一类还原性响应两亲性小分子前药及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及化学药物领域，具体涉及一类还原性响应两亲性小分子前药的制备与用途，其制备包括以下步骤：制备还原性响应的喜树碱(CPT)前驱体；制备还原性响应两亲性小分子前药。该前药的自组装递送系统，有效提高药物上载量和双药协同效应，解决现有小分子前药技术载体比例较高，药物上载量偏低，难以保证药物的选择性可控释放等问题。
【专利说明】
一类还原性响应两亲性小分子前药及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化学药物领域，具体涉及一类还原性响应两亲性小分子前药生物刺激 响应型的两亲性小分子前药的制备与用途。
【背景技术】
[0002] 喜树碱(Camptothecin，简称CPT，，化学结构式:C20H16N204，CAS号：7689-03-4，相 对分子量:348.43)是从我国中南、西南的广泛分布的喜树中提纯出的一类疏水性的抗癌药 物。喜树碱对肝癌和头颈部癌等具有强的抗癌活性，其可能的作用机制是活性喜树碱能稳 定拓扑异构酶I和DNA的共价化合物，形成一类三元可解离的复合物，通过造成DNA的损失， 进而导致细胞死亡。
[0003] 由于喜树碱药物分子尺寸较小且水中溶解度极低，因此在药物递送过程中面临非 特异选择性、药物利用率较低、肾清除率较高以及毒副作用较强等问题亟待解决，因此提高 其水溶性和保护其生物活性具有重要的科学意义。
[0004] 基于纳米技术的药物递送系统（纳米药物)可有效结合小分子药物和纳米技术的 双重优势，将药物递送到肿瘤位点，显著提高药物的治疗效率和降低毒副作用。一些研究报 道中，通过在CPT分子中利用酯键或酰胺键的连接引入亲水性的聚乙二醇，酯键的断裂往往 需要生物体内广泛分布的酯酶参与，而酰胺键在生物体内一般非常稳定，因此基于酯键或 酰胺键的小分子前药无法很好地实现药物在肿瘤位点选择性的释放，难以有效降低药物递 送过程中引起的毒副作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于，提供一种兼具小分子前药和纳米药物优势于一体的基于 还原响应性两亲性小分子前药及其制备方法，其自组装的递送系统能有效提高药物上载量 和双药协同效应，解决当前小分子前药递送系统靶向传递以及药物选择性的可控释放问 题，推动肿瘤的精确诊断与高效治疗的技术的发展。
[0006] 本发明第二个目的在于，提供上述还原性响应两亲性小分子前药的制备方法。
[0007] 本发明的第三个目的在于，提供还原性响应两亲性小分子前药在药物靶向传递以 及药物选择性的可控释放靶向药物传递中发挥的作用。
[0008] 本发明的上述目的和其他目的通过以下技术方案来解决：
[0009] 还原性响应两亲性小分子前药是在喜树碱的唯一羟基位置引入还原响应的双硫 键，再引入亲水性药物分子，该亲水性小分子前药，可以自组装成高稳定性的纳米胶束，提 高了疏水性药物分子的水溶性，增加药物上载量，其亲水性药物的靶向传递功能可精确选 择释放出药物。
[0010] 所述的亲水性药物分子可以是具有靶向功能的叶酸分子，也可以是兼具靶向功能 与药物功能的甲氨蝶呤。
[0011] 本发明提供一类还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所述还 原性响应两亲性小分子前药的制备方法包括以下步骤：
[0012] ⑴制备还原性响应的喜树碱(CPT)前驱体:将喜树碱(CPT)，三光气，4-二甲氨基 吡啶（D M A P)的混合物分散到二氯甲烷(D C Μ)中，搅拌过夜，纯化后得到所需产物喜树碱 (CPT)前驱体；
[0013] (2)制备还原性响应两亲性小分子前药:包含双硫键的喜树碱(CPT)前驱体分散于 对应有机溶剂中，引入亲水性药物分子叶酸(FA)或氨甲喋呤(ΜΤΧ)，通过酯化或酰胺化反 应，获得还原性响应两亲性小分子前药FA-CPT和MTX-CPT，纯化后得到所需产物。
[0014]优选地，本发明提供的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所 述步骤（1)中喜树碱(CPT)前驱体的合成具体方法如下：氩气(Ar)氛围条件下，首先将喜树 碱(CPT)原始分子溶于无水二氯甲烷(DCM)中，接着分别滴加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和固 体三光气的二氯甲烷(DCM)溶液，避光下搅拌20分钟后，将含一定量的双(2-羟基乙基)二硫 醚(BHD)的无水四氢呋喃(THF)溶液缓慢滴加进去，搅拌过夜。经过分离提纯后，获得纯净的 单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)
[0015]优选地，本发明提供的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所 述步骤⑵中还原性响应两亲性小分子前药FA-CPT的合成具体方法如下:在温度<0°C和氩 气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、亲水性 药物分子叶酸(FA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，0°C下避 光搅拌30分钟，接着加入一定量的1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 (EDC · HC1)，0°C搅拌2小时后升至室温并搅拌48h，经过分离提纯，获得纯净的还原性响应 两亲性小分子前药产物FA-CPT。
[0016]优选地，本发明提供的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所 述步骤(2)中还原性响应两亲性小分子前药MTX-CPT的合成具体方法如下:在温度<0°C和 氩气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、氨甲 喋呤(MTX)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水二甲基亚砜(DMS0)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 混合溶剂中（v: v= 1:1)中，0°C下避光搅拌30分钟，加入一定量的二环己基碳二亚胺(DCC)， 〇°C下搅拌2小时后升至室温并搅拌48h，纯化后获得纯净的还原性响应两亲性小分子前药 MTX-CPT〇
[0017] 本发明的优点和有益效果在于:本发明提出了一类兼具小分子前药和纳米药物优 势于一体的基于还原响应性两亲性小分子前药及其制备方法，该前药的自组装递送系统， 有效提高药物上载量和双药协同效应，解决当前小分子前药递送系统靶向传递以及药物选 择性的可控释放问题，其中，叶酸(靶向功能)和甲氨蝶呤(兼靶向与药物功能)分子的引入， 可暂时屏蔽(OFF)药物分子的荧光，通过与癌细胞表面叶酸受体的特异性结合，导致纳米胶 束的解组装，药物分子的荧光可得到还原(0N)，实现癌细胞的精确诊断后，药物在刺激响应 下释放出药物，实现了癌症的精确诊断与治疗。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明的优选实施方式进行详细或者优选地描述，其中，
[0019] 图1为实施例1中还原性响应两亲性小分子前药(FA-CPT或MTX-CPT)的合成示意 图。
[0020]图2为实施例1中还原性响应两亲性小分子前药(FA-CPT)的核磁示意图。
[0021 ]图3为实施例1中小分子前药纳米胶束的DLS图。
[0022]图4为实施例1中小分子前药纳米胶束的TEM图。
[0023]图5为实施例1中小分子药物纳米胶束的对HeLa癌细胞的体外毒性图。
【具体实施方式】
[0024] 根据本发明的技术方案，在不变更本发明的实质精神的情况下，本领域的普通技 术人员可以提出本发明的多个结构方式。因此以下【具体实施方式】以及附图只是对本发明的 技术方案的具体说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限 制。
[0025] -类还原性响应两亲性小分子前药，其特征在于:在喜树碱的唯一羟基位置引入 还原响应的双硫键，再引入亲水性药物分子，结构通式如下，
[0027]其中，R为亲水性药物分子。
[0028] -类还原性响应两亲性小分子前药，其特征在于:所述的亲水性药物分子可以是 具有靶向功能的叶酸分子，也可以是兼具靶向功能与药物功能的甲氨蝶呤。
[0029] 本发明提供一种还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:还原性 响应两亲性小分子前药的制备方法包括以下步骤：
[0030] (1)制备还原性响应的喜树碱(CPT)前驱体:将喜树碱(CPT)，三光气，4-二甲氨基 吡啶（D M A P)的混合物分散到二氯甲烷(D C Μ)中，搅拌过夜，纯化后得到所需产物喜树碱 (CPT)前驱体；
[0031] (2)制备两亲性小分子前药:包含双硫键的喜树碱(CPT)前驱体分散于对应有机溶 剂中，引入亲水性药物分子叶酸(FA)或氨甲喋呤(ΜΤΧ)，通过酯化或酰胺化反应，获得还原 性响应两亲性小分子前药FA-CPT和MTX-CPT，纯化后得到所需产物。
[0032] 所述步骤（1)中喜树碱(CPT)前驱体的合成具体方法如下:氩气(Ar)氛围条件下， 首先将喜树碱(CPT)原始分子溶于无水二氯甲烷(DCM)中，接着分别滴加入4-二甲氨基吡啶 (DMAP)和固体三光气的二氯甲烷(DCM)溶液，避光下搅拌20分钟后，将含一定量的双(2-羟 基乙基）二硫醚(BHD)的无水四氢呋喃（THF)溶液缓慢滴加进去，搅拌过夜。经过分离提纯 后，获得纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)。
[0033] 所述步骤(2)中还原性响应两亲性小分子前药FA-CPT的合成具体方法如下：在温 度<0°C和氩气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、亲水性药物分子叶酸(FA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 中，0 °C下避光搅拌30分钟，接着加入一定量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺 盐酸盐(EDC · HC1)，0°C搅拌2小时后升至室温并搅拌48h，经过分离提纯，获得纯净的还原 性响应两亲性小分子前药产物FA-CPT。
[0034]所述步骤(2)中还原性响应两亲性小分子前药MTX-CPT的合成具体方法如下：在温 度<0°C和氩气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、氨甲喋呤(MTX)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水二甲基亚砜(DMS0)和N，N-二甲基甲 酰胺(DMF)混合溶剂中（ v:v = l: 1)中，0°C下避光搅拌30分钟，加入一定量的二环己基碳二 亚胺(DCC)，0°C下搅拌2小时后升至室温并搅拌48h，纯化后获得纯净的还原性响应两亲性 小分子前药MTX-CPT。
[0035] 本发明中涉及提纯的方法可以是萃取和柱色谱等。
[0036] 实施例1
[0037] 根据附图1所示的反应式，在氩气（Ar)氛围条件下，首先将一定量的纯喜树碱 (CPT)分子溶于无水二氯甲烷(DCM)中，接着分别加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和固体三光气 的DCM溶液，避光下搅拌20分钟后，加入一定量的双(2-羟基乙基）二硫醚(BHD)的无水四氢 呋喃(THF)溶液，搅拌过夜。经过分离提纯后，获得纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体 (BHD-CPT);在温度彡0 °C和氩气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱 (CPT)前驱体（BHD-CPT)、亲水性药物分子叶酸（FA)(取代基R = H时）、4_二甲氨基吡啶 (DMAP)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，0°C下避光搅拌30分钟，接着加入一定量的ΙΟ-二甲基氨基丙基 )-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 (EDC · HC1)，0°C 搅拌 2 小时后升至室温并 搅拌48h，经过萃取分离、柱色谱提纯，获得纯净的还原性响应两亲性小分子前药产物FA-CPT〇
[0038] 采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例1中靶向材料的结构，选用的溶剂为 d-DMSO，结果如图2所示。3.4ppm为亲水性药物分子叶酸(FA)上-N-Η上的Η，7.3ppm的质子峰 为BHD中的Hj.Oppm以下为FA-CPT中基团相互影响加强之后的质子Η峰，以上氢核磁谱图证 实了 FA-CPT的合成形成。
[0039] 实施例2
[0040] 将实施例1中制备的小分子前药制备成纳米胶束:室温情况下，配备5mg/mL的还原 性响应两亲性小分子前药产物FA-CPT的二甲基亚砜(DMS0)溶液，缓慢滴加到去离子水中， 搅拌一定时间后，透析获得浅黄色的小分子前药纳米胶束（图3右上角所示），通过动态光散 射法(DLS)和透视电镜(TEM)进行表征。如图3所示为小分子前药纳米胶束DLS图，结果显示 小分子前药纳米胶束的平均直径为46.4nm，其粒径分布系数为0.218，呈现良好的单分散状 态。如图4所示为小分子前药纳米胶束透射电镜图，表明结果显示胶束直径约为30nm。
[0041] 将实施例2中制备的小分子前药纳米胶束对HeLa癌细胞的体外毒性示意图图，随 着喜树碱(CPT)浓度增加与作用时间增加，HeLa癌细胞的细胞活性明显下降，随着还原性响 应两亲性小分子前药产物FA-CPT浓度的增加 HeLa癌细胞的细胞活性明显下降，作用时间越 长，活性下降越剧烈，即随着时间的增加(从24h到72h)，还原性响应两亲性小分子前药产物 FA-CPT形成的前药胶束对HeLa肿瘤细胞的一直持续增加。
[0042] 实施例3
[0043]根据附图1所示的反应式，在氩气（Ar)氛围条件下，首先将一定量的纯喜树碱 (CPT)分子溶于无水二氯甲烷(DCM)中，接着分别加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和固体三光气 的DCM溶液，避光下搅拌20分钟后，加入一定量的双(2-羟基乙基）二硫醚(BHD)的无水四氢 呋喃(THF)溶液，搅拌过夜。经过分离提纯后，获得纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体 (BHD-CPT); -定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、氨甲喋呤(MTX)、 4_二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水二甲基亚砜(DMSO)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中 ( v:v=1:1)中，(TC下避光搅拌30分钟，加入一定量的二环己基碳二亚胺(DCC)，(T C下搅拌2 小时后升至室温并搅拌48h，纯化后获得纯净的还原性响应两亲性小分子前药MTX-CPT。
[0044]容易理解，本发明通过在喜树碱唯一的羟基位置中引入还原响应的双硫键，独立 地引入叶酸(FA)或甲氨蝶呤(MTX)亲水性药物分子，获得还原性响应的两亲性小分子前药， 所得两亲性小分子前药可自组装成药物纳米胶束，并可选择性的释放出药物，解决了疏水 性药物分子的水溶性和结合纳米药物传递的特点。FA (靶向功能）和MTX (兼靶向与药物功 能)分子的引入，可暂时屏蔽(OFF)药物分子的荧光，通过与癌细胞表面叶酸受体的特异性 结合，导致纳米胶束的解组装，药物分子的荧光可得到还原(0N)，实现癌细胞的精确诊断 后，药物在刺激响应下释放出药物，实现了药物靶向传递、高药物上载量、刺激响应控制的 药物释放、高胶束稳定性，能对癌症精确诊断与治疗。
【主权项】
1. 一类还原性响应两亲性小分子前药，其特征在于:在喜树碱的唯一羟基位置引入还 原响应的双硫键，再引入亲水性药物分子，结构通式如下，其中，R为亲水性药物分子。2. 根据权利要求1所述的还原性响应两亲性小分子前药，其特征在于:所述的亲水性药 物分子可以是具有靶向功能的叶酸分子，也可以是兼具靶向功能与药物功能的氨甲蝶呤。3. 根据权利要求1所述的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所述 还原性响应两亲性小分子前药的制备方法包括以下步骤： (1) 制备还原性响应的喜树碱(CPT)前驱体:将喜树碱(CPT)，三光气，4-二甲氨基吡啶 的混合物分散到二氯甲烷中，搅拌过夜，纯化后得到所需产物喜树碱(CPT)前驱体； (2) 制备两亲性小分子前药:包含双硫键的喜树碱(CPT)前驱体分散于对应有机溶剂 中，引入亲水性药物分子叶酸(FA)或氨甲喋呤(MTX)，通过酯化或酰胺化反应，获得还原性 响应两亲性小分子前药FA-CPT和MTX-CPT，纯化后得到所需产物。4. 根据权利要求3所述的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所述 步骤（1)中喜树碱(CPT)前驱体的合成具体方法如下:氩气(Ar)氛围条件下，首先将喜树碱 (CPT)原始分子溶于无水二氯甲烷中，接着分别滴加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和固体三光 气的二氯甲烷溶液，避光下搅拌20分钟后，将含一定量的双(2-羟基乙基)二硫醚(BHD)的无 水四氢呋喃溶液缓慢滴加进去，搅拌过夜。经过分离提纯后，获得纯净的单羟基取代的喜树 碱前驱体(BHD-CPT)。5. 根据权利要求3所述的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所述 步骤(2)中还原性响应两亲性小分子前药FA-CPT的合成具体方法如下:在温度<0°C和氩气 (Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、亲水性药 物分子叶酸(FA)、4-二甲氨基吡啶溶于无水N，N-二甲基甲酰胺中，0°C下避光搅拌30分钟， 接着加入一定量的1_(3_二甲基氨基丙基)_3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ? HC1)，0°C搅拌 2小时后升至室温并搅拌48h，经过分离提纯，获得纯净的还原性响应两亲性小分子前药产 物FA-CPT。6. 根据权利要求3所述的还原性响应两亲性小分子前药的制备方法，其特征在于:所述 步骤⑵中还原性响应两亲性小分子前药MTX-CPT的合成具体方法如下:在温度<0°C和氩 气(Ar)氛围条件下，一定量的纯净的单羟基取代的喜树碱(CPT)前驱体(BHD-CPT)、氨甲喋 呤(MTX)、4-二甲氨基吡啶溶于无水二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂中（v :v=l: 1)中，0°C下避光搅拌30分钟，加入一定量的二环己基碳二亚胺，0°C下搅拌2小时后升至室 温并搅拌48h，纯化后获得纯净的还原性响应两亲性小分子前药MTX-CPT。
【文档编号】A61P35/00GK106046029SQ201610379752
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】许志刚, 康跃军, 薛鹏, 石潇潇, 侯美丽, 高永娥
【申请人】西南大学