专利名称：一株高效生物絮凝剂产生菌及其筛选方法以及在处理磺胺甲恶唑中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株高效生物絮凝剂产生菌，属于生物工程、环境工程技术领域，是采用微生物纯培养技术从自然环境中筛选出的高效高产量生物絮凝剂产生菌Klebsiellasp.，同时提供这种高效生物絮凝剂产生菌的筛选方法和其在处理磺胺甲恶唑中的应用。
背景技术：
药品和个人护理品(Pharmaceuticalsand Personal Care Products, PPCPsMt为水生环境的新兴污染物已经成为现今很多环境研究的中心。药物治疗和个人卫生的需要导致PPCPs源源不断地释放到环境中。虽然知道这些新兴的污染物的存在已经几十年了，然而仅在最近的1(Γ15年内，才研究出检测PPCPs在环境中的痕量浓度的分析方法。尽 管PPCPs是痕量物质，但是PPCPs呈现的化学持久性和抗微生物性的协同作用，以及PPCPs给水生生物和人类带来的无法完全定义的不利影响，都引起了人们的广泛关注。抗生素类药物磺胺甲恶唑属于典型的PPCPS，其在污水处理厂中去除比例很低，被频繁检出。国内外都对水环境中该类药品的处理和检测做了广泛研究，常用的处理方法主要有高级化学氧化法、吸附法、膜处理技术等。其中利用生物絮凝剂吸附法处理水体中的PPCPs尚未被报道，利用该方法去除水坏境中的磺胺甲恶唑较其他方法有着高效、环保、无二次污染的优势。因此，从自然界筛选出高效生物絮凝剂产生菌，并将其制成生物菌制剂，应用于此类污染的治理将有着实际的应用价值。
发明内容
本发明的目的是从自然界筛选出高效高产量生物絮凝剂产生菌株
sp.，并将其制成生物菌制剂，为生物絮凝剂的应用提供高效的菌剂，强化去除磺胺甲恶唑的效能。一株高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于为克雷伯氏菌MFXsp.)，于2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 6243。菌株克雷伯氏菌MFX0f7￡^sie77a sp.)是从哈尔滨市太平污水处理厂二沉池活性污泥中分离得到，生物絮凝剂产生菌的分离筛选过程均在30 °C条件下进行。首先取15mL活性污泥和若干玻璃珠至已灭菌好的YP液体培养基中，摇瓶培养18 32 h。灭菌条件为112°C，高压蒸汽灭菌30分钟。第一个培养周期结束后，将获得的富集菌液按10%的接种量加入到新鲜的YP液体培养基中继续摇瓶培养18 32 h，重复上述操作3 4次。将此混合菌液涂布在YP固体培养基上，反复进行平板划线，固体、液体交替培养，得到纯菌落，转接至絮凝剂液体培养基筛选出一株高效高产量的生物絮凝剂产生菌株WdWJa sp.。具体筛选步骤如下
(I)取15 mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养18 48 h，获得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤(I)的培养条件:Γ4次，获得驯化菌液；
(3)梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分别取100 μ L驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30°C的培养箱中，培养18^48 h，获得单菌落；
(4)利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落；
(5)将纯菌落加入100mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150r/min的摇床中培养18 h，获得种子液；
(6)取10mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率。其中YP液体基础培养基的组成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有15^18g琼脂；絮凝剂液体培养基的组成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 gMg(SO4) · 7Η20，0· I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。本发明筛选方法的步骤(2)中获得的驯化菌液OD66tl为I. O，培养基均在112°C下灭菌30 min后使用。菌株sp.发酵生产的生物絮凝剂对药品和个人护理品中抗生素类药物磺胺甲恶唑有良好的去除能力，应用在城市给水及污水处理中。本发明采用微生物纯培养技术从自然环境中筛选出生物絮凝剂产生菌Klebsiella sp.，实现了生物絮凝剂的制备，为生物絮凝剂的产业化提供了高效产絮菌种，提高了絮凝剂的产量及絮凝效能，解决了生物絮凝剂产量低、人工调控性差及处理底物单一的问题，这种Klebsiella sp.,是高效高产量的发酵生物絮凝剂,在处理磺胺甲恶唑中应用，可有效去除磺胺甲恶唑，降低了生产能耗，对城市污水厂中痕量污染物有良好的去除能力，达到出水水质要求。
图I是本发明菌株对污染物去除率的影响因素(pH值)。图2是本发明菌株对污染物去除率的影响因素(絮凝剂投加量)。图3是本发明菌株对污染物去除率的影响因素(助凝剂投加量)。图4是本发明菌株对污染物去除率的影响因素(温度)。图5是本发明菌株处理磺胺甲恶唑污水的吸附平衡时间。
具体实施例方式实施例I，一株高效生物絮凝剂产生菌，为克雷伯氏菌MFXsp.)，于2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 6243。
其筛选方法为
(1)取15mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养18 48 h，获得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤(I)的培养条件:Γ4次，获得驯化菌液；
(3)梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分别取100 μ L驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30°C的培养箱中，培养18^48 h，获得单菌落；
(4)利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落；·
(5)将纯菌落加入100mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150r/min的摇床中培养18 h，获得种子液；
(6)取10mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率，絮凝率为94. 26%，此时的絮凝剂产量(干重)为4. 5 g/Lo(7)向制备好的发酵液中加入发酵液2倍体积95%的无水乙醇(无水乙醇要在4°C预冷)，搅拌后溶液中出现白色絮体，将白色絮体过滤收集。在过滤后的溶液中，再加入一倍体积95%的无水乙醇，再次提取白色絮体物质。在收集到的絮体中加入少量蒸馏水，使之溶解均匀，于室温放置20 h，之后放入超低温冰箱冷冻24 h，再放入冻干机中冻成干粉。其中YP液体基础培养基的组成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有15^18g琼脂；絮凝剂液体培养基的组成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 gMg(SO4) · 7Η20，0· I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。实施例2，将实施例I中菌种发酵产生的生物絮凝剂干粉溶于蒸馏水，配制成浓度为2g/L水溶液，投入I mg/L磺胺甲恶唑污水中。方法絮凝剂投加量分别为lmL、3mL、5mL、7mL、9mL ;助凝剂 CaCl2 溶液投加量为 O mL、0. 5 mL、l mL、l. 5 mL、2 mL ;pH 值调至 4、5、6、7、8 ;温度分别设定为5°C，15 °C, 25 °C，35 °C，45 °C，55 °C，摇床转数为140 r/min，反应0 h、0. 25 h、0. 5 h、0. 75h、l h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，结果如图 I-图 5 所示，最佳去除条件PH值为5，絮凝剂投加量为5 mL，助凝剂投加量为O. 5 mL，絮凝时间为I h，温度为35 °C。此条件下去除磺胺甲恶唑溶液效果良好，去除率可达67. 82 %。处理含有磺胺甲恶唑实际生活污水，根据单因素试验初步确定的絮凝条件最佳值，设计L9 (43)正交试验，优化生物絮凝剂去除磺胺甲恶唑的反应条件。结果如表I所示。PH值5，絮凝剂的投加量为8 mL，助凝剂的投加量为O. 2 mL，絮凝时间I h。通过比较极值得出各因素对去除率的影响度为RA>RB>RC>RD。即pH值的影响度最高，其次为絮凝剂投加量、助凝剂体积量和絮凝时间。经验证在此条件下生物絮凝剂对生活污水中磺胺甲恶唑的去除率达到53. 27 %。生物絮凝剂产生菌发酵生产的生物絮凝剂对生活污水中磺胺甲恶唑的去除效果的正交试验结果和直观分析见表一。
表一正交试验结果和直观分析表
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权利要求
1.一株高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于为克雷伯氏菌MFX {Klebsiella sp.)，于2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 6243。
2.根据权利要求I所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于具体筛选步骤如下 (1)取15mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养18 48 h，获得富集菌液； (2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤(I)的培养条件:Γ4次，获得驯化菌液； (3)梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分别取100 μ L驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30°C的培养箱中，培养18^48 h，获得单菌落； (4)利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落； (5)将纯菌落加入100mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150r/min的摇床中培养18 h，获得种子液； (6)取10mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 °C，转速为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率； 其中YP液体基础培养基的组成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有15 18g琼脂；絮凝剂液体培养基的组成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 g Mg(SO4) ·7Η20，O. I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。
3.根据权利要求2所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于筛选方法步骤(2)中获得的驯化菌液OD66tl为I. 0，培养基均在112°C下灭菌30 min后使用。
4.根据权利要求1、2、3之一所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于菌株发酵生产的生物絮凝剂对药品和个人护理品中抗生素类药物磺胺甲恶唑有良好的去除能力，应用在城市给水及污水处理中。
全文摘要
一株高效生物絮凝剂产生菌，它涉及城市给水、污水处理过程中痕量污染物的去除，解决了生物絮凝剂产量低、人工调控性差及处理底物单一的问题，筛选方法是取哈尔滨城市污水处理厂活性污泥驯化富集生物菌群，摇瓶稀释培养、平板划线、分离和纯化生物菌种，通过多次重复三区划线，得到纯种生物絮凝剂产生菌株KlebsiellaSp.，该菌株对城市生活污水中的痕量污染物去除率达到67.82%，本发明提高了城市污水中痕量污染物的去除率、降低了生产能耗。
文档编号C12N1/02GK102876600SQ20121033705
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者马放, 邢洁, 杨基先, 李昂, 庞长泷, 吴丹, 魏薇 申请人:哈尔滨工业大学宜兴环保研究院