一种高密度鹅肉香肠用发酵剂的培养方法
【专利摘要】一种高密度鹅肉香肠用发酵剂的培养方法，涉及以鹅肉为内容物的鹅肉香肠加工用发酵剂的制备技术，先对香肠乳杆菌的斜面菌株进行活化，再将活化的斜面菌株接入基础培养液中作种子培养，经接入第一种子发酵培养基中培养将一次培养液作离心分离后，再将离心分离取得的菌体投入第二种子发酵培养基中培养，再将二次培养液离心分离后干燥，得粉状发酵剂。本发明在鹅肉发酵香肠中的发酵可以由单菌或者多种菌共同完成。其中乳酸菌主要作用是将原料肉中的碳水化合物分解成乳酸而使pH值降低，抑制一些致腐微生物的生长，减少腐败，降低亚硝酸盐残留量及减少亚硝胺的形成，抑制病原微生物的生长和毒素的产生，提高制品的营养价值。
【专利说明】一种高密度鹅肉香肠用发酵剂的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及香肠加工【技术领域】，特别是以鹅肉为内容物的鹅肉香肠加工用发酵剂的制备技术。
【背景技术】 [0002]2011年世界卫生组织将鹅肉作为健康食品列为肉类食品的金榜之首，基于其不饱和脂肪酸高，具有与橄榄油相似的降低胆固醇、预防心血管疾病之功效。但是，鹅肉同时也是各种家禽肉中嫩度最低的，因为鹅肉表面多覆盖有结缔组织，胸肉肌纤维较粗，肌纤维之间也有结缔组织，肉质粗老，口感坚韧，硬度较大，难为消费者接受，使消费人群在近20年来一直局限于我国的部分区域，与产鹅第一大国不相适应，而利用发酵嫩化新技术加工发酵香肠等重组肉，是改善其嫩度的有效措施。
[0003]鹅肉香肠是具有我国特色的传统食品，具有风味独特、食用方便等特点。但长期以来多采用类同与猪肉香肠一样的加工技术，这种传统工艺起始发酵剂数量低，发酵启动慢、发酵时间长，导致产品持水力低，口感坚韧，鹅肉的粗老质感未有显著改观。
[0004]在制备发酵剂产品时，如采用传统的培养方法生产，菌体生物量在发酵液中的浓度比较低，培养液中的菌密度只能达到106cfu/mL~107cfu/mL，效益低下。因为在常规培养过程中，随着酸度升高，PH值降低，菌体生长受到抑制，其菌密度多在较低水平徘徊。为解除或降低这些代谢产物对菌体生长的抑制，一般采用化学中和法，即在培养过程中添加碱液以中和发酵液中的酸，常用的中和剂有NaOH、NH3 ^H2OXa(OH)2和Na2CO3等，其不足之处是在中和培养过程中，随着乳酸盐浓度的不断增加，积累达到一定水平时，仍会抑制菌体的生长繁殖，菌密度难于超过108cfu/mL。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提出一种可提高鹅肉的嫩度，缩短发酵时间的高密度鹅肉香肠用发酵剂的培养方法。
[0006]本发明技术方案是:先对香肠乳杆菌的斜面菌株进行活化，接着将活化的斜面菌株接入基础培养液中作种子培养，再将种子培养物接入第一种子发酵培养基中，在温度环境为37°C的条件下进行一次培养，取得一次培养液，将一次培养液作离心分离后，再将离心分离取得的菌体投入第二种子发酵培养基中在温度环境为37°C的条件下进行二次培养，取得二次培养液，再将二次培养液离心分离后干燥，得粉状发酵剂。
[0007]本发明一次培养得到的菌密度为9.8X 108cfu/mL，二次培养得到的菌体度达到31X108cfu/mL，最终的粉状发酵剂中含菌量达到4.0 X 10ncfu/g。
[0008]本发明选用的香肠乳杆菌为国家许可的安全生产菌株，为乳酸细菌中乳杆菌属的一种，其在鹅肉发酵香肠中的发酵可以由单菌或者多种菌共同完成。其中乳酸菌主要作用是将原料肉中的碳水化合物分解成乳酸而使PH值降低，抑制一些致腐微生物的生长，减少腐败，降低亚硝酸盐残留量及减少亚硝胺的形成，抑制病原微生物的生长和毒素的产生，提高制品的营养价值。
[0009]本发明以高密度培养技术加工出菌体密度高的发酵剂，对原料肉经腌制、绞碎与斩拌预处理，加入一定比例发酵剂及混匀，再经灌肠，在控温条件下发酵制成鹅肉香肠产品，由于菌剂的乳酸发酵、酒精发酵及分泌的多种酶类的协同作用，使鹅肉的肉质嫩化，发挥产酸、生香、脱异味作用，赋予鹅肉香肠新产品特殊的芳香味和浓厚的醇香味，以及良好的发色效果和耐藏性。由于投入发酵剂的密度高，使产品的发酵时间大大缩短，这种嫩化发酵香肠与专用发酵剂及其生产与应用的技术，对缩短鹅肉香肠产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用。
[0010]本发明利用高密度培养技术将乳酸菌制成高度浓缩的菌种，形成直投式发酵剂，其优越性体现在:
1、可直接加入鹅肉类原料中进行发酵，而无需食品企业对其进行活化、扩培等其它预处理工作，省去扩大培养(母发酵剂-中间发酵剂-生产发酵剂)的复杂操作，通过向专业生产厂家购置，简化食品的生产工艺，提高劳动生产率，以及减少食品加工企业对菌种车间与设备的投资，减少空间投入，降低生产成本。
[0011]2、可在使用过程中有效防止菌种的退化、污染，延长使用期(冻藏发酵剂大于3个月，冻干发酵剂4°C，大于I年)。
[0012]3、优质高密度浓缩发酵剂除了具有菌密度高、体积小、携带方便特点，还由于活力强，应用于鹅肉发酵香肠生产中，可减少发酵剂的投料量(较传统人工型发酵剂降低100?1000倍)，缩短香肠发酵周期(较常规的缩短时间20%)。
[0013]4、有利于维持食品新鲜度与细嫩度，便于质量控制，提高鹅肉香肠新产品的市场竞争力。
[0014]本发明所述第一种子发酵培养基、第二种子发酵培养基分别由水、复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁组成，所述复合糖由质量比为1:1的葡萄糖和乳糖组成，所述复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁分别占种子发酵培养基总质量的2.0%、1.5%、0.5%、0.05%,0.25%,0.1%和10% ;所述种子发酵培养基的pH值为6.5。
[0015]本发明的种子发酵培养基以牛肉膏为氮源，但是牛肉膏并非单独的氮源，组成成分丰富，还带入了其它生长因子，而能促进菌体的生长。由质量比为1:1的葡萄糖和乳糖组成的复合糖的活菌量高，及能与代谢物乳糖结合缓解较低PH的抑菌作用。加入柠檬酸钠可使菌量增高，使用后可以降低培养液酸性，使菌体在培养过程中不易受到酸损伤，对菌体细胞的积累有显著的促进作用。加入的番茄汁可以提供维生素等生长因子，使菌体产量大为提闻。
[0016]种子发酵培养基的初始pH值为6.5，其中活菌数达到最高，其优点是繁殖快、活力强，通过提高培养基的缓冲能力，控制培养基PH值的变化幅度，对细胞的积累可以发挥出更大的调节作用。
[0017]本发明所述种子培养物接入种子发酵培养基中的接种量至少为4%。当接种量自4%起发酵液菌体产量最高，可以缩短延迟期，加快菌体生长，使活菌数达到最大。因为接种量的高低直接影响生产菌株在发酵过程中生长繁殖及代谢产物的积累，接种量过低低，菌体生长缓慢，不利于产物的积累，而如接种量的增大使乳酸菌的生长过快，导致菌体老化快，从而影响乳酸菌的生长。
[0018]所述离心分离是在4°C温度环境下，以4000r / min的速度离心处理lOmin。适当的条件既可避免离心力机械作用至部分菌体死亡，也避免部分菌体必然残留在上清液中而丢失，确保离心后有较高的存活率、收得率。
[0019]所述干燥是在二次培养液离心分离后取得的菌体中混溶甘油后进行真空冻干处理。经干燥后可获得含水量为1.5%?3.0%的浓缩型干燥发酵剂，含菌量达到4.0X IO11Cfu/go其优点:一是经离心获得的高密度细胞可降低每个细胞暴露在介质中的面积，提高抗冷冻干燥能力，使活菌含量高；二是控制含水量既可避免过干致冻干死亡率提高，又可通过去除多余的水分又能提高发酵剂在冻干过程中的存活率，以及保藏期间的细胞稳定性，缩小体积及便于携带。在4°C下保藏期达I年，保藏期内菌体成活率高于95%。
【具体实施方式】
[0020]一、菌株活化:
取斜面保藏的香肠乳杆菌菌种接种新鲜斜面(配方为:葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，琼脂0.8%，pH6.5)，于37°C下静置培养21h，并以同样的操作再传代一次，取得活化的香肠乳杆菌斜面种子。其特点是提高菌株的酶活性和生理功能。
[0021]二、种子培养:
取I?2环活化的斜面种子接入装有IOOmL基础培养基(配方为:葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，pH6.5)的250mL三角瓶中，作37°C静置培养21h。其特点是确保达到应有的菌体密度，及便于定量转移接种与高密度培养基的优化。
[0022]三、高密度培养:
(一)基础发酵培养基配方:
葡萄糖2.0%、牛肉膏1.0%、柠檬酸钠0.5%、吐温80 0.05%、氯化钠0.25%、硫酸镁
0.1%，番茄汁10%，其余为水，pH值为6.5。
[0023](二)发酵培养的方法:
以5%接种量，将种子接入装有IOOmL基础发酵培养基的250mL的三角瓶中，作37°C静置培养2 Ih，得发酵培养物。
[0024](三)高密度培养基组分的优化构建与培养条件的确定:
优化对象:氮的种类及其含量、碳的种类及其含量、起始PH值、缓冲盐的影响、生长因子的影响、接种量、培养环境中的温度。
[0025]1、氮的种类优化
以普通蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵的1%添加量加入基础发酵培养基，接种发酵培养物，经作37°C静置培养21h，培养后得出，添加牛肉膏对乳酸菌影响最为显著。其优点是:牛肉膏并非单独的氮源，组成成分丰富，还带入了其它生长因子，而能促进菌体的生长。
[0026]2、碳的种类优化:
以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖及复合糖[葡萄糖:乳糖(质量比为1:1)]的2%添加量接入基础发酵培养基，接种发酵培养物，经作37°C静置培养21h后，测定发酵液的滴定酸度C T)，并进行活菌计数，经综合考虑得出以复合糖为宜，其优点是活菌量高，及能与代谢物乳糖结合缓解较低PH的抑菌作用。
[0027]3、初始pH值的优化:
把基础发酵培养基的初始pH值调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接种发酵培养物，经作37°C静置培养21h后，测定各样品的活菌数，结果初始pH值为6.5者活菌数达到最高，其优点是繁殖快、活力强，通过提高培养基的缓冲能力，控制培养基PH值的变化幅度，对细胞的积累可以发挥出更大的调节作用。
[0028]4、缓冲盐与生长因子的种类优化:
以柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸氢二钠的0.5%添加量加入基础发酵培养基，接种发酵培养物，经作37°C静置培养21h后，测定发酵液的滴定酸度CT)，并进行活菌计数，结果以加入柠檬酸钠为佳，其优点是菌量高，使用后可以降低培养液酸性，使菌体在培养过程中不易受到酸损伤，对菌体细胞的积累有显著的促进作用。
[0029]以未添加生长因子为对照，以番茄汁10%添加量加入基础发酵培养基，接种发酵培养物，经作37°C静置培养21h后，测定发酵液的滴定酸度CT)，并进行活菌计数，结果以番茄汁10%添加为佳，优点是可以提供维生素等生长因子，使菌体产量大为提高。
[0030]5、发酵剂接种量的选择:
以2%、3%、4%、5%、6%、7%起始接种量，将发酵培养物接入基础发酵培养基，经作37°C静置培养21h后，计数，结果4%起始接种量的，发酵液菌体产量最高。其优点是适宜的接种量可以缩短延迟期，加快菌体生长，使活菌数达到最大。因为接种量的高低直接影响生产菌株在发酵过程中生长繁殖及代谢产物的积累，接种量过低低，菌体生长缓慢，不利于产物的积累，而如接种量的增大使乳酸菌的生长过快，导致菌体老化快，从而影响乳酸菌的生长。
[0031]6、培养温度条件的优化:
在以上单因素试验基础上，以4%起始接种量，将发酵培养物接入按优化配方调整的发酵培养基，以相同的体积分装于三角瓶中，于15°C、20°C、25°C，33°C、37°C、42°C条件下培养21h，得出适宜条件为37°C，其优点是活菌量高，因为对确定的菌株而言，由于培养基不同，最适生长温度有别，并影响最终的生长速度。
[0032]7、高密度培养基与培养条件的确定:
在以上单因素试验基础上，以复合糖(％) (0.75: 0.75, I: 1,1.25: 1.25)、牛肉膏(%) (0.5, 1.0, 1.5)、柠檬酸钠(％) (0.25,0.50，0.75)、接种量(％) (3，4，5)作正交试验，测定活菌密度，得出该发酵剂高密度培养的最佳因素组合:
葡萄糖:乳糖(1: 1)2.0%、牛肉膏1.5%、柠檬酸钠0.5%、吐温80 0.05%、氯化钠0.25%、硫酸镁0.1%，番茄汁10%，pH值为6.5，经37°C培养21h，得到的菌密度为
9.8X108cfu/mL。
[0033]四、高密度培养物的后处理:
高密度发酵物的后处理技术包括:离心分离、换培养液二次培养、再离心分离、干燥、真空包装、保藏。
[0034]1、离心分离:
在高密度培养菌体至终点后，作离心分离，将细胞保留。方法是将培养液移入无菌的离心管中，选择 4°C 下，分别作(4000r / min, 6min)、(4000r / min, lOmin)、(4000r / min,14min)> (6000r / min, 6min)、(6000r / min, lOmin)、(6000r / min, 15min)离心条件选择，收获菌体，去除上清液(清除菌体代谢中产生的乳酸盐等有害物质)，通过测定离心前后的活菌数，确定最适离心条件为:4°C、4000r / min、离心10 min为收集香肠乳杆菌的最佳条件。其优点是既避免离心力机械作用至部分菌体死亡，也避免部分菌体必然残留在上清液中而丢失，确保离心后有较高的存活率、收得率。
[0035]2、换液二次培养
将在优选离心条件下收集的香肠乳杆菌菌体置于灭菌发酵罐中，投入新鲜高密度培养液，在温度环境为37°C的条件下进行二次培养至终点时，收集培养物，作离心分离(4°C、4000r / min、离心10 min)，测定培养液的OD值，得出经补料连续培养14h后的菌体密度为 3.lX109cfu/mLo
[0036]二次培养的优点是用新的培养基进行培养，生长较快地进入对数生长期，结果进一步提高了菌体密度，达到高密度的标准要求。
[0037]注:新鲜高密度培养液同样由水、复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁组成，所述复合糖由质量比为1:1的葡萄糖和乳糖组成，所述复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁分别占种子发酵培养基总质量的2.0%、1.5%、0.5%、0.05%,0.25%,0.1% 和 10% ； pH 值为 6.5。
[0038]3、干燥、包装与保藏
将经换液培养所得的高密度培养物，经4°C下以4000 r / min转速离心10 min，去除上清液，加入无菌4%甘油混溶，经真空冻干处理，获得含水量为1.5%?3.0%的浓缩型干燥发酵剂，含菌量达到4.0 X 10ncfu/g。
[0039]其优点:一是经离心获得的高密度细胞可降低每个细胞暴露在介质中的面积，提高抗冷冻干燥能力，使活菌含量高；二是控制含水量既可避免过干致冻干死亡率提高，又可通过去除多余的水分又能提高发酵剂在冻干过程中的存活率，以及保藏期间的细胞稳定性，缩小体积及便于携带。
[0040]将真空冻干发酵剂装入预先灭菌的铝箔袋内，真空包装，4°C保藏，备用。其特点是避免了常压包装中所带O2会打破菌体休眠状态的不足，4°C下保藏期达I年，保藏期内菌体成活率高于95%。
[0041]五、高密度发酵剂的应用:
1、高密度发酵剂的预处理:
将高密度发酵剂按Ig加无菌生理盐水IOOmL作复水处理，摇匀，制得菌悬液，待用。其特点是便于均匀地分布于肉馅中。
[0042]2、高密度发酵剂的加入与鹅肉发酵香肠的加工:
鹅肉香肠加工流程为:原料肉预处理，绞碎，拌馅腌制，拌料接种(高密度发酵剂接种量约3.0 X 109cfu/g肉重//与常规接菌量3.0 X 105cfu/g肉重比较)，灌肠，高温脱水，发酵(温度20°C，相对湿度90%?95%)，干燥成熟。
[0043]特点:一是使用高密度发酵剂活菌数高，体积小，用量少，接菌时只需简单的复水溶解即可，方便操作，菌体不易污染与退化；二是由于起始发酵剂菌数高，缩短发酵期20%，口感更细嫩，减少了发酵过程中脂肪的氧化。
【权利要求】
1.一种高密度鹅肉香肠用发酵剂的培养方法，其特征在于:先对香肠乳杆菌的斜面菌株进行活化，接着将活化的斜面菌株接入基础培养液中作种子培养，再将种子培养物接入第一种子发酵培养基中，在温度环境为37°c的条件下进行一次培养，取得一次培养液，将一次培养液作离心分离后，再将离心分离取得的菌体投入第二种子发酵培养基中在温度环境为37°C的条件下进行二次培养，取得二次培养液，再将二次培养液离心分离后干燥，得粉状发酵剂。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于:所述第一种子发酵培养基、第二种子发酵培养基分别由水、复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁组成，所述复合糖由质量比为1:1的葡萄糖和乳糖组成，所述复合糖、牛肉膏、柠檬酸钠、吐温80、氯化钠、硫酸镁和番茄汁分别占种子发酵培养基总质量的2.0%、1.5%、0.5%、0.05%,0.25%、0.1%和10% ;所述种子发酵培养基的pH值为6.5。
3.根据权利要求1或2所述培养方法，其特征在于:所述种子培养物接入种子发酵培养基中的接种量至少为4%。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于:所述离心分离是在4°C温度环境下，以4000r / min的速度离心处理IOmin0
5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于:所述干燥是在二次培养液离心分离后取得的菌体中混溶甘油后进行真空冻干处理。
【文档编号】A23L1/317GK103704741SQ201410003897
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】董杰, 董立伟, 蒋云升 申请人:扬州大学