专利名称：一种pcr步移技术及其所使用的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR步移技术及其所使用的试剂盒，特别涉及一种已知DNA片段侧翼未知序列的PCR步移技术及其所使用的试剂盒，可以广泛应用于遗传及分子生物学领域。
背景技术：
到目前为止，绝大多数物种的基因组序列仍然未知，简便易行的基因步移技术在现代分子生物学研究中发挥着不可替代的作用。基因步移技术主要有以下7个方面的应用 (I)分离已知基因的侧翼序列；(2)鉴定基因插入位点；(3)根据基因的已知片段分离、检测目的基因；(4)用于人工染色体片段的构建搭接；(5)构建图位克隆中的重叠群片段；(6)转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等；(7)用于全基因组测序的间隔填补，以获得完整的全基因组序列。基于PCR方法的染色体步移技术按原理可分为两类一是依赖于酶切连接介导的PCR法，如反向PCR、载体PCR、接头PCR等，二是不需要酶切连接的PCR法，如热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、半随机引物PCR等。尽管这些方法都有成功应用的实例，但也具有各自的缺点，大部分操作步骤复杂，程序耗时。依赖于酶切连接介导的PCR法需要进行酶切、连接等反应，试剂要求多，操作步骤多，实验耗时，非特异性难以避免。如反向PCR需先对基因组进行酶切，然后进行连接，需要酶切连接各种试剂，操作步骤多。反向PCR中环化反应难以控制、线状串联体成为副产物甚至是主要产物，导致非特异性扩增。连接PCR和载体PCR等，必须产生一个包括部分已知序列的酶切产物。如果已知序列没有限制酶的酶切位点或是高度重复的，应用就很困难。不需要酶切连接的PCR法，PCR程序设计复杂，且都有低温退火循环步骤，需要多轮PCR，才能获得目标序列，序列特异性难以保证。如=TAIL-PCR设置程序复杂，需要对程序条件进行反复设置，有假阳性。专利《一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用》中介绍的半随机弓I物PCR法，操作相对简单、获得序列长度长。但介绍的方法中用到的半随机弓I物多达11条，工作量大；PCR扩增中途加入试剂，必须通过二轮PCR才能得到目的片段，且PCR程序中有低温退火步骤，PCR污染较难控制，序列扩增特异性难以保证。总之，目前所用的基因步移的方法，均存在操作繁琐、序列扩增特异性差等缺陷。因此，迫切需要探索新的简便、快速、高效的PCR步移技术。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷与不足，提供一种简便、快速、高效的PCR步移技术。本发明的目的是通过下列技术方案来实现的。本发明采用的技术方案之一是一用于 PCR步移技术的半随机引物，其从5’端至3’端的序列组成依次为12 30个固定碱基,3 8个全简并的碱基(η), 3 7个固定碱基，η为a、g、c和t中的任一种。较佳地，所述半随机引物的序列如SEQ ID NO. 3，或者如SEQ ID NO. 5，或者如SEQID NO. 7 所示。本发明采用的技术方案之二是一种用于PCR步移技术的试剂盒，其包括如上所述的半随机引物。较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。本发明采用的技术方案之三是一种以如上所述的试剂盒进行PCR步移的方法，其包括如下步骤第一轮PCR，以与待测DNA已知序列相互补的上游引物I和所述的半随机弓I物对待测DNA模板进行PCR扩增。较佳地，所述上游引物I的长度为15 30bp。本发明中，所述的模板若为真核生物基因组DNA，则在第一轮PCR之后较佳地还包括第二轮PCR :以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和所述的半随机引物为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增，所述上游引物2位于上游引物I的5’ 一 3’方向的内侧。本发明中，所述第一轮PCR的PCR反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分0.2 3ymol/L上游引物I、O. 2 3ymol/L 半随机引物、O. 2mmol/L dNTPU XPCRbufferU. 5mM 的 Mg2+、。· 02U/ μ L TaqDNA聚合酶和I IOOng/ μ L模板。本发明中，所述第一轮PCR的PCR扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的 PCR 扩增程序为① 92-95°C，3-6min ;@94°C，30s 50-64。。，30s ；④72°C，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。本发明中，所述第二轮PCR的PCR反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分0.2 3ymol/L上游引物2、O. 2 3ymol/L 半随机引物、O. 2mmol/L dNTPU XPCRbufferU. 5mM 的 Mg2+、。· 02U/ μ L TaqDNA聚合酶和I 50ng/ μ L模板。本发明中，所述第二轮PCR的PCR扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的 PCR 扩增程序为① 92-95°C，3-6min ;@94°C，30s 50-64。。，30s ；④72°C，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。本发明中，较佳地，在PCR完成后还需要对第一轮PCR或第二轮PCR的产物进行电泳，选择清晰条带割胶纯化后，进行测序。本发明中，所述电泳较佳地为对PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳；所述测序用的引物对于原核生物而言较佳地为所述上游引物I或所述半随机引物，对于真核生物而言较佳地为所述上游引物2或所述半随机引物。
与现有技术相比，本发明所述PCR步移技术具有如下有益效果本发明所述PCR步移技术同普通二条弓I物的PCR没有太大区别，最多只需二轮PCR即可获得目标序列，操作简单、快速、高效。本发明通过提高整个PCR循环过程中的退火温度，增加了扩增特异性，且对实验样本没有限制，微生物、动物和植物样品均可使用。本方法用于实验中可以简化操作，缩短实验时间，提高实验效率，降低实验成本，具有十分广阔的应用前景。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I为实施例I第一轮PCR的产物电泳结果图。其中，编号“I”为牛基因第一轮PCR步移结果，“2”为牛基因第二轮PCR步移结果，“M”为DL2, 000 DNA Marker (TakaraBiotechnology(Dalian)Co. , Ltd.)。
图2为实施例I目标序列测序所得的部分序列结果。图3为实施例2PCR产物的电泳结果图。其中，编号“I”为ST-III基因的PCR步移结果，“M” 为 DL2, 000 DNA Marker (Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.)。图4为实施例2目标序列测序所得的部分序列结果。图5为实施例3PCR产物的电泳结果图。其中，编号“I”为ST-III基因的PCR步移结果，“M” 为 DL15, 000 DNA Marker (Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.。图6为实施例3目标序列测序所得的部分序列结果。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例I牛乳铁蛋白基因PCR步移根据奶牛牛乳铁蛋白基因的5’侧翼区设计上游引物I (Pl-I)和上游引物2(P1-2)，其序列分别如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示，本实施例所用半随机引物APl的序列如SEQ ID NO. 3所示。利用 DNA isolation reagent for meat and meat products (Takaraiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.)试剂盒抽提市售牛肉基因组DNA,用P1-1和APl做第一轮PCR扩增。第一轮PCR 扩增的程序为① 92°C，6min ;@94°C，30s ;@50°C，30s ;@72°C，30s，其中，步骤②至④为30个循环。第一轮PCR体系包括如下终浓度的各组分0. 2ymol/L上游引物1、0· 2ymol/L半随机引物、0. 2mmol/L dNTP、lXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶和lng/ μ L待测DNA模板。将第一轮PCR扩增产物稀释100倍，取I μ L，用Ρ1-2和APl做第二轮PCR扩增。第二轮 PCR扩增的程序为① 92°C，6min ；(2)94oC,30s ；(3)50oC,30s 72°C，30s，其中，步骤②至④的循环数为30。第二轮PCR扩增的体系包括如下终浓度的各组分0. 2 μ mo I/L上游引物2、O. 2ymol/L 半随机引物、O. 2mmol/L dNTP、lXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L TaqDNA聚合酶和50ng/ μ L第一轮PCR扩增产物。PCR产物电泳结果表明，所用PCR步移扩增体系和程序下能够扩增出清晰的目标条带。 实施例2牛乳铁蛋白基因PCR步移测序根据奶牛牛乳铁蛋白基因的5’侧翼区设计上游引物I (Pl-I)和上游引物2(Ρ1-2)，其序列分别如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示，本实施例所用半随机引物APl的序列如SEQ ID NO. 3所示。利用 DNA isolation reagent for meat and meat products (Takaraiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.)试剂盒抽提市售牛肉基因组DNA,用P1-1和APl做第一轮PCR扩增。第一轮PCR 扩增的程序为① 95°C，3min ;@94°C，30s ;@64°C，30s ;@72°C，180s，其中，步骤②至④为45个循环。第一轮PCR体系包括如下终浓度的各组分3ymol/L上游引物l、3ymol/L半随机引物、0. 2mmol/L dNTP、lXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶和IOOng/ μ L 模板。将第一轮PCR扩增产物稀释200倍，取I μ L，用Ρ1-2和APl做第二轮PCR扩增。第二轮 PCR 扩增的程序为① 95°C，3min ；(2)94oC,30s ；(3)64oC,30s 72°C，180s，其中，步骤②至④的循环数为45。第二轮PCR扩增的体系包括如下终浓度的各组分3ymol/L上游引物2、3μπιο1/L 半随机引物、0. 2mmol/L dNTP、lXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶和lng/ μ L第一轮PCR扩增产物。PCR产物电泳结果见图1，图中编号“I”为牛基因第一轮PCR步移结果，“2”为牛基因第二轮 PCR 步移结果，“Μ” 为 DL2, 000 DNA Marker (Takara Biotechnology (Dalian)Co.，Ltd.)。将泳道“2”中的较亮较清晰的条带割胶纯化测序，所测部分序列结果如图2所
/Jn ο实施例3细菌16s RNA的PCR步移测序根据原核细菌16s RNA序列，设计保守上游引物P2，其序列如SEQ ID NO. 4所示，本实施例所用半随机引物为AP2，其序列如SEQ ID NO. 5所示。用 TaKaRa minibest bacterial genomic dna extraction kit ver. 2. OCTakaraBiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.)细菌基因组抽提试剂盒，抽提植物乳杆菌ST- III(Lactobacillus pi ant arum ST-111)(光明乳业股份有限公司提供)菌株基因组DNA,做PCR。PCR程序为①94°C，5min ;@94°C，30s ;@52°C，30s 72°C，120s，其中，步骤②至④为40个循环。PCR体系包括如下终浓度的各组分0· 5 μ mo I/L上游引物、O. 5 μ mo I/L半随机引物、0.2mmol/L dNTPUXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L Taq DNA聚合酶和 40ng/μ L模板。PCR产物电泳结果见图3，图中编号“I”为ST-III基因PCR步移结果，“Μ”为DL2，000DNA Marker (Takara Biotechnology (Dalian) Co.，Ltd.)。将泳道 I 中的较亮较清晰的条带割胶纯化测序，所测序列部分结果如图4所示。实施例4细菌23s RNA的PCR步移测序根据原核细菌23sRNA序列设计保守上游引物P3，其序列如SEQ ID NO. 6所示，本实施例所用半随机引物为AP3，其序列如SEQ ID NO. 7所示。用 TaKaRa minibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. OCTakaraBiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.)细菌基因组抽提试剂盒，抽提植物乳杆菌ST- III(Lactobacillus pi ant arum ST-III，光明乳业股份有限公司)基因组DNA,做PCR。PCR程序为①94°C，5min ;@94°C，30s ;@52°C，30s 72°C，120s，其中，步骤②至④为40个循环。PCR体系包括如下终浓度的各组分0· 5 μ mo I/L上游引物、O. 5 μ mo I/L半随机引物、0.2mmol/L dNTPUXPCR buffer、I. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/μ L Taq DNA聚合酶和 80ng/μ L 模板。PCR产物电泳结果见图5，图中编号“I”为ST-III基因PCR步移结果，“Μ”为DL15, 000 DNA Marker (Takara Biotechnology (Dalian) Co.，Ltd.。将泳道 I 中的较亮较清晰、箭头所示的条带割胶纯化后测序。所测序列部分结果如图6实施例4细菌23s RNA的PCR步移测序所不。
权利要求
1.ー用于PCR步移技术的半随机引物，其特征在于，其从5’端至3’端的序列组成依次为12 30个固定碱基,3 8个全简并的碱基(η), 3 7个固定碱基,η为a、g、c和t中的任ー种。
2.如权利要求I所述的半随机引物，其特征在于，其序列如SEQID NO. 3，或者如SEQID NO. 5，或者如 SEQ ID NO. 7 所示。
3.一种用于PCR步移技术的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求I所述的半随机引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括dNTP、PCRbuffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任ー种或多种。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。
6.ー种以如权利要求3 5任ー项所述试剂盒进行PCR步移的方法，其特征在于，其包括如下步骤第一轮PCR，以与待测DNA已知序列相互补的上游引物I和如权利要求I所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增；所述上游引物I的长度为15 30bp。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干，所述的待测DNA为真核生物基因组DNA，在第一轮PCR之后还包括第二轮PCR :以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和如权利要求I所述的半随机引物为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增；所述上游引物2位于上游引物I的5’ 一 3’方向的内側。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分0. 2 3μπι01/1上游引物1,0. 2 3μπι01/1半随机引物、O. 2mmol/LdNTP U XPCR buffer、l. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/y L Taq DNA 聚合酶和 I IOOng/μ L 模板；所述第一轮 PCR 的 PCR 扩增程序为为① 92-95°C，3-6min ;@94°C，30s 50_64°C，30s ；④72°C，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45 ;所述第二轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分0. 2 3μπι01/1上游引物2,0. 2 3μπι01/1半随机引物、O. 2mmol/LdNTP U XPCR buffer、l. 5mM 的 Mg2+、0. 02U/y L Taq DNA 聚合酶和 I 50ng/μ L 模板；所述第二轮PCR 的 PCR扩增程序为① 92-95°C，3-6min ;@94°C，30s 50_64°C，30s ;@72で，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。
9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在PCR完成之后，还需要对第一轮PCR或第二轮PCR的产物进行电泳，选择清晰条带割胶纯化后，进行测序。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的待测DNA模板为原核生物基因组DNA，所述测序用的引物为所述上游引物I或所述半随机引物；或者，所述的待测DNA模板为真核生物基因组DNA，所述测序用的引物为所述上游引物2或所述半随机引物。
全文摘要
本发明公开了一种用于PCR步移技术的半随机引物、试剂盒及运用所述试剂盒进行PCR步移的方法。所述半随机引物的序列如序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。所述试剂盒包括所述半随机引物。所述方法同普通二条引物的PCR相类似，最多只需二轮PCR即可获得目标序列，操作简单、快速、高效。该方法通过提高了整个PCR循环过程中的退火温度，增加了扩增特异性，且对实验材料没有限制，微生物、动物和植物样品均可使用。本方法用于实验中可以简化操作，缩短实验时间，提高实验效率，降低实验成本，具有十分广阔的应用前景。
文档编号C12N15/10GK102732517SQ20121025163
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者任婧, 张红发, 顾瑾麟 申请人:光明乳业股份有限公司