专利名称：一种生产木糖异构酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生物工程菌生产重组木糖异构酶。
背景技术：
木糖异构酶(Xylose Isomerase EC5. 3. I. 5)是具有变构作用的酶。木糖异构酶的主要作用是催化D-木糖(醛戊糖)与D-木酮糖(酮戊糖)相互转换的酶，也作用于D-萄萄糖得到D-果糖。木糖异构酶主要应用于果葡糖浆工业、生产半纤维素乙醇工业、作为食品添加剂和饲料添加剂等。不同的用途对于木糖异构酶作用的适合温度和PH有着不同的要求。当前市场上的异淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的木糖异构酶，由于天然菌株中的木糖异构酶基因是由单种木糖异构酶基因编码，其适合反应温度范围和适合反应PH范围窄。所以，当前的木糖异构酶产品不能满足和适合于当前市场的需求。 毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌,但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。
发明内容
当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。来源于栖热菌(Thermus)的木糖异构酶最适pH 7,最适合温度90°C,在80至95°C和pH6. 2至7的条件下有80%的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；来源于链霉菌(Streptomyces)的木糖异构酶最适pH 8,最适合温度80°C,在68至86°C和pH6. 8至8. 5的条件下有80%的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的木糖异构酶最适pH 6,最适合温度50°C,在37至60°C和pH4. 8至7. 2的条件下有80%的它在最适温度和最适pH条件的酶活性。从上述可见，若将上述这三种不同来源的木糖异构酶制备成混合酶产品，那么这种混合酶的的适合反应温度和PH范围将明显较其中的单种酶广。本发明应用分子生物学技术构建含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架(说明.表达框架启动子-信号肽-基因-转录终止子)的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。用含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶。本发明所采用的技术方案是I.克隆酶基因应用分子生物学技术，从栖热菌(Thermus)基因组中扩增木糖异构酶基因，从链霉菌(Streptomyces)基因组中扩增木糖异构酶基因，从大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中克隆木糖异构酶基因。
2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。3.构建如附图I的毕赤酵母表达载体、附图2的酿酒酵母表达载体和附图3的枯草芽孢杆菌表达载体。4.应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组；应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母基因组；应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌基因组。用PCR和DNA序列测定方法验证重组子。分别筛选高表达木糖异构酶的毕赤酵母重组子、酿酒酵母重组子和枯草芽孢杆菌重组子作为含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。5.发酵含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶。
本发明构建含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶的优点体现于(I)为市场提供适合反应温度范围广和适合反应pH范围广的木糖异构酶产品。(2)取代分别发酵含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的菌株生产木糖异构酶，发酵含链霉菌的木糖异构酶基因表达框架菌株生产木糖异构酶，发酵含大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的菌株生产木糖异构酶。即不仅提高了产品的性能并且实现用一个发酵工序生产三种木糖异构酶取代用多个工序分别生产三种木糖异构酶，达到节省了原材料、能耗和人力资源的作用。(3)毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含三种不同来源的木糖异构酶基因表达框架的的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，为其重组混合酶的生产提供多种菌株选择。
附图I.含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体P.毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；T-xi.栖热菌的木糖异构酶基因链霉菌的木糖异构酶基因；E-xi.大肠杆菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；P. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。附图2.含三种木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体P.酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；T-xi.栖热菌的木糖异构酶基因链霉菌的木糖异构酶基因；E-xi.大肠杆菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选酿酒酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；S. cerevisiae rDNA.酿酒酵母的rDNA序列。附图3.含三种木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体P.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；T-xi.栖热菌的木糖异构酶基因；S_xi.链霉菌的木糖异构酶基因；E-xi.大肠杆菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进ー步说明。实施例I :I. I构建毕赤酵母表达载体I. I. I构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列、多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPMI. I. 2犹取基因①PCR扩增栖热菌的木糖异构酶基因引物I:5’ GCGAATTCATGTACGAGCCCAAACCGG3 ’ [说明· 5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2小碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]引物2:5，CAGCGGCCGCTTA 各TGATGATGATGATGATGI CCCCCGCACCCCCAGGAGGTACTCCACC3，[说
明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取栖热菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是栖热菌的木糖异构酶基因序列。②PCR扩增链霉菌的木糖异构酶基因引物I:5 ’ GCGAATTCATGAGCTACCAGCCCACCCCCG3 ’ [说明5 ’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]引物2:5，CAGCGGCCGCTTA ^TGATGATGATGATGATGI GCCCCGCGCGCCCAGCAGGTGGTCCATC [说明
5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取链霉菌的基因组DNA[将栖热菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA]，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是链霉菌的木糖异构酶基因序列。③PCR扩增大肠杆菌的木糖异构酶基因
引物 I : 5 ’ GGGAATTCATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGAT3 ’ [说明5 ’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基是酶识别位点)]引物 2 : C A GCGGCCGC TCAJ ATGATGATGATGATGATGGACACCGGTGGTGAAACCGCCTGCTTTG[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取大肠杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是大肠杆菌的木糖异构酶基因序列。
I. I. 3分别构建三种木糖异构酶基因表达框架。①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。引物I:5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG 3’引物2:5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTC 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基)]提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩増，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。[说明毕赤酵母基因组DNA提取方法将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列 引物I:5， CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2:引物2 :5，CCTTCGMagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.含栖热菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将栖热菌的木糖异构酶基因序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游。此含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为pPMl。B.含链霉菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将链霉菌的木糖异构酶基因序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游。此含链霉菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为pPM2。C.含大肠杆菌的木糖异构酶基因的表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将大肠杆菌的木糖异构酶基因序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录終止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游。此含大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的载体称为PPM3。⑦完成表达载体的构建A.将表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切取pPM2和pPM3载体的表达框架，并将以上的这两套表达框架依次插入于PPMl的多克隆位点。此载体称为PPM123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPM123载体的多克隆位点。构成含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图I)。·I. 2构建含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，将经过电转化作用的毕赤酵母涂布于G418_Yro(2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉，终浓度为70(^8/1111的6418)平板，在30°C培养3天后生长出菌落(重组子)。用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别用以上所述的三种木糖异构酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增帯，并且对其PCR产物进行序列测定证明其三种木糖异构酶基因已经重组于重组子的基因组。将生长于G418抗性平板的并经过用基因特异引物进行PCR验证的重组子分别在30°C进行摇瓶发酵2天，将发酵液离心取上清。用Hi s6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明这三种木糖异构酶基因都能在毕赤酵母中表达并分泌到胞外。用常规方法測定发酵液的木糖异构酶活性，根据酶活性測定，筛选高表达木糖异构酶的重组子作为含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。I. 3生产重组混合木糖异构酶分别将含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、只含链霉菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、只含大肠杆菌的L木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母分别接种于YPD培养基中，30°C摇床培养两天。通过离心，分别收集上述发酵液上清，应用常规的木糖活性測定的方法(即酶解木糖生成木酮糖，然后通过测定生成的木酮糖的含量而获得酶活性)分别于PH7和90°C，pH8和80°C，以及pH 6和50°C测定上述发酵液的木糖异构酶活性，并将结果记录于表I.表I结果表明含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的木糖异构酶活性明显高于含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌发酵液中的木糖异构酶活性，也高于含链霉菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的木糖异构酶活性和含大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的木糖异构酶活性，并且，前者的木糖异构酶活性约是后三者的木糖异构酶活性之和。据此，含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌适合应用于生产重组混合木糖异构酶。表I发酵液的木糖异构酶酶活性
权利要求
1.一种生产木糖异构酶方法，其特征在于，其具体步骤如下 1)、应用分子生物学技术克隆栖热菌的木糖异构酶基因、链霉菌的木糖异构酶基因和大肠杆菌的木糖异构酶基因； 2)、构建分别含上述基因的表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体； 3)、将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母获得毕赤酵母重组子，将上述构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母获得酿酒酵母重组子，将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组子； 4)、筛选高表达以上所述的三种木糖异构酶的毕赤酵母重组子作为含栖热菌的木糖异构酶基因、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种木糖异构酶的酿酒酵母重组子作为含栖热菌的木糖异构酶基因、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种木糖异构酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含栖热菌的木糖异构酶基因、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌； 5)、分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产木糖异构酶。
2.根据权利要求I所述一种生产木糖异构酶的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产木糖异构酶的方法制备木糖异构酶产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产木糖异构酶的方法。属生物技术领域。首先克隆栖热菌、链霉菌和大肠杆菌的木糖异构酶基因；构建含以上三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将载体分别转化相对应的宿主菌；分别筛选高表达木糖异构酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶。与传统的由单基因编码的木糖异构酶不同，本发明生产的重组混合木糖异构酶的适合反应的温度和pH范围广，适合于多种用途；并且，含多基因表达框架的工程菌表达的木糖异构酶的产量明显高于含单基因的工程菌表达的木糖异构酶的产量，起到降低生产成本作用。
文档编号C12R1/125GK102747063SQ201210251839
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者尹慧祥, 张爱联, 易国辉 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所