专利名称：可靶向激活rank信号通路的融合蛋白及其重组质粒与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种融合蛋白的构建，特别涉及一种可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白及其重组质粒与应用。
背景技术：
核因子-K B 受体活化因子(receptor activator of nuclear factor- k B, RANK)信号通路具有多重生理功能。该信号通路对于牙齿形成、淋巴结形成、破骨细胞形成是必不可少的；RANK、CD40信号通路的协同作用能指导胸腺髓质微细构造的形成从而控制机体的中枢免疫耐受；RANK信号通路调节发热中枢；RANK信号通路能促进树突状细胞的存活和活性；RANK信号通路对于乳腺上皮细胞的形成是必不可少的；RANK信号通路对于血管内皮细胞的产生以及血管的形成起着重要作用；RANK信号通路还与多种癌症的发生和发展有着密切的关联等等。这些研究结果预示RANK信号通路是上述疾病治疗中极其重要的信号通路，因此，RANK是治疗这些疾病的重要靶标分子。该信号通路的异常常常引起多种疾病，提示RANK信号通路是这些疾病治疗中的一个极其重要的信号通路。一般而言，利用RANK信号通路对上述疾病进行治疗时首选利用RANK的相应配体(RANK ligand, RANKL)激活RANK信号通路。然而，利用RANK配体激活RANK信号通路常常会引起许多的副作用，如严重的骨质疏松症、致死性高血钙症、全身性炎性反应等。因此，需要对RANK进行改造，使其既保留RANK的功能，又要克服其引起副作用的缺陷。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白。本发明的另一目的在于提供含有编码上述融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。本发明的再一目的在于提供上述重组载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示MYPYDVPDYAMSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYI⑶TDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGP SLIVLLLFISVVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESS⑶RCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQGDLSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIE⑶SCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGPGSAEPESEPVGRPVQEETLAHRDSFAGTAPRFPDVCATGAGLQEQGAPRQKDGTSRPVQEQGGAQTSLHTQGSGQCAE ；编码所述的可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白的核苷酸序列如下所示ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCCCGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGCCCCAGTCTCATCGTTCTGCTCCTCTTCATCTCTGTGGTAGTAGTGGCTGCCATCATCTTCGGCGTTTACTAC
AGGAAGGGAGGGAAAGCGCTGACAGCTAATTTGTGGAATTGGGTCAATGATGCTTGCAGTAGTCTAAGTGGAAATAAGGAGTCCTCAGGGGACCGTTGTGCTGGTTCCCACTCGGCAACCTCCAGTCAGCAAGAAGTGTGTGAAGGTATCTTACTAATGACTCGGGAGGAGAAGATGGTTCCAGAAGACGGTGCTGGAGTCTGTGGGCCTGTGTGTGCGGCAGGTGGGCCCTGGGCAGAAGTCAGAGATTCTAGGACGTTCACACTGGTCAGCGAGGTTGAGACGCAAGGAGACCTCTCGAGGAAGATTCCCACAGAGGATGAGTACACGGACCGGCCCTCGCAGCCTTCGACTGGTTCACTGCTCCTAATCCAGCAGGGAAGCAAATCTATACCCCCATTCCAGGAGCCCCTGGAAGTGGGGGAGAACGACAGTTTAAGCCAGTGTTTCACCGGGACTGAAAGCACGGTGGATTCTGAGGGCTGTGACTTCACTGAGCCTCCGAGCAGAACTGACTCTATGCCCGTGTCCCCTGAAAAGCACCTGACAAAAGAAATAGAAGGTGACAGTTGCCTCCCCTGGGTGGTCAGCTCCAACTCAACAGATGGCTACACAGGCAGTGGGAACACTCCTGGGGAGGACCATGAACCCTTTCCAGGGTCCCTGAAATGTGGACCATTGCCCCAGTGTGCCTACAGCATGGGCTTTCCCAGTGAAGCAGCAGCCAGCATGGCAGAGGCGGGAGTACGGCCCCAGGACAGGGCTGATGAGAGGGGAGCCTCAGGGTCCGGGAGCTCCCCCAGTGACCAGCCACCTGCCTCTGGGAACGTGACTGGAAACAGTAACTCCACGTTCATCTCTAGCGGGCAGGTGATGAACTTCAAGGGTGACATCATCGTGGTGTATGTCAGCCAGACCTCGCAGGAGGGCCCGGGTTCCGCAGAGCCCGAGTCGGAGCCCGTGGGCCGCCCTGTGCAGGAGGAGACGCTGGCACACAGAGACTCCTTTGCGGGCACCGCGCCGCGCTTCCCCGACGTCTGTGCCACCGGGGCTGGGCTGCAGGAGCAGGGGGCACCCCGGCAGAAGGACGGGACATCGCGGCCGGTGCAGGAGCAGGGTGGGGCGCAGACTTCACTCCATACCCAGGGGTCCGGACAATGTGCAGAATGA ；ー种重组载体，含有上述核苷酸序列的基因；所述的重组载体优选为将上述核苷酸序列的基因克隆至慢病毒载体得到；所述的慢病毒载体优选为CSII-EF-RfA-IRES2_Venus ；所述的重组载体优选为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK重组质粒，其通过如下方法制备得到(I)以结核杆菌DNA为模板，以FP和RP为引物，PCR反应获得HA-GyraseB基因；FP:CGGGATCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCRP CGGAATTCTTAGGTACCGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ；(2)通过EcoR I酶和BamH I酶分别双酶切pENTR_2B载体和步骤(I)得到的HA-Gyrase B基因，酶切后纯化，得到双酶切的pENTR_2B载体和双酶切的HA-Gyrase B基因；再将双酶切的PENTR-2B载体和双酶切的HA-Gyrase B基因连接，得到重组载体pENTR-2B-HA-Gyrase B ;用 Kpn I 酶单酶切重组载体 pENTR-2B-HA_Gyrase B，去磷酸化，得到单酶切后的 pENTR-2B-HA-Gyrase B ；(3)以小鼠胸腺cDNA为模板，FP2和RP2为引物，PCR反应扩增得到RANK跨膜区域和包内区域基因；用Kpn I酶单酶切RANK跨膜区域和包内区域基因，得到单酶切后的RANK跨膜区域和包内区域基因；FP2 CGGGTACCCCCAGTCTCATCGTTCTGCTC ；RP2 CCGGGTACCTCATTCTGCACATTGTCCGGAC ；(4)将步骤(2)得到的单酶切后的pENTR-2B-HA_Gyrase B和步骤(3)得到的单酶切后的RANK跨膜区域和包内区域基因连接，得到重组载体pENTR-2B-HG-RANK ；(5)通过Gateway技术将位于重组载体pENTR_2B_HG-RANK上的HG-RANK双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-Rf A-IRES2_Venus上，得至IjCSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK 重组质粒；步骤(I)和(2)中所述的PCR反应的条件优选为94 V 2min ；94 V 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 个循环；72で IOmin ；步骤(5)所述的Gateway技术的反应体系优选为
pENTR-2B-HG-RANKIOOng
CSiI-EF-R 以-1RES2-Venus150ng
LR clonase II enzvme mixI |il
TE (IOmM Tris-HCL ImMEDTA pHfi1[为 8) 补个反应条件优选为25°C下反应6小时，加IiU蛋白酶K (浓度为2 y g/yl )，37°C反应10分钟；所述的重组载体在RANK功能研究中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明提供的融合蛋白在细胞内表达后，能接受小分子药物香豆霉素的持续刺激，靶向激活RANK依存的信号通路，从而可避免利用受体的配体激活RANK信号通路进行疾病治疗时引起的副作用。(2)本发明构建了一个重组小鼠RANK质粒，含有上述融合蛋白，载体骨架为慢病毒质粒，利用慢病毒转染，既适合于体内研究也适合于体外研究，既可用于分裂细胞也可用于非分裂细胞，既能用于短暂研究也能用于长期观察；转染效率能通过细胞的緑色荧光确定。因此，重组小鼠RANK基因慢病毒质粒对于RANK的功能研究以及RANK引起的疾病治疗研究都具有极其重要的价值。重组小鼠RANK慢病毒质粒有着非常大的商业价值。
图I是蛋白质印迹技术检测HG-RANK融合蛋白在NIH3T3细胞中的表达结果图。图2是0. 05 ii M浓度的香豆霉素不同时间内靶向刺激的RANK特异性依存的IKBa的磷酸化表达结果图；微管蛋白a-tubulin作为内參。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进ー步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(I)重组载体 pENTR_2B-Gyrase B-HA 的制备①通过PCR反应获得Gyrase B基因，引物(均为5’ _3’，华大基因公司合成)如下所示FP:CGGGATCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCRP CGGAATTCTTAGGTACCGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC 按照以下体系配合PCR反应液
结核杆菌 DNA (购自 Invitrogen)200ng IOx高保真PCR缓冲液 IOmMdNTP 混合液 50mM硫酸镁2叫
IOpMFP2^1
IOpMRP2[il
Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(购自 Invitrogen) 0.2^1 灭菌蒸馏水至50叫。按照下列程序进行PCR反应起始变性94 V 2min ；变性94 V 15sec、复性550C 15sec、延伸 68で 30sec，30 个循环；72で IOmin0②在步骤①得到的PCR产物中加入2. 5倍体积冰冻的无水こ醇(同时加入0. I倍、PH5. 6的3M醋酸钠)沉淀，离心沉淀，该沉淀物按以下反应体系配合PCR沉淀物
IOxK酶切缓冲液2叫
EcoRl (购自 TAKARA)Ipl
BamH I C 购丨'_| TAKARA)l|il
灭菌蒸馏水至20pl;以上反应体系37°C处理2小时，电泳，回收HA-Gyrase B基因片段。按照以下体系配合酶切反应体系
pENTR-2B 载体(购自 Invitrogen)Ijig
IOxK酶切缓冲液2jil
EcoR I (购自 TAKARA)I ^il
BamH I (购自 TAKARA)I ^il
灭菌蒸馏水至20_
以上反应体系37°C处理2小时，电泳，回收目的片段。将酶切后的PENTR-2B载体与酶切后的HA-Gyrase B基因片段进行连接，得到重组载体 pENTR-2B-HA-Gyrase B (以下简称 pENTR_2B_HG)。连接体系如下双链DNA 片段 lOOng、pENTR-2B 载体 20ng、DNA Ligation KitVer. 2. 0 (购自TAKARA公司)5 yl，双蒸水补至IOu I016°C连接12小时，接着用Iiil连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a (购自TAKARA公司)，培养于依据分子克隆配方配制的LB固体培养基，其中含有50 y g/ml的卡那霉素进行选择。生长出来的克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养于依据分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，抽提，得到重组载体，通过测序，确定得到含有HA序列(通过引物FP引入)和Gyrase B基因序列(如下所示)的重组质粒pENTR_2B_HG。Gyrase B 基因序列(660bp):ATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCCCGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGC。(2)重组载体pENTR-2B-HG-RANK跨膜区域和包内区域的制备①通过PCR反应获得RANK跨膜区域和包内区域基因，引物(均为5’_3’，华大基因公司合成)如下所示FP2 CGGGTACCCCCAGTCTCATCGTTCTGCTC ；RP2 CCGGGTACCTCATTCTGCACATTGTCCGGAC 按照以下体系配合PCR反应液
cDNA模板(按照常规方法由3_来自C57BL/6J小鼠(购自广东省医学实验动物中心)胸腺的RNA合成)2|ilIOx高保真PCR缓冲液50
IOmM dNTP 混合液I^il
50mM硫酸镁2pi
IOuM FP22|.lI
1(VM RP22)iil
Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(购自 Invitrogen)0.2jil 灭菌蒸馏水至50|ilo 按照下列程序进行PCR反应起始变性94 V 2min ；变性94 V 15sec、复性55°C 15sec、延伸 68で 30sec，35 个循环；72で IOmin0②在步骤①得到的PCR产物中加入2. 5倍体积冰冻的无水こ醇(同时加入0. I倍、PH5. 6的3M醋酸钠)沉淀，离心沉淀，该沉淀物按以下反应体系配合PCR沉淀物IOXL酶切缓冲液2 U IKpnI (购自 TAKARA)I U I灭菌蒸馏水至20 ii I ;以上反应体系37°C处理2小吋，电泳，回收目的基因RANK跨膜区域和包内区域基因片段。 按照以下体系配合酶切反应体系
pENTR-2B-HG 质粒Uu
IOxL酶切缓冲液2^1
ゆ《1 (购自 TAKARA)I^il
灭菌蒸馏水至20pl。以上反应体系37°C处理2小时，加入碱性磷酸酶CIAP (购自TAKARA )，37 °C处理30min,电泳，回收载体片段。 将酶切后的pENTR-2B-HG载体与酶切后的RANK跨膜区域和包内区域基因片段进行连接，得到重组载体PENTR-2B-HG-RANK跨膜区域和包内区域(以下简称PENTR-2B-HG-RANK)。连接体系如下双链DNA 片段 lOOng、pENTR_2B_HG 载体 20ng、DNALigation KitVer. 2. 0 (购自TAKARA公司)5 yl，双蒸水补至10 U I ；16°C连接12小时，接着用Iiil连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a (购自TAKARA公司)，培养于依据分子克隆配方配制的LB固体培养基，其中含有50 y g/ml的卡那霉素进行选择。生长出来的克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养于依据分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，抽提，得到重组载体，通过测序，确定得到含有HA序列和Gyrase B序列、RANK跨膜区域和包内区域序列(如下所示)的重组质粒PENTR-2B-HG-RANK。RANK跨膜区域和包内区域位于Gyrase B序列的3’端。小鼠RANK跨膜区域和包内区域的碱基序列(1242bp)，如下所示CCCAGTCTCATCGTTCTGCTCCTCTTCATCTCTGTGGTAGTAGTGGCTGCCATCATCTTCGGCGTTTACTACAGGAAGGGAGGGAAAGCGCTGACAGCTAATTTGTGGAATTGGGTCAATGATGCTTGCAGTAGTCTAAGTGGAAATAAGGAGTCCTCAGGGGACCGTTGTGCTGGTTCCCACTCGGCAACCTCCAGTCAGCAAGAAGTGTGTGAAGGTATCTTACTAATGACTCGGGAGGAGAAGATGGTTCCAGAAGACGGTGCTGGAGTCTGTGGGCCTGTGTGTGCGGCAGGTGGGCCCTGGGCAGAAGTCAGAGATTCTAGGACGTTCACACTGGTCAGCGAGGTTGAGACGCAAGGAGACCTCTCGAGGAAGATTCCCACAGAGGATGAGTACACGGACCGGCCCTCGCAGCCTTCGACTGGTTCACTGCTCCTAATCCAGCAGGGAAGCAAATCTATACCCCCATTCCAGGAGCCCCTGGAAGTGGGGGAGAACGACAGTTTAAGCCAGTGTTTCACCGGGACTGAAAGCACGGTGGATTCTGAGGGCTGTGACTTCACTGAGCCTCCGAGCAGAACTGACTCTATGCCCGTGTCCCCTGAAAAGCACCTGACAAAAGAAATAGAAGGTGACAGTTGCCTCCCCTGGGTGGTCAGCTCCAACTCAACAGATGGCTACACAGGCAGTGGGAACACTCCTGGGGAGGACCATGAACCCTTTCCAGGGTCCCTGAAATGTGGACCATTGCCCCAGTGT
GCCTACAGCATGGGCTTTCCCAGTGAAGCAGCAGCCAGCATGGCAGAGGCGGGAGTACGGCCCCAGGACAGGGCTGA
TGAGAGGGGAGCCTCAGGGTCCGGGAGCTCCCCCAGTGACCAGCCACCTGCCTCTGGGAACGTGACTGGAAACAGTA
ACTCCACGTTCATCTCTAGCGGGCAGGTGATGAACTTCAAGGGTGACATCATCGTGGTGTATGTCAGCCAGACCTCG
CAGGAGGGCCCGGGTTCCGCAGAGCCCGAGTCGGAGCCCGTGGGCCGCCCTGTGCAGGAGGAGACGCTGGCACACAG
AGACTCCTTTGCGGGCACCGCGCCGCGCTTCCCCGACGTCTGTGCCACCGGGGCTGGGCTGCAGGAGCAGGGGGCAC
CCCGGCAGAAGGACGGGACATCGCGGCCGGTGCAGGAGCAGGGTGGGGCGCAGACTTCACTCCATACCCAGGGGTCC
GGACAATGTGCAGAATGAo(3 )通过Gateway技术将位于重组载体pENTR_2B_HG-RANK上的HG-RANK双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus (日本理化学研究，www. brc.riken. jp/lab/cfm/)上，得到重组质粒 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus_HG-RANK (以下简称为LV-HG-RANK)o同样的方法将位于重组质粒pENTR-2B-HG上的HG双链DNA片段转移至慢病毒载体 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus 上，得到 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus_HG 重组质粒(以下简称为 LV-HG)。具体操作过程如下
pENTR-2B-HG-RANK (或片 pENTR-2B-HG )I OOng
CSH-EF-RfA-IRES2-Venus150ng
LR clonase Ii enzvme mix (购 I I Invitroeen 公"I )Ijil
TE ( IOmM Tris-HCU I mMEDTA, pH ffi为 8) 补个:9|_11。25°C下反应6小时，加Iiil蛋白酶K (浓度为g/iil)，37°C反应10分钟以清除多余的LR clonase II enzyme。接着取I U I上述反应液转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞(购自TAKARA公司)，于30°C在含有100 u g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中培养22 24小吋，生长出来的克隆即为阳性克隆。挑取阳性克隆，培养于含有100 u g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C下培养20小吋，纯化质粒。通过BamHI和NotI酶切质粒检测，获得了正确的重组质粒，经测序，HG-RANK的序列如SEQ ID NO. 2所示，将此重组质粒定义为LV-HG-RANK (或者LV-HG)慢病毒质粒。用Qiagen公司的质粒大量提取试剂盒提取该重组质粒。 (4) LV-HG-RANK重组质粒的表达检测。A、用钙-磷质粒导入法，将LV-HG-RANK、pCMV-VSV-G-RSV-Rev (购自日本理化学研究所，http://www. brc. riken. jp/lab/cfm)以及pCAG-HIVgp (购自日本理化学研究所)按照质量比5:2:2的比例导入到人胚肾293T细胞(购自ATCC)中，为实验组；以LV-HG、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照质量比5:2:2的比例导入到人胚肾293T细胞，为对照组；搜集细胞培养的上清液即得到含有LV-HG-RANK (或者LV-HG)慢病毒质粒的病毒。B、用含有LV-HG-RANK质粒的病毒感染小鼠NIH3T3细胞(购自ATCC)。感染步骤如下将5X104fNIH3T3细胞与I X 106iu病毒液混悬于DMEM培养基中，按200 yl混合液/孔的用量配制，每200 ill混合液还包含体积百分比10%的胎牛血清(FBS)、100iu/ml的青霉素和链霉素，混匀后放于48well的平板培养皿中，37°C下培养I. 5hr，加入500 yl培养液(DMEM+10%FBS+100iu/ml青霉素+ 100iu/ml链霉素)，继续培养24hr，传代培养，用含有LV-HG质粒的病毒感染NIH3T3细胞作为对照。培养10天后(长期观察)，荧光显微镜下利用血细胞计数器检测质粒的导入率(质粒导入后，细胞表达Venus)，均为90%以上。收集这些细胞，通过标准的蛋白质印迹技术(步骤见Developmental stage-dependentcollaboration between the RANK and lymphotoxm pathways lor B—cell iollicleorganization in secondary lymphoid organs. J Immunol. 2007,179(10):6799-6807),利用HA抗体(购自SantaCruz公司)和RANK抗体(购自SantaCruz公司)检测NIH3T3细胞中HG-RANK的表达情況，结果如图I所示。该结果说明LV-HG-RANK重组质粒成功导入小鼠NIH3T3细胞并表达HG-RANK融合蛋白。B、使用最终浓度为0. 05 ii M的香豆霉素(coumermycin Al,购自Sigma公司)刺激导入LV-HG-RANK质粒的NIH3T3细胞5min、15min、30min,利用p-I k B a抗体(购自CellSignaling公司)检测可知这一浓度的coumermycin Al可刺激导入LV-HG-RANK质粒 的NIH3T3细胞中IicBa的磷酸化，与RANK配基(RANKL)刺激的树突状细胞的阳性对照相同；而用最终浓度为0. 05 ii M的coumermycin Al刺激导入LV-HG质粒的NIH3T3细胞5min、15min、30min却不能诱导I K B a的磷酸化(如图2所示)。内參为微管蛋白a-tubulin(购自SantaCruz公司)。这些结果表明coumermycin Al可祀向激活RANK依存的信号通路。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置換方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.根据权利要求I所述的可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白，其特征在于编码所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种重组载体，其特征在于含有编码如权利要求I所述的可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白的基因，核昔酸序列如SEQ ID NO. 2所不。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为将SEQIDNO. 2所示的基因克隆至慢病毒载体得到。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述的慢病毒载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK重组质粒，其通过如下方法制备得到 (1)以结核杆菌DNA为模板，以FP和RP为引物，PCR反应获得HA-GyraseB基因；FP:CGGGATCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCRP CGGAATTCTTAGGTACCGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ； (2)通过EcoRI酶和BamH I酶分别双酶切pENTR_2B载体和步骤(I)得到的HA-GyraseB基因，酶切后纯化，得到双酶切的pENTR-2B载体和双酶切的HA-Gyrase B基因；再将双酶切的PENTR-2B载体和双酶切的HA-Gyrase B基因连接，得到重组载体pENTR-2B-HA_GyraseB;用Kpn I酶单酶切重组载体pENTR-2B-HA-GyraSe B，去磷酸化，得到单酶切后的pENTR-2B-HA-Gyrase B ； (3)以小鼠胸腺cDNA为模板，FP2和RP2为引物，PCR反应扩增得到RANK跨膜区域和包内区域基因；用恥11 I酶单酶切RANK跨膜区域和包内区域基因，得到单酶切后的RANK跨膜区域和包内区域基因；FP2 CGGGTACCCCCAGTCTCATCGTTCTGCTC ；RP2 CCGGGTACCTCATTCTGCACATTGTCCGGAC ； (4)将步骤(2)得到的单酶切后的pENTR-2B-HA-GyraSeB和步骤(3)得到的单酶切后的RANK跨膜区域和包内区域基因连接，得到重组载体pENTR-2B-HG-RANK ； (5)通过Gateway技术将位于重组载体pENTR-2B_HG-RANK上的HG-RANK双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK 重组质粒。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于 步骤(I)和(2)中所述的PCR反应的条件为94°C 2min ；94°C 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 个循环；72°C IOmin0
8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于 步骤(5)所述的Gateway技术的反应体系为pENTR-2B-HG-RANKIOOng CSII-EF-RfA-IRES2-Venus150ng LR clonase II enzyme mixI μ I TE补节9μΙ; 其中，TE 的组成为 IOmM Tris-HCl、ImMEDTA，pH 值为 8 ； 反应条件为25°c下反应6小时，加Iy I浓度为I的蛋白酶K，37°C反应10分钟。
9.权利要求3 8任一项所述的重组载体在RANK功能研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可靶向激活RANK信号通路的融合蛋白及其重组载体与应用。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为利用一段gyrase B序列代替小鼠RANK的C末端得到；编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该融合蛋白导入细胞后，能接受小分子药物香豆霉素的持续刺激，靶向激活RANK依存的信号通路，从而可避免利用受体的配体激活RANK信号通路进行疾病治疗时引起的副作用。一种重组载体，含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。该重组载体对于RANK的功能研究以及RANK引起的疾病治疗研究都具有极其重要的价值。
文档编号C12N15/62GK102851262SQ20121025140
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者秦俊文, 谢琪璇, 蔡冬青, 万颖, 黄卉卉, 秋山泰身, 井上纯一郎, 禹艳红, 齐绪峰, 武征 申请人:暨南大学