量，计算GmPAP4的相对活性。结果如图4所示，与对照(pET_32a)相比，重组质粒pET32a-GmPAP4的酸性磷酸酶活性提高了 40%，差异达到极显著水平，说明目标蛋白GmPAP4可以分解反应底物P -NPP，具有酸性磷酸酶的活性。
(3)GmPAP4基因编码蛋白在不同pH条件的酸性磷酸酶活性检测反应体系分别选用不同的缓冲液，pH值3. 5 5. 5为50mmol/L乙酸钠·乙酸缓冲液，pH值6. 0^7. O为50mmol/LTris ·乙酸缓冲液，pH值7. 5^9. O为50mmol/LTris -HCl缓冲液；其余方法步骤与GmPAP4编码蛋白酸性磷酸酶活性检测基本相同。结果如图5所示，通过分析7个不同pH条件下的GmPAP4蛋白的酸性磷酸酶活性，结果发现，GmPAP4蛋白在pH=5. O的条件下酸性磷酸酶活性最高，符合酸性磷酸酶的特征。实施例5GmPAP4编码蛋白的亚细胞定位分析(I)PCR所用引物的设计利用生物软件DNAMAN设计一对PCR引物，扩增GmPAP4去除终止密码子后的开放阅读框，进行编码蛋白的亚细胞定位，引物序列如下F3 :5，-GTCGACATGGAACTCAAACAACAAAAACTC-3，，R3 :5’-GGTACCGGGCGTCAAAAGTGTACTTC-3’ ，(2)亚细胞定位所需开放阅读框的扩增以pGM_GmPAP4质粒为模板，利用F3和R3引物，扩增不含终止密码子的GmPAP4基因开放阅读框序列，电泳检测后切胶回收目的条带，与pGM-Τ载体连接，蓝白斑筛选，测序，挑选出开放阅读框序列无误的阳性克隆PGM-PAP4用于后续试验。(3)融合表达载体的构建将中间载体PGM-PAP4和GFP融合表达载体pCamE_GFP分别用SalI和KpnI双酶切。回收酶切产物，与载体pCamE_GFP进行连接。酶切反应体系为 SalI I μ L，KpnI I μ L, IOXMBuffer 2 μ L, H2O 6 μ L, Plasmid 10 μ L。连接体系为 PAP4 Fragment 5 μ L, pCamE-GFP Vector I μ L, T4 DNA Ligase I μ L,10 X LigationBufferl μ L7H2O 2 μ L，混匀后16°C连接过夜。连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆，进行质粒提取，酶切检测和测序，获得用于亚细胞定位的融合表达载体pCamE-GmPAP4: :GFP。pCamE_GFP 与专利 CN 101942426B 中表达载体 pCamE_GFP 相同。(4)融合表达载体PCamE-GmPAP4: :GFP基因枪转化采用基因枪轰击技术将融合表达载体pCamE-GmPAP4: :GFP转化洋葱内表皮细胞，转化步骤按照基因枪操作说明书进行，对照组为空载体pCamE-GFP。(5)荧光显微镜观察基因枪轰击后的洋葱内表皮细胞置于荧光显微镜下观察绿色荧光在细胞内的分布情况。结果如图6所示，结果显示转化PCamE-GmPAP4: :GFP质粒的洋葱内表皮细胞的细胞膜部位有明显的荧光，由此可知GmPAP4编码蛋白主要分布于植物细胞膜。实施例6GmPAP4基因表达蛋白的功能分析 (I) GmPAP4基因的植物超表达载体pCamE_GmPAP4的构建将pGM_GmPAP4和PCamE质粒采用Sal I /Kpn I双酶切，回收酶切产物，进行连接。酶切反应体系为SalII μ L，KpnI I μ L, IOXM Buffer 2 μ L, BSA 2 μ L, H2O 6 μ L, Plasmid 8yL。连接体系为GmPAP4Fragment5μ L，pCamE Vector I μ L，T4DNA Ligase I μ L，10XLigation BufferluL, ddH20 2 μ L，混匀后16°C连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR和酶切双重检测，得到阳性克隆进行测序，得到测序正确的超表达载体进行后续试验。(2)农杆菌介导法侵染拟南芥采用浸花法(Floral dip)将携带有pCamE_GmPAP4的农杆菌转入Columbia型拟南芥中。PCR检测目的基因GmPAP4，结果如图7所示。(3)转基因拟南芥的植酸磷利用分析选取4个T3转基因拟南芥株系和野生型对照为材料；每个材料分别种30盆，I株/盆，进行2种磷处理(植酸磷处理、适磷处理，浓度均为I. Ommol/L)。以植酸磷处理下的T3转基因拟南芥的目的基因GmPAP4cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，所用引物为PCamE-GmPAP4载体上的潮霉素引物，引物序列为F4 5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’ ；R4 :5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3';扩增长度为 1026bp，结果如图8所示，可见扩增出目的条带。在植株生长期间，观察拟南芥植株在2种磷处理下的生长情况，并称量地上部生物重，进行植酸磷利用分析。拟南芥生长情况如图9所示，植酸磷处理下，与野生型相比，T3代转基因拟南芥植株表现出植株叶片较大、叶柄较长、叶色发绿、生长势强等特点，而野生型对照则表现出叶片较小、叶柄较短、叶色发紫、生长势弱的缺磷症状，表明T3代转基因拟南芥植株可以分解利用根际周围的植酸憐、GmPAP4具有提闻转基因拟南芥在植酸憐条件下的耐低磷能力的作用。进一步测定T3代转基因拟南芥植株与野生型的地上部生物重，结果如图10所示，适磷条件下的转基因拟南芥与野生型对照生物重没有显著差异；而植酸磷条件下的转 GmPAP4拟南芥地上部生物重与野生型相比，则提高39. 3%，差异达到极显著水平；说明T3代转基因拟南芥植株可以分解利用根际周围的植酸磷、因而受到低磷影响较小，具有较高的生物重；而野生型植株则受到低磷影响较大，具有较低的生物重，GmPAP4具有提高转基因拟南芥在植酸磷条件下的耐低磷能力的作用。结论大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4基因所表达的蛋白具有分解植株根际周围植酸磷、提高转基因拟南芥植酸磷利用效率的功能。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种大豆紫色酸性磷酸酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 2衍生的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述大豆紫色酸性磷酸酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. I。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求I所述大豆紫色酸性磷酸酶、权利要求2或3所述基因在提高植物植酸磷利用率中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因与应用。所述大豆紫色酸性磷酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.2衍生的氨基酸序列。大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明首次发现了大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因，为提高植株植酸磷利用率提供了新的候选基因，可利用基因工程手段进一步提高植株植酸磷利用率。
文档编号C12N1/19GK102876641SQ20121033683
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者张彩英, 李喜焕, 孔佑宾, 常文锁, 李文龙 申请人:河北农业大学