专利名称：一种胚胎干细胞培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎干细胞培养基及其应用。
背景技术：
胚胎干细胞的培养一直在生物学医药学和农业生物技术中占有极其显著的位置，近来由于转基因技术和组织再生医学的迫切需求，使得这一领域的研究呈现出蓬勃强劲的态势。已经建立并完善了小鼠和人类的胚胎干细胞系，并已投入实际研究和治疗应用。但转基因生物反应器所迫切需求的畜禽类胚胎干细胞系却至今尚未见报道。转基因动物技术和转基因动物制药是近年来研究最热门、发展最快的领域之一。将目的外源基因导入到动物体内并与动物基因组整合在一起，随着细胞的分裂和增殖，夕卜源基因在动物体内表达蛋白并在动物世代间稳定遗传。转基因动物打破了自然繁殖中的种 间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，实现了动物种间遗传物质的交换与重组，这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段，丰富了物种的基因库，而且扩大了生命科学的视野。1980年，Gordon等首次育成转基因小鼠，目前除转基因小鼠外，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛、转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成，在生物学基础研究、医学、农业及生物工程等领域，均具有极高的科研和经济价值。制作转基因动物的方法主要有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、体细胞移植技术、腺病毒载体法和精子头与转移基因共注射法等。胚胎干细胞最早从早期的小鼠胚胎内细胞团分离出来，在正确的培养体系中的能够在体外长期传代并且保持高速增殖和维持类似癌细胞的无限繁殖和向外、中、内3个胚层高度分化的潜能，在体内能参与包括生殖系在内的各个组织器官的发育形成嵌合体。通过随机插入或者同源重组将外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中，获得稳定表达的转基因细胞，通过抗性标记筛选富集被转染的细胞并建立胚胎干细胞系。再以显微注射法把这种转基因胚胎干细胞植入正常发育的受体囊胚中并将受体囊胚到受体动物的子宫内得到的转基因动物个体。胚胎干细胞介导法是一条极具魅力的转基因动物技术路线。与其它几种方法相比，基于系稳定成熟的胚胎干细胞系的胚胎干细胞介导法具有以下优点(1)外源重组基因在受体染色体上的准确整合；(2)可在胚胎植入前筛选出合适的稳定传代细胞系；(3)可对细胞进行遗传修饰，外源基因调控表达，基因自身失活等操作；(4)可以通过基因打靶基因剔除建立基因缺失的畜禽品种和动物模型。但由于缺乏成熟的胚胎干细胞系，使这一技术仅仅局限于小鼠上的应用，严重限制这一先进技术在诸多领域里优势潜能的发挥。诱导多能干细胞(iPS细胞)是近年来干细胞研究领域一项突破性的进展，其划时代的意义不仅在于为再生医学及相关的治疗研究提供了一种丰富的多能性干细胞材料来源，更重要的是将对干细胞多能性维持及体细胞重编程去分化机制的研究从诱导培养的细胞水平直接引入到了基因调控的分子水平。禽类由于其独特地生理特性，在医药动物模型、生命科学基础研究和药物生产上占有极其显著的地位。家禽一直是人类最主要的肉类和蛋类蛋白质来源，另外家禽的输卵管相比哺乳动物的乳腺更具有成为生物反应器的价值，家禽易于饲养管理和大规模繁殖，卵类蛋白成份简单且易于纯化，卵类蛋白糖基化更接近于人类。获得一个稳定，增长迅速，具有多分化潜能的禽类胚胎干细胞系，一直是科研人员所迫切希望和努力追求的，也是禽类转基因领域和其它基础研究和应用技术发展厄需解决的瓶颈。现有的禽类胚胎干细胞培养体系是基于对小鼠的胚胎干细胞培养体系的模仿，大都存在增长缓慢、稳定性差的缺点，而且实验结果多不能重复。而禽类特殊的繁殖生理体系使得禽类的胚胎干细胞从获得到培养都和模式生物小鼠相差很远，使得在小鼠上很成熟的胚胎干细胞培养体系很难应用到禽类胚胎干细胞培养体系的开发上。不止家禽，其它物种的胚胎干细胞的研究也都难以获得小鼠胚胎干细胞的效果，可见现有的小鼠的成熟胚胎干细胞培养体系，很难应用的其他动物的胚胎干细胞培养之中。这一方面是由于物种之间的差距，另一方面可能是由于作为胚胎干细胞来源的内细胞团细胞和胚盘细胞在细胞特性和多能性及自我更新的调控网络上不适合外源细胞因子的干预。
发明内容
本发明的目的是提供一种胚胎干细胞培养基及其应用。 本发明还提供的胚胎干细胞培养基，包括如下组分含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、细胞因子LIF、细胞因子SCF和细胞因子bFGF。所述蛋白甲为序列表的序列5所不的S0X2蛋白。所述蛋白乙为序列表的序列7所不的POUV蛋白。所述蛋白丙为序列表的序列9所不的Nanog蛋白。所述蛋白丁为序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。所述蛋白甲包括如下兀件序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白乙包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白丙包括如下兀件序列表的序列9所不的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述蛋白丁包括如下元件序列表的序列11所示的CLIN28蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述胚胎干细胞培养基还可包括如下组分丙酮酸钠和鸡血清。所述胚胎干细胞培养基具体可由DMEM培养基(如高糖DMEM培养基)和溶质组成；所述溶质及其在所述胚胎干细胞传代培养基中的浓度如下丙酮酸钠4-6mM(如5mM)、细胞因子 LIF 1-2Χ1(Γ2μ g/ml (如 L 5X 1(Γ2 μ g/ml)、细胞因子 SCF O. 5-1. 5ng/ml (如 lng/ml)、细胞因子 bFGF O. 5-1. 5ng/ml (如 lng/ml)、所述蛋白甲 30_35mg/L (如 33. 75mg/L)、所述蛋白乙25_30mg/L(如27. 75mg/L)、所述蛋白丙35_40mg/L(如37. 5mg/L)、所述蛋白丁30-40mg/L (如 36mg/L 或 31. 5mg/L)和离体鸡血清 80_120mL/L (如 100mL/L)。所述蛋白甲具体可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具体可为蛋白浓度为O. 45mg/ml的蛋白液,每升胚胎干细胞培养基中具体加入了 75mL。所述蛋白乙具体可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具体可为蛋白浓度为O. 37mg/ml的蛋白液，每升胚胎干细胞培养基中具体加入了 75mL。所述蛋白丙具体可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具体可为蛋白浓度为O. 5mg/ml的蛋白液,每升胚胎干细胞培养基中具体加入了 75mL。所述蛋白丁具体可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具体可为蛋白浓度为O. 48mg/ml或O. 42mg/ml的蛋白液，每升胚胎干细胞培养基中具体加入了 75mL。所述蛋白甲的蛋白液的制备方法具体如下(I)将S0X2蛋白表达质粒导入293FT细胞，得到重组细胞；(2)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞进行超声波破碎(超声参数具体可为450Hz，每次超声7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为S0X2蛋白的蛋白液。所述蛋白甲的蛋白液的制备方法具体还可如下(I)将S0X2蛋白表达质粒用Bgl II酶切，得到线性化质粒；(2)将所述线性化质粒通过导入CHO细胞,得到重组细胞。 (3)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心(离心参数具体可为3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为S0X2蛋白的蛋白液。所述蛋白乙的蛋白液的制备方法具体如下(I)将POUV蛋白表达质粒导入293FT细胞，得到重组细胞；(2)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞进行超声波破碎(超声参数具体可为450Hz，每次超声7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为POUV蛋白的蛋白液。所述蛋白乙的蛋白液的制备方法具体还可如下(I)将POUV蛋白表达质粒用Bgl II酶切，得到线性化质粒；(2)将所述线性化质粒通过导入CHO细胞,得到重组细胞。(3)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心(离心参数具体可为3000rpm，3min)收集上清，然后采用分子量小于IOKD的蛋白液，即为POUV蛋白的蛋白液。所述蛋白丙的蛋白液的制备方法具体如下(I)将Nanog蛋白表达质粒导入293FT细胞，得到重组细胞；(2)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞进行超声波破碎(超声参数具体可为450Hz，每次超声7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为Nanog蛋白的蛋白液。所述蛋白丙的蛋白液的制备方法具体还可如下(I)将Nanog蛋白表达质粒用Bgl II酶切,得到线性化质粒；(2)将所述线性化质粒通过导入CHO细胞,得到重组细胞。(3)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心(离心参数具体可为3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为Nanog蛋白的蛋白液。所述蛋白丁的蛋白液的制备方法具体如下(I)将CLIN28蛋白表达质粒导入293FT细胞，得到重组细胞；(2)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞进行超声波破碎(超声参数具体可为450Hz，每次超声7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为cLIN28蛋白的蛋白液。所述蛋白丁的蛋白液的制备方法具体还可如下(I)将CLIN28蛋白表达质粒用Bgl II酶切，得到线性化质粒；(2)将所述线性化质粒通过导入CHO细胞,得到重组细胞。
(3)将所述重组细胞37°C培养12小时，离心(离心参数具体可为3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即为CLIN28蛋白的蛋白液。以上任一所述S0X2蛋白表达质粒的制备方法具体如下在重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位点(如EcoR I和BamH I酶切位点之间)插入去除终止密码子后的S0X2蛋白编码基因(S0X2蛋白具体如序列表的序列5所不,其编码基因具体如序列表的序列6所不)，得到S0X2蛋白表达质粒。以上任一所述POUV蛋白表达质粒的制备方法具体如下在重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位点(如EcoR I和Kpn I酶切位点之间)插入去除终止密码子后的POUV蛋白编码基因(P0UV蛋白具体如序列表的序列7所不，其编码基因具体如序列表的序列8所不)，得到POUV蛋白表达质粒。
以上任一所述Nanog蛋白表达质粒的制备方法具体如下在重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位点(如EcoR I和BamH I酶切位点之间)插入去除终止密码子后的Nanog蛋白编码基因(Nanog蛋白具体如序列表的序列9所不，其编码基因具体如序列表的序列10所示),得到Nanog蛋白表达质粒。以上任一所述CLIN28蛋白表达质粒的制备方法具体如下在重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位点(如Kpn I和BamH I酶切位点之间)插入去除终止密码子后的cLIN28蛋白编码基因(cLIN28蛋白具体如序列表的序列11所不，其编码基因具体如序列表的序列12所不)，得到cLIN28蛋白表达质粒。以上任一所述重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的制备如下以pIRES2_EGFP载体为骨架载体，在其多克隆位点甲(如Nhe I和Bgl II酶切位点之间)插入鸡生长激素信号肽的编码基因(鸡生长激素信号肽具体如序列表的序列I所示，其编码基因具体如序列表的序列2所示)，多克隆位点乙(如Sma I和BamH I酶切位点之间)插入精氨酸短肽的编码基因(精氨酸短肽具体如序列表的序列3所示，其编码基因具体如序列表的序列4所示)，得到重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP ;所述多克隆位点甲位于所述多克隆位点乙的上游。以上任一所述胚胎干细胞培养基可用于培养胚胎干细胞。所述胚胎干细胞具体可为鸡胚胎干细胞(如寿光鸡胚胎干细胞)。所述胚胎干细胞具体可为胚盘细胞。本发明还保护一种培养胚胎干细胞的方法，是采用以上任一所述的胚胎干细胞培养基培养所述胚胎干细胞。所述胚胎干细胞具体可为鸡胚胎干细胞(如寿光鸡胚胎干细胞)。所述胚胎干细胞具体可为胚盘细胞。本发明还提供了含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、细胞因子LIF、细胞因子SCF和细胞因子bFGF在制备胚胎干细胞培养基中的应用。所述蛋白甲为序列表的序列5所不的S0X2蛋白。所述蛋白乙为序列表的序列7所不的POUV蛋白。所述蛋白丙为序列表的序列9所不的Nanog蛋白。所述蛋白丁为序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。所述蛋白甲包括如下兀件序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白乙包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白丙包括如下兀件序列表的序列9所不的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述蛋白丁包括如下元件序列表的序列11所示的CLIN28蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述胚胎干细胞具体可为鸡胚胎干细胞(如寿光鸡胚胎干细胞)。所述胚胎干细胞具体可为胚盘细胞。采用本发明提供的胚胎干细胞培养基进行胚胎干细胞的培养，具有如有优点可以使胚胎干细胞长期、大量扩增，并保持良好的全能性(全能性相关基因有效表达，可以形成胚样体)以及自我更新能力(胚胎干细胞可长期传代)；操作简便，成本低廉。本发明可用于体外诱导分化、转基因细胞系制备、干细胞核移植、转基因干细胞核移植或嵌合体制备、还可以用于组织工程和细胞治疗等多种胚胎干细胞功能的应用，对于生物医学具有重大应用前景。
图I为插入外源基因后的重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的结构示意图。
图2为实施例3中实验组的PO代、P6代和P7代细胞的表面标志检测。图3为实施例3中胚胎干细胞全能性相关基因表达。图4为实施例3中第6代细胞通过三胚层聚集生长与分化后所形成的拟胚体。图5为实施例3中嵌合体的照片。图6为实施例3中嵌合体各个组织中的促乳素受体基因鉴定结果。图7为实施例5中实验组的PO代、P6代和P7代细胞的表面标志检测。图8为实施例5中胚胎干细胞全能性相关基因表达。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。高糖DMEM培养基Gibco，货号为12491-015。丙酮酸钠美季生物有限公司，货号为 A4859。细胞因子 LIF :CANTA CRUZ，货号为 SC-4989。细胞因子 SCF:Cell Signaling，货号为 #8925。细胞因子 bFGF Cell Sinaling，货号为 #8910。pIRES2_EGFP载体=Ivitrogen,货号为 CB5159815。293FT 细胞Ivitrogen，货号为 R700-07。CHO 细胞Ivitrogen，货号为2205-20-47。寿光鸡种蛋中国农业大学动物科技学院教学实验场。白来航蛋鸡种蛋中国农业大学动物科技学院教学实验场。实施例I、重组质粒的制备一、重组质粒 pGSPF9R-IRES-EGFP 的制备以pIRES2-EGFP载体为骨架载体，在其Nhe I和Bgl II酶切位点之间插入鸡生长激素信号肽的编码基因(鸡生长激素信号肽如序列表的序列I所示，其编码基因如序列表的序列2所示)，Sma I和BamH I酶切位点之间插入精氨酸短肽的编码基因(精氨酸短肽如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示；缩写为9XArg)，得到重组质粒PGSPF9R-IRES-EGFP。重组质粒pGSPF9R_IRES_EGFP中，鸡生长激素信号肽的编码基因和精氨酸短肽的编码基因之间为多克隆位点，可以供外源基因插入，在细胞中表达两个蛋白，其中一个蛋白为包括鸡生长激素信号肽、外源蛋白和精氨酸短肽在内的融合蛋白，另一个蛋白为EGFP蛋白。出细胞时，鸡生长激素信号肽被切除，形成包括外源蛋白和精氨酸短肽在内的融合蛋白。插入外源基因后的重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的结构示意图见图I。二、鸡源S0X2蛋白表达质粒的制备在重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入去除终止密码子后的鸡源S0X2蛋白编码基因(鸡源S0X2蛋白如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示),得到鸡源S0X2蛋白表达质粒。表达包括如下元件的融合蛋白鸡源S0X2蛋白和精氨酸短肽。三、鸡源POUV蛋白表达质粒的制备在重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和Kpn I酶切位点之间插入去除终止密码子后的鸡源POUV蛋白编码基因(鸡源POUV蛋白如序列表的序列7所示，其编码基因如序列表的序列8所示),得到鸡源POUV蛋白表达质粒。表达包括如下元件的融合蛋白鸡源POUV蛋白和精氨酸短肽。四、鸡源Nanog蛋白表达质粒的制备在重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入去除终止 密码子后的鸡源Nanog蛋白编码基因(鸡源Nanog蛋白如序列表的序列9所不，其编码基因如序列表的序列10所示),得到鸡源Nanog蛋白表达质粒。表达包括如下元件的融合蛋白鸡源Nanog蛋白和精氨酸短肽。五、鸡源CLIN28蛋白表达质粒的制备在重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP的Kpn I和BamH I酶切位点之间插入去除终止密码子后的鸡源CLIN28蛋白编码基因(鸡源CLIN28蛋白如序列表的序列11所示，其编码基因如序列表的序列12所示),得到鸡源cLIN28蛋白表达质粒。表达包括如下元件的融合蛋白鸡源CLIN28蛋白和精氨酸短肽。实施例2、胚胎干细胞传代培养基的制备一、分别将实施例I的步骤二至步骤五制备的蛋白表达质粒进行如下实验I、将蛋白表达质粒通过磷酸钙转染法(描述磷酸钙转染法的参考文献NANCYHSIUNG, RAYMOND S. ROGINSKI, PAULA HENTHORN, OLIVER SMITHIES, RAJU KUCHERLAPATI, ANDARTHUR I. SKOULTCHI，Introduction and expression of a fetal human globin gene inmouse fibroblasts，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 1982，p. 401-411)导入 293FT细胞中，72小时后通过观察荧光强度筛选出表达EGFP的细胞。2、将步骤I筛选得到的细胞37°C培养12小时，离心收集细胞；3、将步骤2收集的细胞进行超声波破碎(450Hz，每次超声7s停9s，44次)，然后采用蛋白浓缩柱(Millipore UFC901024 Amicon Ultra-15 15ml/10KD,按说明书操作)过滤浓缩，收集分子量小于IOKD的蛋白液，-80度冷冻保存。分别得到鸡源S0X2蛋白液(蛋白浓度为O. 45mg/ml)、鸡源POUV蛋白液(蛋白浓度为O. 37mg/ml)、鸡源Nanog蛋白液(蛋白浓度为O. 5mg/ml)、鸡源cLIN28蛋白液(蛋白浓度为 O. 48mg/ml)。将重组质粒pGSPF9R-IRES-EGFP代替表达质粒进行步骤I至3，得到对照蛋白液甲。将293FT细胞进行步骤3，得到对照蛋白液乙。二、鸡胚胎干细胞传代培养基的制备鸡胚胎干细胞传代培养基由溶质和高糖DMEM培养基组成；所述溶质在所述鸡胚胎干细胞传代培养基中的浓度如下丙酮酸钠5mM、细胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、细胞因子SCF lng/ml、细胞因子bFGF lng/ml、步骤一制备的鸡源S0X2蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源POUV蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源Nanog蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源CLIN28蛋白液75mL/L和鸡血清100mL/L。三、对照传代培养基甲的制备对照传代培养基甲由溶质和高糖DMEM培养基组成；所述溶质在所述对照传代培 养基甲中的浓度如下丙酮酸钠5mM、细胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、细胞因子SCF Ing/ml、细胞因子bFGF lng/ml、步骤一制备的对照蛋白液甲300mL/L和鸡血清100mL/L。四、对照传代培养基乙的制备对照传代培养基乙由溶质和高糖DMEM培养基组成；所述溶质在所述对照传代培养基乙中的浓度如下丙酮酸钠5mM、细胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、细胞因子SCF Ing/ml、细胞因子bFGF lng/ml、步骤一制备的对照蛋白液乙300mL/L和鸡血清100mL/L。五、对照传代培养基丙的制备对照传代培养基丙由溶质和高糖DMEM培养基组成；所述溶质在所述对照传代培养基丙中的浓度如下丙酮酸钠5mM、细胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、细胞因子SCF Ing/ml、步骤一制备的鸡源S0X2蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源POUV蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源Nanog蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源cLIN28蛋白液75mL/L和鸡血清100mL/L。六、对照传代培养基丁的制备对照传代培养基丁由溶质和高糖DMEM培养基组成；所述溶质在所述对照传代培养基丁中的浓度如下丙酮酸钠5mM、细胞因子SCF lng/ml、细胞因子bFGF lng/ml、步骤一制备的鸡源S0X2蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源POUV蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源Nanog蛋白液75mL/L、步骤一制备的鸡源cLIN28蛋白液75mL/L和鸡血清100mL/L。实施例3、鸡胚胎干细胞的培养一、胚盘细胞的获取选择新鲜孵化的种蛋(寿光鸡)，取胚盘细胞。二、胚盘细胞的培养I、实验组用实施例2的步骤二制备的鸡胚胎干细胞传代培养基培养胚盘细胞(PO代)，观察细胞形态，细胞出现密集山峰状细胞团块时，进行消化并半量更换新的鸡胚胎干细胞传代培养基进行传代，得到Pl代。采用上述方法持续进行传代，依次为P2代、P3代、P4代、P5代、P6代、P7代。2、对照组甲用实施例2的步骤三制备的对照传代培养基甲代替鸡胚胎干细胞传代培养基进行步骤I的实验。
3、对照组乙用实施例2的步骤四制备的对照传代培养基乙代替鸡胚胎干细胞传代培养基进行步骤I的实验。4、对照组丙用实施例2的步骤五制备的对照传代培养基丙代替鸡胚胎干细胞传代培养基进行步骤I的实验。5、对照组丁用实施例2的步骤六制备的对照传代培养基丁代替鸡胚胎干细胞传代培养基进行步骤I的实验。三、细胞分化的鉴定1、P0代细胞的形态鉴定对照组甲和对照组乙中，PO代细胞在培养过程中形态如下细胞间结合紧密，难于用消化酶进行消化，细胞呈现了严重的聚集状态。实验组中，PO代细胞形态依然保持着山峰状。2、传代时间传代时间是指培养的胚盘细胞出现山峰状(细胞密度在I. 5-20D)后可进行传代的所需时间。各组细胞的传代时间(小时)见表I。表I各组细胞的传代时间(小时)代表完全分化、没有后续传代)
权利要求
1.ー种胚胎干细胞培养基，包括如下组分含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白こ、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、细胞因子LIF、细胞因子SCF和细胞因子bFGF。
2.如权利要求I所述的胚胎干细胞培养基，其特征在于所述蛋白甲为序列表的序列5所不的S0X2蛋白；所述蛋白こ为序列表的序列7所不的POUV蛋白；所述蛋白丙为序列表的序列9所不的Nanog蛋白；所述蛋白丁为序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。
3.如权利要求I所述的胚胎干细胞培养基，其特征在于所述蛋白甲包括如下元件 序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精気酸短妝；所述蛋白こ包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精気酸短妝；所述蛋白丙包括如下元件序列表的序列9所示的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽；所述蛋白丁包括如下兀件序列表的序列11所不的cLIN28蛋白和序列表的序列3所不的精氨酸短肽。
4.如权利要求I至3中任一所述的胚胎干细胞培养基，其特征在于所述胚胎干细胞培养基还包括如下组分丙酮酸钠和离体鸡血清。
5.如权利要求4所述的胚胎干细胞培养基，其特征在于所述胚胎干细胞培养基由DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述胚胎干细胞培养基中的浓度如下丙酮酸钠 4-6mM、细胞因子 LIF 1-2X 1(Γ2 μ g/ml、细胞因子 SCF O. 5-1. 5ng/ml、细胞因子 bFGFO.5-1. 5ng/ml、所述蛋白甲30_35mg/L、所述蛋白乙25_30mg/L、所述蛋白丙35_40mg/L、所述蛋白丁 30_40mg/L和离体鸡血清80_120mL/L。
6.权利要求I至5中任一所述的胚胎干细胞培养基在培养胚胎干细胞中的应用。
7.一种培养胚胎干细胞的方法，是采用权利要求I至5中任一所述的胚胎干细胞培养基，培养所述胚胎干细胞。
8.如权利要求6所述的应用或如权利要求7所述的方法，其特征在于所述胚胎干细胞为胚盘细胞。
9.含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白こ、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、细胞因子LIF、细胞因子SCF和细胞因子bFGF在制备胚胎干细胞培养基中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述胚胎干细胞为胚盘细胞。
全文摘要
本发明公开了一种胚胎干细胞培养基及其应用。本发明提供的胚胎干细胞培养基，包括如下组分含有SOX2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有cLIN28蛋白的蛋白丁、细胞因子LIF、细胞因子SCF和细胞因子bFGF。所述SOX2蛋白具体如序列5所示。所述POUV蛋白具体如序列7所示。所述Nanog蛋白具体如序列9所示。所述cLIN28蛋白具体如序列11所示。采用本发明提供的胚胎干细胞培养基进行胚胎干细胞的培养，可以使胚胎干细胞长期、大量扩增，并保持良好的全能性。
文档编号C12N5/0735GK102732476SQ20121025144
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者于淼瑛, 李宁, 连正兴, 韩红兵 申请人:中国农业大学