专利名称：一种生产葡萄糖淀粉酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组葡萄糖淀粉酶。
背景技术：
葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase, (EC. 3. 2. I. 3.)]又称糖化酶,它能把淀粉从非还原性未端水解a-I. 4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-I. 6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原木端释放P-D-葡萄糖。应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。当前市场上的葡萄糖淀粉酶产品是来源于天然菌株生产葡萄糖淀粉酶。但是，由于当前的酶产品是来源于单种酶基因编码，适合反应温度范围和适合反应PH范围窄，不能满足不同用途对于酶的多种适合反应温度和适合反应PH范围的需求。由于葡萄糖淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的葡萄糖淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的葡萄糖淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。
发明内容
根据葡萄糖淀粉酶有多种来源，不同来源的葡萄糖淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的葡萄糖淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的葡萄糖淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合葡萄糖淀粉酶将具有理化特性多样性，即具有较广的适合反应温度和pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。来源于曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶最适合pH 4. 6,最适温度70°C,在PH2. 4-7. 5和65至80°C的温度下有彡60%的酶活性；来源于毛壳菌(Chaetomium)的葡萄糖淀粉酶最适PH5. 6，最适温度80°C，在pH4-6. 8和65-88°C有彡60 %的酶活性；来自于酵母(Yeast)的葡萄糖淀粉酶最适合pH 7. 2，最适温度是40°C，在pH 6-8. 6和30_55°C有^ 60%的酶活性。由于这三种酶的功能相同，但理化特性有异，所以，这三种在毕赤酵母或酿酒酵母或枯草芽孢杆菌中表达的混合葡萄糖淀粉酶的使用价值将高于其中的单种基因编码的葡萄糖淀粉酶。即这种混合酶的用途将比其中的单独酶广。若分别用不同的菌株来表达这三种酶,其生产成本将高于用一个菌株同时生产这三种酶的混合酶。本发明构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合葡萄糖淀粉酶。本发明所采用的技术方案是
I.克隆酶基因应用分子生物学技术，分别从曲霉基因组、毛壳菌基因组和酵母基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因。2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因。3.构建如附图I、附图2和附图3的含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体。4.将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。[说明.表达框架启动子-信号肽-基因-转录终止子] 5.分别筛选高表达曲霉的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶和酵母的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉的毕赤酵母重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；筛选高表达含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；筛选高表达含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌6.发酵含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合葡萄糖淀粉酶。本发明构建的含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合葡萄糖淀粉酶的优点体现于本发明通过构建毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，应用工程菌生产三种重组葡萄糖淀粉酶的混合酶产品，一方面提供适合于多种PH和温度环境下使用的混合葡萄糖淀粉酶新产品，另一方面取代发酵分别含这三种酶基因的菌株生产曲霉的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶和酵母的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶。即用一个发酵工序生产三种编码的葡萄糖淀粉酶取代用三个工序分别生产三种编码的葡萄糖淀粉酶。达到节省原材料、能耗和人力资源的作用。
附图I.含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳
菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。p.毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；A-gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；C_gai.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因；Y_gai.酵母的葡萄糖淀粉酶基因；T.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；p. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。附图2.含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体。p.酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；A-gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；C_gai.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因；Y_gai.酵母的葡萄糖淀粉酶基因；T.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选酿酒酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；S. cerevisiae rDNA.酿酒酵母的rDNA序列。附图3.含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体。p.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；A-gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；C_gai.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因；Y_gai.酵母的葡萄糖淀粉酶基因；T.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B. SubtilisrDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例I :I. I含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体I. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPA。1.1.2获取基因①用反转录PCR扩增曲霉的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5’ CTGGATCCatRtcRttccRatctcttct3，[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A KTGATGATGATGATGATG >
ccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列。②用反转录PCR扩增毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5’ cggaattcatgtccgcatcggtcctgttggtctt 3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，a a gcggccgcC T A KTGATGATGATGATGATG
tcaccagtggtcttgaccacagtcctg3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列。③用反转录PCR扩增酵母的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5，cggaattcgcctatccttcttttgaagcttattc3，[说明:5，的 8 个喊基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，a a gcggccgcC T A KtGATGATGATGATGATG,
agccaaagccttgaccttatttctaag3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列。I. I. 3分别构建曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架。①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’ )进行 PCR 扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[说明毕赤酵母基因组DNA提取方法将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]
②由专业的DNA序列合成公司合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAG ATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCRRcttccaRRacRtatcRCRRatcRctRCRttcttcatc3>引物2 :5，CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，说明引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位(有下划线的6个碱基)。提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PPA1。B.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建 通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止子序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PPA2。C.酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含酵母的葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为PPA3⑦完成毕赤酵母表达载体的构建A.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切下pPA2和pPA3载体的表达框架,并将其切下的两个表达框架重组于pPAl的多克隆位点。此载体称为pPA123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPA123载体的多克隆位点，构成曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图I)。I. 2构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌用电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体(见附图I)转化毕赤酵母，将经过电转化的毕赤酵母细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用曲霉的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物和酵母的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种葡萄糖淀粉酶表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明曲霉的葡萄糖淀粉酶基因、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因和酵母的葡萄糖淀粉酶基因都能在含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合a淀粉酶的重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。I. 3生产重组曲霉的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶、毛壳菌的葡萄糖淀 粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶和酵母的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、天然的产葡萄糖淀粉酶的酵母(应用于I. I. 2所述的PCR扩增a淀粉酶基因的酵母菌株)和不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母分别接种于YH)培养基中，30°C摇床发酵两天；将天然的产葡萄糖淀粉酶的曲霉和毛壳菌(应用于I. I. 2所述的PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因的曲霉和毛壳菌菌株)分别接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于37°C、55°C和90°C条件分析其发酵液上清在酸性(PH4)、中性(pH7)和碱性(pH8. 5)环境下的平均葡萄糖淀粉酶活性。结果表明，含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均葡萄糖淀粉酶是37°C和pH4 (2504085单位)、55°C和pH4 (5739045单位)、90°C和 pH4 (905537 单位)、37。。和 pH7 (1624833 单位)、55°C和 pH7 (7814802 单位)、90。。和 pH7 (1241097 单位)、37。。和 pH8. 5(919673 单位)、55°C和 pH8. 5 (2059169 单位)、90°C和pH8. 5(730596);天然的曲霉发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH4.6，70°C )条件下的活性是(80596单位)；天然的毛壳菌发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH5.6，80°C)条件下的活性是(59073单位)；天然的酵母发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH7. 2,40°C )条件下的活性是(68340单位)。而这三种天然的菌株在37°C、55°C和90°C以及pH4、pH7和pH8. 5的条件下的活性均低于它们在各自的最适温度和最适PH条件下的酶活性。不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母的发酵液没有葡萄糖淀粉酶活性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌表达的葡萄糖淀粉酶在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都具有良好葡萄糖淀粉酶的活性，并且其葡萄糖淀粉酶活性显著高于(P < 0. 01)产葡萄糖淀粉酶的天然菌株的表达产物的葡萄糖淀粉酶活性。说明葡萄糖淀粉酶活性测定方法应用常规的葡萄糖氧化酶法。实施例2 2. I含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体2. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pSA。2. I. 2获取基因④用反转录PCR扩增曲霉的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5’ CTGGATCCatgtcgttccgatctcttct3，[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A ^\TGATGATGATGATGATG
ccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软 件分析证明是曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列。⑤用反转录PCR扩增毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5’ cggaattcatgtccgcatcggtcctgttggtctt 3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，a a gcggccgcC T A IATGATGATGATGATGArTG
tcaccagtggtcttgaccacagtcctg3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列。⑥用反转录PCR扩增酵母的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5，cggaattcgcctatccttcttttgaagcttattc3，[说明:5，的 8 个喊基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，a a gcggccgcC T A JATGATGATGATGATGATG
agccaaagccttgaccttatttctaag3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列。2. I. 3分别构建曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架。
①用PCR扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。引物I:5’ CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5’ GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。[说明酿酒酵母基因组DNA提取方法将酿酒酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③山专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC 框架的载体称为 pSA3⑦完成酿酒酵母表达载体的构建A.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切下pSA2和pSA3载体的表达框架，并将其切下的两个表达框架重组于PPAl的多克隆位点。此载体称为PSA123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将酿酒酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pSA123载体的多克隆位点，构成曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体(附图2)。2. 2构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌用电转化方法将以上构建的酿酒酵母表达载体(见附图2)转化酿酒酵母，将经过电转化的酿酒酵母细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用曲霉的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物和酵母的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种葡萄糖淀粉酶表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明曲霉的葡萄糖淀粉酶基因、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因和酵母的葡萄糖淀粉酶基因都能在含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合a淀粉酶的重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基 因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌。2. 3生产重组曲霉的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶和酵母的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、天然的产葡萄糖淀粉酶的酵母(应用于I. I. 2所述的PCR扩增a淀粉酶基因的酵母菌株)和不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母分别接种于YH)培养基(2%蛋白胨，1%酵母浸出物，2%葡萄糖)中，30°C摇床发酵两天；将天然的产葡萄糖淀粉酶的曲霉和毛壳菌(应用于2. I. 2所述的PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因的曲霉和毛壳菌菌株)分别接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于37°C、55°C和90°C条件分析其发酵液上清在酸性(pH4)、中性(pH7)和碱性(pH8.5)环境下的平均葡萄糖淀粉酶活性。结果表明，含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酵母工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均葡萄糖淀粉酶是37。。和 pH4(3183095 单位)、55°C和 pH4(6734640 单位)、90°C和 pH4(934581 单位)、37°C和 pH7 (1994735 单位)、55°C 和 pH7 (8910473 单位)、90°C 和 pH7 (1751893 单位)、37。。和pH8. 5(1310594 单位)、55°C和 pH8. 5 (2609473 单位)、90°C和 pH8. 5 (1013525);天然的曲霉发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH4.6，70°C )条件下的活性是(80596单位)；天然的毛壳菌发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH5.6,80°C)条件下的活性是(59073单位)；天然的酵母发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH7. 2,40V )条件下的活性是(68340单位)。而这三种天然的菌株在 37°C、55°C和 90°C 以及 pH4、pH7 和 pH8. 5TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCT
GGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从酿酒酵母基因组中PCR扩增rDNA序列引物I:5’ CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3，引物2:5’ CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酿酒酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PSA1。B.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止子序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PSA2。
C.酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pSA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PSA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含酵母的葡萄糖淀粉酶基因的表达的条件下的活性均低于它们在各自的最适温度和最适PH条件下的酶活性。不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌的发酵液没有葡萄糖淀粉酶活性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌表达的葡萄糖淀粉酶在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都具有良好葡萄糖淀粉酶的活性，并且其葡萄糖淀粉酶活性显著高于(P <0.01)产葡萄糖淀粉酶的天然菌株的表达产物的葡萄糖淀粉酶活性。
说明葡萄糖淀粉酶活性测定方法应用常规的葡萄糖氧化酶法。 实施例3:3. I含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体3. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pBA。3. I. 2获取基因用反转录PCR扩增曲霉的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5’ CTGGATCCatRtcRttccRatctcttct3，[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A |ATGATGATGATGATGATG
ccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列。⑦用反转录PCR扩增毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因引物]:5’cggaattcatgtccgcatcggtcctgttggtctt3 [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5 ， a a rcrrccrcC T A AT GAT GAT GAT GAT GAT G
tcaccagtggtcttgaccacagtcctg3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列。⑧用反转录PCR扩增酵母的葡萄糖淀粉酶基因引物I :5，cggaattcgcctatccttcttttgaagcttattc3’ [说明5’ 的 8 个喊基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划 线的6个碱基)]引物2:5，a a gcggccgcC T A jATGATGATGATGATGATG
agccaaagccttgaccttatttctaag3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列。3. I. 3分别构建曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的表达载体①用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子序列引物I :5’ CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3’引物2:5’ GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA[巨大枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法将枯草芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]，以巨大芽孢杆菌的基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCC②由专业的DNA序列合成公司合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGG
GATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAG
CATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③山专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC
TGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列引物I.5，CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3 引物2.5’ CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3 [说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]。提取枯草芽孢杆菌基因组DNA(基因组DNA提取方法同以上所述的巨大枯草芽孢杆菌的基因组DNA提取方法)，以基因组DNA为模板应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的曲霉的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PBA1。B.毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨 大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止子序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的载体称为PBA2。C.酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBA载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pBA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录PCR扩增获得的酵母的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PBA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含酵母的葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为PBA3⑦完成枯草芽孢杆菌表达载体的构建A.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切下pBA2和pBA3载体的表达框架,并将其切下的两个表达框架重组于pBAl的多克隆位点。此载体称为pBA123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将枯草芽孢杆菌的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pBA123载体的多克隆位点，构成曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图3)。3. 2构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌用电转化方法将以上构建的枯草芽孢杆菌表达载体(见附图3)转化枯草芽孢杆菌，将经过电转化的枯草芽孢杆菌细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用曲霉的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物和酵母的葡萄糖淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种葡萄糖淀粉酶表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeastextract (酵母提取物)，2 %葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用Hi s标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明曲霉的葡萄糖淀粉酶基因、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因和酵母的葡萄糖淀粉酶基因都能在含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合a淀粉酶的重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。3. 3生产重组曲霉的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶和酵母的葡萄糖淀粉酶基因编码的葡萄糖淀粉酶将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、天然的产葡萄糖淀粉酶的酵母(应用于3. I. 2所述的PCR扩增a淀粉酶基因的酵母菌株)和不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌分别接种于LB培养基中，30°C摇床发酵两天；将天然的产葡萄糖淀粉酶的曲霉和毛壳菌(应用于I. I. 2所述的PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因的曲霉和毛壳菌菌株)分别接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于37°C、55°C和90°C条件分析其发酵液上清在酸性(pH4)、中性(pH7)和碱性(pH8. 5)环境下的平均葡萄糖淀粉酶活性。结果表明，含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均葡萄糖淀粉酶是37°C和pH4(1824883单位)、55。。和 pH4 (4537462 单位)、90°C和 pH4 (695437 单位)、37。。和 pH7 (1014671 单位)、55。。和 pH7 (6945733 单位)、90 °C 和 pH7 (709445 单位)、37 °C 和 pH8. 5 (520642 单位)、55 °C 和pH8.5(1359169单位)、90°C和pH8.5(492537);天然的曲霉发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH4.6，70°C )条件下的活性是(80596单位)；天然的毛壳菌发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH5.6，80°C )条件下的活 性是(59073单位)；天然的酵母发酵液上清(每升)在其葡萄糖淀粉酶的最适的温度和pH(pH7. 2,40°C)条件下的活性是(68340单位)。而这三种天然的菌株在37°C、55°C和90°C以及pH4、pH7和pH8. 5的条件下的活性均低于它们在各自的最适温度和最适pH条件下的酶活性。不含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌的发酵液没有葡萄糖淀粉酶活性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌表达的葡萄糖淀粉酶在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都具有良好葡萄糖淀粉酶的活性，并且其葡萄糖淀粉酶活性显著高于(P <0.01)产葡萄糖淀粉酶的天然菌株的表达产物的葡萄糖淀粉酶活性。说明葡萄糖淀粉酶活性测定方法应用常规的葡萄糖氧化酶法。
权利要求
1.一种生产葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，其具体步骤如下 1)、应用分子生物学技术分别克隆曲霉的葡萄糖淀粉酶基因、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因和酵母的葡萄糖淀粉酶基因； 2)、分别构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体； 3)、将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子，将上述构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母从而获得酿酒酵母重组子，将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌从而获得枯草芽孢杆菌重组子； 4)、筛选高表达以上所述的三种葡萄糖淀粉酶的毕赤酵母重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种葡萄糖淀粉酶的酿酒酵母重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种葡萄糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌； 5)、分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组葡萄糖淀粉酶。
2.根据权利要求I所述一种生产葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产葡萄糖淀粉酶的方法制备成重组葡萄糖淀粉酶产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产葡萄糖淀粉酶的方法。属生物技术领域。首先克隆曲霉、毛壳菌和酵母的葡萄糖淀粉酶基因；构建含以上三种葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将其载体分别转化相对应的宿主菌；分别筛选高表达以上所述的三种葡萄糖淀粉酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合葡萄糖淀粉酶。与传统的由单基因编码的葡萄糖淀粉酶不同，本发明生产的重组混合葡萄糖淀粉酶的适合反应的温度和pH范围广，适合于多种用途；由于实现三个酶基因同时在工程菌中表达，使葡萄糖淀粉酶的产量得到显著提高，起到降低生产成本作用。
文档编号C12N15/81GK102747094SQ201210251820
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者刘振旺, 张添元, 张爱联, 沈锦城, 符仙, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所