专利名称：一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物的应用技术，具体涉及一种海洋真菌裂殖壶菌SD116菌株及利用其高密度发酵生产DHA的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、降血脂、保护视力、抗癌和提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行业。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低白化病的得病率。生产DHA的传统原料主要为鱼油，但通过鱼油生产DHA存在以下不足(I)鱼油资 源有限，产量不稳定，鱼油产量及品质波动很大，远远不能满足市场需求。(2)鱼油中DHA含量不高，仅占7% 14%，且很难与大量的EPA和其它结构类似的高度不饱和脂肪酸分离纯化工艺复杂，生产成本较高，产品得率低。在实际生产过程中，ω-3多不饱和脂肪酸被氢化饱和，降低了其在鱼油中的含量，造成了原料的浪费，也损害了 DHA和EPA的品质(4)鱼油易于氧化，难以应用于食品添加剂行业。由于鱼油含有很重的且难闻的鱼腥味，即使经过复杂的提纯工艺也难以除去，限制了这类DHA的应用范围。(5)基于DHA等ω-3多不饱和脂肪酸的市场需求的不断增加，将会导致过量捕捞行为的出现，不利于环境资源的保护。因此，寻找DHA商业化生产的替代来源受到了广泛关注。近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究，常用的微生物包括裂殖壶菌、隐甲藻等。裂殖壶菌(Aurantiochytriumsp.)是一种海洋真菌，属于 Chromophyta 界，Heterokonta 丨 J, Thraustochytrialcs 目，Thraustochytriaceae 科，A urantiochytrium属。裂殖壶菌具备生长快、抗逆性强、脂类含量高等特点。此外，在它的脂肪酸中C14:0，C16:0, C22:5 (DPA), C22:6 (DHA).占总脂肪酸含量的90%左右，具有很高的营养价值并且相对容易分离。目前国内利用裂殖壶菌制备DHA油脂的专利主要有五篇。其中，专利CN00135338. 1，CN200410075426. X，CN200610028869. 2 和 CN 200910061419. 7 采用简单的培养方法和培养条件的优化，导致生物量均不高，最高仅为42. 5g/L，没有实现真正意义上的高密度发酵。专利CN200910033869. 5实现了较高的发酵密度，产量达到了 70g/L，但细胞内积累的油脂含量不高，仅为31. 5g/L。为了使微生物来源的DHA油脂形成明显的价格优势，获得DHA的高产菌株及发酵工艺，获得较高的生物量和油脂含量，是海洋微生物发酵生产DHA工业化推广的关键。
发明内容
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种自主筛选、高产DHA油脂的裂殖壶菌以及利用这种裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法。本发明的技术方案是
一种裂殖壶菌,其分类命名为裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp),实验室命名为裂殖壶菌SD116菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No :6208，保藏日期2012年6月12日。所述裂殖壶菌是从广东电白水东湾红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。通过培养，在光学显微镜下观察形态及结构发现(图I) SD116菌体为圆球形或椭球形，直径在5 20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。有侧生不等长的双鞭毛。细胞生长前期分裂旺盛，呈现二分裂、四分裂，连在一起。通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可以看出其主要的长链多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA总脂肪酸的含量在40%左右。饱和脂肪酸主要为十四烷酸和十六烷酸。因此，该菌脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。裂殖壶菌Aurantiochytrium sp. SD116菌株具有广盐性，能在O 60g/L的盐浓度下午长，最适盐浓度为10g/L 20g/L ;该菌株有嗜酸特性，能在pH4 7范围内生长；此 夕卜，该菌株的最适生长温度为15°C 30°C。一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，以CGMCC No :6208菌株为出发菌株，在液体培养基中高密度发酵，分离得到菌体细胞，将菌体细胞经破碎、萃取、精制获得富含DHA的油脂。优选的是，所述高密度发酵方法包括如下步骤①将保存在甘油管的菌株接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在20 30°C的遥床中，以150 200rpm的转速，培养24 48h，获得一级种子；②将一级种子接入装有IOOml种子培养基的500ml摇瓶中，在20 30°C的遥床中，以150 200rpm的转速，培养24 48h，获得二级种子；③将二级种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2 10% (v/v)，通气量O. 2 2vvm，搅拌转速200 800rpm，罐温20 30°C，pH 6 7，发酵生产DHA油脂。优选的是，所述种子培养基中，碳源含量为30 60g/L,氮源含量为10 20g/L,溶剂为海水和蒸馏水(I l,w/w)的混合物。优选的是，所述碳源为葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木质纤维素糖化液；所述氮源为有机氮源或无机氮源，所述有机氮源为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、生肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸钠或尿素，所述无机氮源为氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、氨水或硝酸钾。优选的是，所述发酵培养基中包含如下组分葡萄糖20 60g/L，酵母提取物5 30g/L，蛋白胨5 20g/L，磷酸二氢钾O. 5 8g/L，硫酸镁O. 5 5g/L，柠檬酸钠O. 5 5g/L,海水晶5 30g/L，维生素B130 200mg/L，维生素B630 200mg/L，维生素B125 50mg/L,生物素 2 50mg/L。优选的是，所述步骤③中，采用柠檬酸和氨水调节pH值，所述柠檬酸的浓度为5 20% (w/v),所述氨水的浓度为5 30% (w/v);所述发酵步骤还包括补糖操作,保证葡萄糖的浓度为20 60g/L ;所述发酵时间为80 110h，发酵结束时葡萄糖浓度不高于10g/L。优选的是，所述分离方法为离心、过滤或絮凝；所述破碎方法为挤压破壁或酶解法破壁；所述萃取、精制步骤为利用非极性溶剂回收含DHA的粗油，将所述粗油精炼得到DHA油脂优选的是，所述非极性溶剂为正己烷或正己烷-乙醇的混合溶剂。优选的是，所述步骤③发酵的方式为分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵本发明的有益效果是本发明提供了一种自主筛选的裂殖壶菌高产菌株，并提供了一种利用这种裂殖壶菌高密度生产高产DHA的方法。本发明从元素供应和发酵控制角度优化菌株发酵条件，实现高密度发酵，最终得到的细胞干重为70. 43g/L，获得生物油脂50. lg/L，DHA含量为17. 5g/L，占总脂肪酸含量高于35%，且含有β -胡萝卜素，虾青素和角鲨烯Λ,生物活性物质。与专利CN200910033869. 5中31. 5g/L的油脂含量相比，生物油脂和DHA的产量均提高了将近60 %，这将大大提高海洋微生物来源DHA的价格优势，进一步推动海洋微生物发酵生产DHA的工业化进程。
图I是裂殖壶菌SDl 16菌株在显微镜下的形态，a为光学显微镜下观察，b为透射电锐观察，c为扫描电镜观察；图2是裂殖壶菌SDl 16菌株批次补料实验结果。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。具体实施例包括三个部分I、裂殖壶菌SDl 16菌株培养基成分的优化(实施例I，实施例2)；II、裂殖壶菌SD116菌株发酵条件的优化(实施例3，实施例4)；III、裂殖壶菌SD116菌株的发酵试验结果(实施例5)。实施例I :不同碳源和碳源浓度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响在250ml的三角摇瓶中，配置50ml培养基，氮源为酵母提取物20g/L，盐度为15，分别加入不同的碳源(甘油、葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉)，浓度为60g/L，调pH值为6. 0，高压灭菌后，接入5ml预培养的菌种种子液，在空气浴振荡器上25°C振荡培养5天，振荡转速为180rpm。离心收集菌体，冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的氯仿-甲酵法提取油脂并甲脂化，通过GC-MS测定菌体中DHA的百分含量，结果见表I确定碳源种类后，设计不同的碳源浓度，并考察裂殖壶菌SD116菌株的生长情况，分析方法同上，结果见表2。表I不同碳源对裂殖壶菌SDl 16菌株生长和油脂积累的影响
权利要求
1.一种裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No :6208。
2.一种利用权利要求I所述的裂殖壶菌高密度发酵生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，其特征在于以CGMCC No 6208菌株为出发菌株，在液体培养基中高密度发酵，分离得到菌体细胞，将菌体细胞经破碎、萃取、精制获得富含DHA的油脂。
3.根据权利要求2所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述高密度发酵方法包括如下步骤 ①将保存在甘油管的菌株接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在20 30°C的摇床中，以150 200rpm的转速，培养24 48h，获得一级种子； ②将一级种子接入装有IOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，在20 30°C的遥床中，以150 200rpm的转速，培养24 48h，获得二级种子； ③将二级种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2 10% (v/v)，通气量O.2 2vvm，搅拌转速200 800rpm，罐温20 30°C，pH 6 7，发酵生产DHA油脂。
4.根据权利要求3所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述种子培养基中，碳源含量为30 60g/L，氮源含量为10 20g/L，溶剂为海水和蒸馏水(11, w/w)的混合物。
5.根据权利要求4所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述碳源为葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木质纤维素糖化液；所述氮源为有机氮源或无机氮源，所述有机氮源为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸钠或尿素，所述无机氮源为氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、氨水或硝酸钾。
6.根据权利要求3所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述发酵培养基中包含如下组分葡萄糖20 60g/L,酵母提取物5 30g/L,蛋白胨5 20g/L，磷酸二氢钾O. 5 8g/L，硫酸镁O. 5 5g/L，柠檬酸钠O. 5 5g/L，海水晶5 30g/L,维生素B130 200mg/L，维生素B630 200mg/L，维生素B125 50mg/L，生物素2 50mg/Lo
7.根据权利要求2-6任意一项所述的利用裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述步骤③中，采用柠檬酸和氨水调节PH值，所述柠檬酸的浓度为5 20%(w/v )，所述氨水的浓度为5 30% (w/v);所述发酵步骤还包括补糖操作，保证葡萄糖的浓度为20 60g/L ;所述发酵时间为80 110h，发酵结束时葡萄糖浓度不高于10g/L。
8.根据权利要求2所述的利用裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述分离方法为离心、过滤或絮凝；所述破碎方法为挤压破壁或酶解法破壁；所述萃取、精制步骤为利用非极性溶剂回收含DHA的粗油，将所述粗油精炼得到DHA油脂。
9.根据权利要求2所述的利用裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述非极性溶剂为正己烷或正己烷-乙醇的混合溶剂。
10.根据权利要求2所述的利用裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于所述步骤③发酵的方式为分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵。
全文摘要
本发明属于微生物发酵工程领域，公开了一种裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.SD116，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No6208)，及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法。本发明从元素供应和发酵控制角度优化菌株发酵条件，并结合补糖操作，实现高密度发酵，最终细胞干重达到70.43g/L，油脂含量达50.1g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35％，且含有β-胡萝卜素，虾青素和角鲨烯等生物活性物质。整套工艺操作方便，获得较高的生物量和DHA含量，降低了发酵成本，适合工业化发酵生产。
文档编号C12R1/645GK102888348SQ201210251850
公开日2013年1月23日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者崔球, 高莽, 宋晓金, 冯银刚 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所