专利名称：酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶b5(trap 5b)的底物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶 (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)，优选 TRAP 5b 的底物的用途。本发明也 涉及测量在受试者样本中作为骨吸收率指标的TRAP 5b的量，以及与其相关的方法。本发 明也提供了酞类化合物的单磷酸酯在测量样本中TRAP 5b中的用途，和实施本发明的方法 的试剂盒。
背景技术：
骨由2种主要的细胞类型组成负责形成骨的成骨细胞和负责破坏(吸收)骨的 破骨细胞。破骨细胞是进入矿化骨，将其破坏为其组成部分的多核细胞。吸收过程包括破 骨细胞向骨单位的附着。然后破骨细胞引发其细胞膜的内摺，并分泌胶原酶和其它在吸收 过程中重要的酶。由于骨被吸收，高水平的钙、镁、磷酸根和胶原的产物被释放到细胞外液。 通常成骨细胞和破骨细胞处于平衡中，以使吸收的骨的量和形成的骨的量相同。在童年，骨 形成超过吸收，但随年龄增长，吸收超过形成。已知若干医学病况与骨吸收率的变化相关，可能最广泛存在的是骨质疏松。这种 特定病况被认为是破骨细胞活性增加的结果，其特别是在绝经后妇女中导致骨量减少。这 导致骨的弱化并增加了对骨折的易感性。该年龄组的妇女中骨折可能是潜在严重的，由骨 质疏松引起的这些和其它症状的治疗是昂贵的并需要医学专业。长期以来对那些易患骨质 疏松的人的诊断被认为是重要的，以预防这种病况的潜在严重后果。已日益通过例如雌性 激素替代治疗或双膦酸酯治疗成功治疗骨质疏松。骨质疏松或其易感性的指标是测量受试者中骨密度，其中低的骨密度暗示骨吸收 过量，因此有骨质疏松或其它病况的可能。由于该组人群被认为是重要的商业市场，特别是 在西方国家，已发展了很多方法和仪器以测量骨密度。其中，以那些特异性、快速和廉价的 为人所欢迎。根据其电泳迁移率，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)属于酸性磷酸酶的5型种类。它 是已鉴定的7种酸性磷酸酶中酸性最强的，并且是唯一一种抵抗酒石酸引起的抑制的酸性 磷酸酶。TRAP是一种在分子的活性位点含有自旋-偶联铁单位的碱性糖蛋白。TRAP的双 核铁单位含有2个高铁离子，其使蛋白质呈紫色，因此它也被称为紫色酸性磷酸酶。这种蛋 白有32kd的分子量。当酶被例如β-巯基乙醇还原，其中一个高铁离子被还原，酶变为粉 红色。TRAP在体外可以作为蛋白酪氨酸磷酸酶起作用，其氨基酸序列含有与磷蛋白磷酸酶 同源的区域。但是，TRAP的天然底物依然是未知的。若干研究已涉及在骨吸收过程中的TRAP。小鼠中TRAP基因的破坏(Hayman，A. R et al Development 122:3151-3162,1996)导致软骨内骨化被破坏和轻度骨质疏松，其暗 示TRAP通过对骨基质吸收的关键作用在骨发展、保持成年骨的完整性和更新中对于软骨 正常的矿化是必需的。
在人类中，已发现存在TRAP的正常细胞仅有破骨细胞和激活的巨噬细胞。已发 现在骨吸收期间TRAP被破骨细胞分泌到血液中。因此暗示TRAP在血清中的浓度作为 骨吸收的标记，并且已发现TRAP在血清中的浓度与骨吸收率相关(Kraenzlin Μ. E et al.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2) 442~451,1990 ；Cheung C. K et al. Clin. Chem 41(5) :679-686,1995 ；Chamberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10) 1495-1499，1995 禾口 Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10) 1444-1452，1996)。已鉴定出 2 种 TRAP 的同工型，TRAP 5a 禾口 TRAP 5b (Lam W. K. W. et al. (Clin. Chem. 24 (7) : 1105-1108，1978) )。TRAP 5a在较低最佳pH比TRAP 5b更具活性，由此允许对 TRAP各同工型的的功能测定。为了测定例如骨吸收率而进行的TRAP 5b血清或血浆的浓 度测量中的主要困难，是存在主要由巨噬细胞和树突细胞产生的酶的5a同工型。这两种同 工型都是acp5基因的产物，区别仅在于在翻译后修饰中的变异。TRAP 5b缺少某些在TRAP 5a中存在的唾液酸残基(在蛋白质的糖基团上)。所述同工型也在如下方面有所不同氨 基酸链的约14个残基片段已经从TRAP 5b被蛋白水解切除。另外，核心蛋白是相同的，在 单纯免疫学基础上没有区分这两种同工型的方法。因此，商业上存在的TRAP 5b免疫测定 利用这两种形式之间的生化差异。可以通过分光光度计测定TRAP的活性，例如在酒石酸存在时通过给予对硝基苯 基磷酸酯(PNPP)作为底物，酒石酸抑制大多数其它酸性磷酸酶。但是，该方法特异性不强， 因此为了测定TRAP，已发展了更具特异性的方法即免疫测定。已发展了多种使用多克隆抗 体的 TRAP 的测定方法(Stepan J. J et al (Biochem, Biophs. Res. Commun. 165 1027-1034， 1989), Kraenzlin Μ. E et al(Journal of Clinical Endrocrinology and Metabolism 71(2) :442-451，1990)和 Cheung C. Ket al (Clin. Chem. 41 (5) :679_686，1995))。针对TRAP 使用多克隆抗体的研究显示儿童和绝经后妇女具有升高的血清TRAP浓度(Halleen J. et al Journal of Bone and Mineral Research 11(10 :1444_1452，1996)。Chamberlain P. et. Al (Clin. Chem. 41(10) :1495_1499，1995)描述了针对重组产 生的TRAP使用单克隆抗体的测定。基于TRAP 5b是比总TRAP更具特异性的骨吸收的生化标记的发现，国际专利申请 No. WO 1999/050662描述了 TRAP 5b的测定，所述测定在具有确定pH范围的缓冲液中使用 普通磷酸酶底物，对硝基苯基磷酸酯(PNPP)以使5b同工型的活性最大化，而降低TRAP 5a 的干扰。欧洲专利No. 1598670描述了适于测量TRAP 5b的酸性磷酸酶底物，其中实施例 底物之一，2-氯-4-硝基苯基磷酸酯，对TRAP 5b相对TRAP 5a的相对活性仅仅比上述 W01999/050662中获得的活性高0. 8倍。美国专利No. 7，074, 903描述了自称相对TRAP 5a显示对TRAP 5b的特异性的单 克隆抗体。但是该抗体显示与重组人TRAP5等效的交叉反应性，这被认为与TRAP 5b (从人 血清中分离)相比更类似于天然的TRAP 5a。因此，所述测定中的抗体功能特异性在区别 TRAP 5a和5b方面并不显著优于描述于W01999/050662或EP1598670中的活性测定。已知的商业测定适于使用在某些临床应用中，因为TRAP 5a的酶促活性比5b (临 床应用的形式)低相当多。但是，通过评价公布于诸多研究范围内的数据，可以估计在正常样本中5a的影响可能高达50%。尽管对于某些TRAP 5b水平的变化是显著的临床应用，这 并不代表一种显著的困难，但是已知的方法可能缺乏区分TRAP 5b水平中更细微的变化的 能力。应用于已知测定中的底物pNPP及其4-卤-取代衍生物在溶液中是不稳定的。当 手工进行测定且其中底物是作为在使用之前立即溶解的固体应用时，这不是问题。但是，底 物的不稳定性使这些化合物难以应用于自动化免疫测定平台，所述平台需要底物在溶液中 稳定若干周。专利No. US 3，975，405描述了一种邻甲酚酞的单磷酸酯及其在血清样本中作为 测量碱性磷酸酶的底物的用途，并自称具有如下利益避免由胆红素引起的干扰，并且与百 里酚酞单磷酸酯相比对碱性磷酸酶的肠道和胎盘内的同工型更敏感。所述方法不区分碱性 磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型，或描述其作为TRAP 5b的底物的用途。专利No. US 4，045，290描述了百里酚蓝单磷酸酯作为磷酸酶底物用于在血清中 测量总碱性磷酸酶和在血清中适宜PH条件下测量总酸性磷酸酶的制备和用途。所述方法 不区分碱性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型。因此，需要用于测定TRAP 5b的方法，其中与现有测定相比TRAP 5a的干扰显著减 少，并且其可易于应用于自动化模式中。
发明内容
本发明提供了酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRAP 5b)的 底物的用途。在本文中，酞类化合物的单磷酸酯定义为下式的化合物其中A是取代或未经取代的0-磷酰化的对苯酚；B是取代或未经取代的对苯酚磷酸酯；X 是 CO 或 SO2 ；R1 选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R2 选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O) OR5、-OC(O) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R3 选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；并且R4 选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O)
8nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；其中η 是 0、1 或 2;R5和R6各自独立地是氢或R7 ；并且R7选自烃基、-(CH2)k-杂环基、-(CH2)k-C(O)-杂环基，其中的任意基团任选地被1、 2、3、4或5个独立地选自卤素、氰基、氨基、羟基、-COOH和其酯(例如-C (0) -C1^6烷基)、亚 磷酰胺、Cp6烷基和CV6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。优选地，酞类化合物的单磷酸酯定义为下式的化合物
权利要求
1.酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的底物的用途。
2.用于测量样本中TRAP5b的量的方法，所述方法包括使用酞类化合物的单磷酸酯作 为底物测定TRAP 5b的活性。
3.用于测量受试者中骨吸收率的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸 酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中TRAP 5b的量，其中存在于样本中的 TRAP 5b的量反映了骨吸收率。
4.诊断受试者中与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过 使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量是患者患有该障碍的指示。
5.监测用于预防或治疗与骨吸收率的变化相关的障碍的药物在服用该药物的受试者 中的效果的方法，所述方法包括(a)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量；和(b)将TRAP 5b在上述样本中的量 与TRAP5b在对照样本中的量进行比较。
6.筛选受试者对与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过 使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明对这类障碍的易感性。
7.根据权利要求2至6任一项的方法，所述方法包括(a)将样本中存在的TRAP与结合 总TRAP (TRAP 5a和TRAP 5b)的抗体结合；和(b)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底 物测定与所述抗体结合的TRAP 5b的活性而测量样本中TRAP 5b的量。
8.根据权利要求2至7任一项的方法，其中TRAP5b活性的测定步骤在pH 6. 8至7. 6， 优选pH 6. 8至7. 4，最优选pH 7进行。
9.根据权利要求2至8任一项的方法，其中通过测量TRAP5b活性后样本颜色而测量 TRAP 5b 的量。
10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中测定样本中TRAP5b的活性的步骤包括如 下连续的步骤(e)温育酞类化合物的单磷酸酯和样本以使TRAP5b代谢底物；(f)停止代谢；(g)任选地调节样本的PH；(h)测量由于被TRAP5b代谢而导致的底物的特征变化。
11.根据权利要求9或10的方法，其中使用分光光度计测量样本的颜色。
12.根据权利要求2至10任一项的方法，所述方法还包括通过将任一项权利要求中所 得的TRAP 5b的测量值与校正标准或曲线比较而得到存在于样本中的TRAP 5b的量的绝对值。
13.根据权利要求2至11任一项的方法，其中TRAP5b活性的测定步骤在固体基质上 进行，优选平台、多孔板或阵列。
14.根据权利要求13的方法，其中所述平台是自动化的。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述自动化平台包括磁珠。
16.用于实施根据任一项权利要求的方法的试剂盒，所述试剂盒包含酞类化合物的单 磷酸酯和任选地包含结合总TRAP的抗体。
17.酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP5b的底物而用作骨吸收的指示物的用途。
18.根据权利要求17的用途，其用于根据权利要求1至15任一项的方法中。
19.根据权利要求16的用途，所述用途包括将所述单磷酸酯与受试者的样本接触，随 后测量样本的颜色。
20.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是酚酞或磺酞。
21.根据权利要求19的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是苯酚磺酞。
22.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是具有式I的化 合物
23.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物的单磷酸酯选自 酚酞单磷酸酯、甲酚酞单磷酸酯、百里酚酞单磷酸酯、邻氯酚酞单磷酸酯、苯酚磺酞单磷酸 酯、邻甲酚磺酞单磷酸酯、间甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚绿单磷酸酯、溴酚蓝单磷酸酯、百里酚蓝单磷酸酯、溴百里酚蓝单磷酸酯、二甲苯酚蓝单磷酸酯和氯酚红单磷酸酯。
全文摘要
本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的底物的用途。在用于测量受试者样本中TRAP 5b的量的测定中使用所述底物，所述TRAP 5b的量作为骨吸收率的指标，以及因此作为类似病况，例如骨质疏松的指标。本发明也提供了包含酞类化合物的单磷酸酯和任选包含结合总TRAP的抗体的试剂盒，以及方法。
文档编号C12Q1/42GK102007411SQ200980113346
公开日2011年4月6日 申请日期2009年4月8日 优先权日2008年4月15日
发明者B·休斯敦, D·劳里, J·哈伦 申请人:伊姆诺诊断系统有限公司