专利名称：一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法。
背景技术：
目前，在规模化养猪场中，细菌感染十分普遍，尤其是在免疫抑制疾病发生的地区较为常见。当前，副猪嗜血杆菌是三大最主要的细菌病之一，具有多血清型，加上耐药性产生频繁，给临床免疫防治带来了困难。该菌在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。至今从北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北、陕西等省分离出了副猪嗜血杆菌，以血清4型和5型最为流行，其次为 13型、14型和12型，局部地区的流行呈较高发病率和死亡率，而且在生产中副猪嗜血杆菌致病的情况比链球菌还要严重，也更难控制。过去很长一段时间我国猪场对副猪嗜血杆菌的防治，都依赖于国外进口疫苗(西班牙海博莱等)，而Hiprasuis又没有说明它的疫苗是主要是针对哪几种血清型，所以，对我国当前流行的血清型，效果仍不是很清楚。直到2007年，武汉科前动物生物制品有限责任公司开发出国内第一个获得批准文号的针对我国流行血清型的4型和5型二价灭活疫苗，由于其免疫保护力高，持续时间长，逐步占领了国内副猪嗜血杆菌疫苗市场。但由于我国细菌性疫苗的关键生产技术中，菌体高密度培养技术的滞后，尤其对副猪嗜血杆菌的培养没有固定的培养基和针对其生长特性的培养条件控制手段，目前国内外较多应用一种商业培养基为TSB来培养副猪嗜血杆菌，培养控制方式也简单化，这种培养基虽然使用方便， 但在培养过程中，具有菌体生长缓慢，对不同血清型的菌株培养差异大，成本高等缺点，其发酵终点的活菌数为10 20亿，不适合大规模增菌使用。在本申请提出以前，武汉科前动物生物制品有限责任公司及华中农业大学2010 年12月15日已申报了一种副猪嗜血杆菌5型高密度发酵培养基及应用专利(专利申请号 201010596059.幻，该专利提供了一种针对副猪嗜血杆菌5型高性能的发酵培养基，保护内容为培养基的组分及配比。本发明进一步尝试在发酵罐中试放大中改进副猪嗜血杆菌常规培养的培养方法， 通过在培养基、最适温度、PH值、溶氧浓度(DO)、代谢产物的调控等方面进行探索，优化高密度培养的各种条件，进行工业放大研究，提高培养密度和目的产物含量，最终完成高密度培养的工艺控制参数的成套技术定型和规模化示范生产线。
发明内容
本发明的目的旨在于提供一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法，本方法原料来源广泛、成本低廉，并较常规的发酵方法生长快、菌体密度高，易于实现副猪嗜血杆菌抗原的大规模高密度培养。通过本发明方法的实施可以解决我国副猪嗜血杆菌全菌体疫苗的关键生产技术中，菌体高密度培养技术滞后的问题。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施所说的高密度培养副猪嗜血杆菌的方法如下将冻干保存的副猪嗜血杆菌野生种和(或)突变种在TSA平皿上活化后，用TSB摇瓶种子培养基进行一次扩增，再用自配优化摇瓶种子培养基进行二次扩增，然后接种到3L至100L发酵罐自配优化发酵培养基中放大培养，通过PH控制、溶氧控制等手段维持菌体的对数生长，当pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌。上述至病猪分离的各种血清型副猪嗜血杆菌野生种和(或)经过减毒改造的突变种，具体涉及副猪嗜血杆菌4型、5型、13型等，上述菌种由由华中农业大学(蔡旭旺，刘正飞，陈焕春等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报，2005，M(I) 55 58.)提供。一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法，其步骤是A、将冻干种子菌4型、5型和(或)13型用TSA平板活化10 16h，至明显单菌落长出。所述的种子菌为4型、5型或13型中的一种或1-3种的任意组合。B、挑取3 6个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养8 14h至0D_值达到0. 4 0. 6C、以 5% (V/V)接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基中，培养 8 Ia1至对数生长期。D、以 3% (V/V)接种量将二级种子液转接发酵罐发酵培养基，通过pH控制 (pH*6.8 7. 2)、OD控制(0D为40% 60% )维持菌体对数生长，至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌菌体抗原。所述的二级种子培养基成分为酵母粉(10 30g/L)、谷氨酸钠(3 6g/L)、氯化钠(2 5g/L)、硫酸镁(0. 1 0. 3g/L)、pH为7. 2的IM磷酸缓冲液3% V/V)及添加一定量的牛血清(5% 10% V/V)和少量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 001% 0. 01% m/ V)。所述的发酵培养基成分为酵母粉OO 40g/L)、谷氨酸钠(3 6g/L)、氯化钠O 5g/L)、磷酸氢二钾(1 4g/L)、硫酸镁(0. 1 0. 3g/L)及添加一定量的牛血清 (2% 7% V/V)和少量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 001% 0. 01%m/V)。上述在培养过程中控制pH下降，其pH控制手段为在培养过程中在线流加氨水溶液控PH值在6. 8 7. 2上述在对数生长期控制一定的氧浓度，其特征在于通过加速搅拌和提高通气量维持DO值在40% 60%。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果菌体生长快、菌体密度高，易于规模化放大生产，且原料简单，成本低廉，适用于多种血清型菌株的培养。本发明通过对副猪嗜血杆菌的高密度培养，可以较商业化TSB培养基常规发酵，在降低成本的同时，大大提高发酵终点的活菌密度。
图1为一种在常规TSB培养条件下和本发明优化培养条件下，副猪嗜血杆菌5型菌体生长曲线的比较。
图2为一种在常规TSB培养条件下和本发明优化培养条件下，副猪嗜血杆菌4型菌体生长曲线的比较。
具体实施例方式实施例1 :3L 二级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型SH0165株，于2001年4月从河北省石家庄市的发病猪场分离(请见蔡旭旺，刘正飞，陈焕春等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报，2005，M(I) 55 58.)种子培养TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为 0. 461.发酵培养酵母粉(30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/ L)，用NaOH调pH至7. 2左右，121灭菌20min,再加pH为7. 2的IM磷酸缓冲液(3% V/V)、 牛血清(7% V/V)、NADdOy g/L)，以2% V/V接种量接入种子培养基后，在160r/min的搅拌及0. 7VVM的通气条件下发酵。发酵6小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵 14小时活菌数达到最大值41. 5亿。实施例2 :3L 二级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型，来源同实施例1种子培养TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为 0. 454。发酵培养酵母粉(30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/ L)，用NaOH调pH至7. 2左右，121灭菌20min,再加pH为7. 2的IM磷酸缓冲液(3% V/V)、 牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接种量接入种子培养基后，在160r/min的搅拌及0. 7VVM的通气条件下发酵。发酵6小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵 12小时活菌数达到最大值49. 5亿。实施例3 :3L 二级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型，来源同实施例1种子培养TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和 10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为 0. 410.发酵培养酵母粉(30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/ L)，磷酸氢二钾(2g/L)，用NaOH调pH至7. 2左右，121灭菌20min，再加入牛血清(5% V/ V)、NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接种量接入种子培养基，在180r/min的搅拌及0. 8VVM的通气条件下发酵，流加1 4稀释的浓氨水控制pH值在7. 2士0.1，发酵6小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵13小时活菌数达到最大值58. 3亿。实施例4 3L 二级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型，来源同实施例1种子培养TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为 0. 470.发酵培养酵母粉(30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/ L)，磷酸氢二钾(2g/L)，用NaOH调pH至7. 2左右，121灭菌20min，再加入牛血清(5%V/V), NAD (20 μ g/L)，以4% V/V接种量接入种子培养基，在120 200 (r/min)的搅拌及0. 5 I(VVM)的通气条件下控制DO值为50% 60%，流加1 4稀释的浓氨水控制pH值在 7.2士0. 1，发酵6小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵15小时活菌数达到最大值62. 3亿。实施例5 :50L三级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型，来源同实施例1一级种子培养一级种子液为TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为0. 427二级种子培养以4% V/V的接种量转接二级种子培养基，其组分为酵母粉 (30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/L)，pH为7. 2的IM磷酸缓冲液(2% V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，发酵 10h，测 OD 值约为 1. 11。发酵培养酵母粉(40g/L)、谷氨酸钠(3g/L)硫酸镁(0. 15g/L)，磷酸氢二钾Qg/ L)，氯化钠(2. 5g/L)，用NaOH调pH至7. 2左右，121灭菌20min,再加牛血清(5 % V/V)、 NAD (20 μ g/L)，以2 % V/V接种量接入二级种子培养基，通过搅拌控制转速(150 170r/ min)及通气量(0. 5 1VVM)维持溶解氧OD值为40% 60%，在线流加浓氨水控制pH值在7. 2士0. 1，发酵4小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵12小时活菌数达到最大值70亿。实施例6 100L三级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌5型，来源同实施例1一级种子培养一级种子液为TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵1 后，测OD值约为0.418二级种子培养以4% V/V的接种量转接二级种子培养基，其组分为酵母粉 (30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/L)，pH为7. 2的IM磷酸缓冲液(2%V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，发酵 10h，测 OD 值约为 0.978。发酵培养酵母粉(40g/L)、硫酸镁(0. 15g/L)，磷酸氢二钾Og/L)，氯化钠(2. 5g/ L)，用 NaOHi周 pH 至 7. 2 左右，121 灭菌 20min,再加牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以 3% V/V接种量接入二级种子培养基，通过搅拌控制转速(180 220r/min)及通气量(0. 5 1VVM)维持溶解氧OD值为40% 50%，在线流加浓氨水控制pH值在7. 2 士 0. 1，发酵6小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵12小时活菌数达到最大值56亿。实施例7 100L三级发酵罐发酵菌株猪嗜血杆菌4型MD0322株，于2001年8月分离自湖北枝江市某发病猪场 (请见蔡旭旺，刘正飞，陈焕春等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报，2005，24(1) 55 58.)
一级种子培养一级种子液为TSB培养基(美国BD公司，按3%浓度配制)，加7% (V/V)牛血清和10 μ g/L的NAD，从平皿上调取3 5个单菌落接种后，放入摇床发酵IOh 后，测OD值约为0. 574，二级种子培养以4% V/V的接种量转接二级种子培养基，其组分为酵母粉 (30g/L)、谷氨酸钠(3g/L)、氯化钠(2. 5g/L)、硫酸镁(0. 15g/L)，pH为7. 2的IM磷酸缓冲液(2%V/V)、牛血清(7% V/V)、NAD (10 μ g/L)，发酵 10h，测 OD 值约为 1.556。发酵培养酵母粉(40g/L)、硫酸镁(0. 15g/L)，磷酸氢二钾Og/L)，氯化钠(1. 5g/ L)，用 NaOHi周 pH 至 7. 2 左右，121 灭菌 20min,再加牛血清(5% V/V)、NAD (20 μ g/L)，以 2% V/V接种量接入二级种子培养基，通过搅拌控制转速(160 200r/min)及通气量(0. 5 1VVM)维持溶解氧OD值为40% 50%，在线流加浓氨水控制pH值在7. 2 士 0. 1，发酵4小时后每隔1小时取样测活菌数，结果显示，发酵10小时活菌数达到最大值41亿。
权利要求
1. 一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法，其步骤是 A、将冻干种子菌4型、5型和或13型用TSA平板活化l(Tl6h，至单菌落长出； 挑取3飞个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养纩14h至0D_值达到0. 4^0. 6 ； 以19T5%V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养81 至对数生长期；以19T3%V/V接种量将二级种子液转接发酵罐发酵培养基，通过ρΗ控制，ρΗ为 6. 8^7. 2、0D控制，OD为40%飞0%，维持菌体对数生长，至ρΗ值稳定及溶氧回升时，放罐收菌， 得到高密度的副猪嗜血杆菌菌体抗原；所述的二级种子培养基成分为酵母粉1(T30 g/L、谷氨酸钠；Γ6 g/L、氯化钠2、g/ L、硫酸镁0. Γ0. 3 g/L、pH为7. 2的IM磷酸缓冲液1% 3 % V/V及添加牛血清5% 10% V/V 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0. 0001% m/V ；所述的发酵培养基成分为酵母粉2(T40g/L、谷氨酸钠;Γ6 g/L、氯化钠2、g/L、磷酸氢二钾广4 g/L、硫酸镁0. Γ0. 3 g/L及添加牛血清29T7%V/V和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0. 001% 0· 01% m/V ；所述的种子菌为4型、5型或13型中的一种或1-3种的任意组合。
全文摘要
本发明公开了一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法，其步骤是A、将冻干种子菌4型、5型和(或)13型用TSA平板活化10~16h，至单菌落长出；B、挑取3~6个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养8~14h至OD600值达到0.4~0.6；C、以1%~5%V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养8~12h至对数生长期；D、以1%~3%V/V接种量将二级种子液转接发酵罐发酵培养基，通过pH控制，pH为6.8~7.2、OD控制，OD为40%~60%，维持菌体对数生长，至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌菌体抗原。本发酵方法原料来源广泛、成本低廉，菌体生长快、密度高，易于实现副猪嗜血杆菌抗原的大规模高密度培养。
文档编号C12R1/21GK102220272SQ201110145940
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者尹争艳, 徐高原, 方玉林, 曹毅, 王杨波, 金梅林, 陈关平, 陈焕春, 韩进 申请人:武汉科前动物生物制品有限责任公司