专利名称：一种生产α淀粉酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产混合α淀粉酶。
背景技术：
α淀粉酶(a-amylase, EC 3. 2. I. I)广泛存在于生物界。α淀粉酶能够催化随机水解淀粉的α-l，4-糖苷键，产生麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。α淀粉酶广泛应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和医药等行业。当前市场上的α淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的α淀粉酶。但是，由于天然的产α淀粉酶菌株的生长缓慢，营养要求较高，使酶的生产成本较高；另之，当前的α淀粉酶产品的适合反应温度范围和适合反应 pH范围窄，不能满足当前市场的需求。由于α淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的ct淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。
发明内容
根据α淀粉酶有多种来源，不同来源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的α淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的α淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合α淀粉酶将具有理化特性多祥性，即具有多个最适温度和最适pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。来源于大麦(Hordeumvulgare)的α淀粉酶最适合pH 5,最适温度70°C,在pH5_6和35至73°C的温度下有>60%的酶活性；来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶最适pH 8. 5,最适温度80°C，在ρΗ5-9· 5和55-90°C有>60%的酶活性；来自于曲霉(Aspergillus)的α淀粉酶最适合pH 4，最适温度是70°C，在pH 3-6和50-75°C有>60%的酶活性。由于这三种酶的功能相同，所以，这三种在毕赤酵母或酿酒酵母或枯草芽孢杆菌中表达的混合α淀粉酶适合于在酸性、中性、碱性、常温、中温和较高温度的条件下使用。即这种混合酶的用途将比其中的単独酶广。若分别用不同的菌株来表达这三种酶，其生产成本将高于用ー个菌株同时生产这三种酶的混合酶。本发明构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶。本发明所采用的技术方案是I.克隆酶基因应用分子生物学技术，分别从大麦基因组、地衣芽孢杆菌基因组和曲霉基因组中扩增α淀粉酶基因。2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录終止子和抗性基因。3.构建如附图I、附图2和附图3的含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体。4.将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化 枯草芽孢杆菌。[说明.表达框架启动子-信号肽-基因-转录终止子]5.筛选高表达大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶的毕赤酵母重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；筛选高表达大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶的酿酒酵母重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；筛选高表达大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌エ程菌。6.发酵含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合α淀粉酶。本发明构建的含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合α淀粉酶的优点体现于本发明通过构建毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，应用工程菌生产三种重组α淀粉酶的混合酶产品，一方面提供适合于在酸性、中性和碱性多种温度环境下使用的混合α淀粉酶新产品，另ー方面取代发酵分别含这三种酶基因的菌株生产大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶。即用ー个发酵エ序生产三种α淀粉酶取代用三个エ序分别生产三种α淀粉酶。达到节省原材料、能耗和人力资源的作用。
附图I.含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。
p.毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. α因子信号肽；H-amy.大麦的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；p. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。附图2.含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体。p.酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. α因子信号肽；H-amy.大麦的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选酿酒酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；S. cerevisiae rDNA.酿酒酵母的rDNA序列。
附图3.含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体。p.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. α因子信号肽；H-amy.大麦的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B. Subtilis rDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进ー步说明。实施例I :I. I构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体I. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPD。1.1.2获取基因①用反转录PCR扩增大麦的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 各 TGATGATGATGATGATG!
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用植物RNA提取试剂盒提取大麦的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是大麦的α淀粉酶基因序列。②用PCR扩增地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信号肽)引物I :5，GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，A A GCGGCCGCC T A ^TG ATGATGATGATGATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。] 提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是地衣芽孢杆菌的含信号肽的α淀粉酶基因序列。[说明地衣芽孢杆菌基因组DNA提取方法将地衣芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]③用反转录PCR扩增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3'[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A !ATGATGATGATGATGATG
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [说明5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是曲霉的α淀粉酶基因序列。I. I. 3分别构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架。①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’ )进行 PCR 扩增，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC
[说明毕赤酵母基因组DNA提取方法将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5， CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，说明引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位(有下划线的6个碱基)。
提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.大麦的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pH)载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pH)载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的大麦的α淀粉酶基因序列重组于pH)载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pro载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PPD1。B.地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的构建 通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pH)载体的多克隆位点；将PCR扩增获得的地衣芽孢杆菌的包含信号肽的α淀粉酶基因序列重组于pH)载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止子序列重组于pro载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PPD2。C.曲霉的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pH)载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pH)载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的曲霉的α淀粉酶基因序列重组于pH)载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pro载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PPD3⑦完成毕赤酵母表达载体的构建Α.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切下pPD2和pPD3载体的表达框架，并将其切下的两个表达框架重组于PPDl的多克隆位点。此载体称为PPD123.B.通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPD123载体的多克隆位点，构成含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图I)。I. 2构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌用电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体(见附图I)转化毕赤酵母，将经过电转化的毕赤酵母细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用大麦的α淀粉酶基因的特异引物、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因的特异引物和曲霉的α淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩増，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种α淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明大麦的α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合α淀粉酶的重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。I. 3生产重组大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和 曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含大麦的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母分别接种于YH)培养基中，30°C摇床发酵两天；将天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌(应用于I. I.2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌菌株)接种于LB (I %胰蛋白胨，I %氯化钠，O. 5%酵母提取物)培养基，37°C摇床发酵两天；将曲霉(应用于I. I. 2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于50°C、70°C和80°C条件分析其发酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和碱性(pH8. 5)环境下的α淀粉酶活性。结果表明，将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均α淀粉酶活性分别是50°C和ρΗ4 (1862109单位)、50°C和 pH5 (2930226 单位)、50°C和 pH7 (3289090 单位)、50°C和 pH8. 5 (1504093 单位)、70°C 和 pH4 (2418659 单位)、70°C 和 pH5 (3761490 单位)、70°C 和 pH7 (4518382 单位)、70°C和 ρΗ8· 5(2151179单位)、80で和ロ!14(2432195单位)、80で和ロ册(4346099 单位)、80°C和pH7(3266072单位)、80°C和ρΗ8·5(2729903单位)；含大麦的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液上清(每升)在大麦的α淀粉酶的最适合的温度和pH (ρΗ5和70°C )的平均α淀粉酶活性是2275490单位；含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ8. 5和80°C)的平均α淀粉酶活性是1490156单位；含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和pH (70°C和pH4)的平均α淀粉酶活性是1500271单位；天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ8·5和80°C)的平均α淀粉酶活性是995486単位；曲霉的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是1033457单位；不含α淀粉酶基因的毕赤酵母的发酵液上清(每升)在以上所述的各种温度和PH都没有测到α淀粉酶活性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌表达的α淀粉酶在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都具有良好的α淀粉酶活性，并且其α淀粉酶活性显著高于(P <0.01)含单种α淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌或产α淀粉酶的天然菌株的表达产物的α淀粉酶活性。说明a.含单种α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法的差别在于表达载体的构建；含单种α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体的构建方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体构建的方法的差别在于前者只含ー种α淀粉酶基因表达框架，而后·者含三种α淀粉酶基因表达框架。c. α淀粉酶活性測定方法应用可溶淀粉平板測定方法。制备含2%可溶淀粉的琼脂平板，将牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同浓度的α淀粉酶标准溶液和不同菌株的发酵液加于不同的牛津杯中，并在每个杯中加入50 μ I磷酸盐缓冲液。于50°C放置12小时，然后用碘-碘化钾(I2-KI)溶液染色，计算透明圈直径。对以上实验进行三个重复，结果分析取平均值。根据不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈绘制标准曲线；根据测试样品的透明圈直径和不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈标准曲线计算出各个测试菌株的发酵液的α淀粉酶活性。实施例2 2. I构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体2. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pSD。2. I. 2获取基因①用反转录PCR扩增大麦的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 色 TGATGATGATGATGATG;
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用植物RNA提取试剂盒提取大麦的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是大麦的α淀粉酶基因序列。②用PCR扩增地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信号肽)
引物I :5，GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，A A GCGGCCGCC T A ^JG ATGATG ATGATGATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是地衣芽孢杆菌的含 信号肽的α淀粉酶基因序列。[说明地衣芽孢杆菌基因组DNA提取方法将地衣芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]③用反转录PCR扩增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3'[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A ^ATGATGATGATGATGATG
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [说明5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是曲霉的α淀粉酶基因序列。2. I. 3分别构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架。①用PCR扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。引物I:5’ CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5’ GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩増，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。[说明酿酒酵母基因组DNA提取方法将酿酒酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从酿酒酵母基因组中PCR扩增rDNA序列引物I:5 ’ CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3’引物2:5 ’ CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酿酒酵母基因组中的rDNA序列。、
⑥表达框架构建过程A.含大麦的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSD载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pSD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的大麦的α淀粉酶基因序列重组于PSD载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PSD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PSD1。B.含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSD载体的多克隆位点；将PCR扩增获得的地衣芽孢杆菌的包含信号肽的α淀粉酶基因序列重组于PSD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下 游；将转录终止子序列重组于PSD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PSD2。C.含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSD载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pSD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的曲霉的α淀粉酶基因序列重组于PSD载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pSD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PSD3⑦完成酿酒酵母表达载体的构建Α.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和Τ4 DNA连接酶的作用，分别切下pSD2和pSD3载体的表达框架，并将其切下的两个表达框架重组于PSDl的多克隆位点。此载体称为PSD123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将酿酒酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pSD123载体的多克隆位点，构成含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体(附图2)。2. 2构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌用电转化方法将以上构建的酿酒酵母表达载体(见附图2)转化酿酒酵母，将经过电转化的酿酒酵母细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用大麦的α淀粉酶基因的特异引物、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因的特异引物和曲霉的α淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩増，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种α淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，I % yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用Hi s标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明大麦的α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合α淀粉酶的重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌。2. 3生产重组大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含大麦的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和不含α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母分别接种于YH)培养基中，30°C摇床发酵两天；将天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌(应用于 I. I.2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌菌株)接种于LB (I %胰蛋白胨，I %氯化钠，O. 5%酵母提取物)培养基，37°C摇床发酵两天；将曲霉(应用于2. I. 2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于50°C、70°C和80°C条件分析其发酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和碱性(PH8.5)环境下的α淀粉酶活性。结果表明，将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均α淀粉酶活性分别是50°C和ρΗ4(650760单位)、50°C 和 pH5 (976407 单位)、50°C 和 pH7 (1096364 单位)、50°C和 ρΗ8· 5 (495433 单位)、70°C和 pH4 (806217 单位)、70°C和 pH5 (1253830 单位)、70°C和 pH7 (1502794 单位)、70°C和 ρΗ8· 5(717058单位)、80で和ロ財(810731 单位)、80°C和 ρΗ5 (1448699 单位)、80°C和 !17(1752024单位)、80で和？!18.5(906641单位)；含大麦的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的发酵液上清(每升)在大麦的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ5和70°C )的平均α淀粉酶活性是758495単位；含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和pH (ρΗ8. 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是495685单位±62单位；含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和pH(ρΗ4和70°C)的平均α淀粉酶活性是499690单位；天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ8·5和80°C)的平均α淀粉酶活性是78065単位；曲霉的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是87089単位；不含α淀粉酶基因的酿酒酵母的发酵液上清(每升)在以上所述的各种温度和PH都没有测到α淀粉酶活性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌表达产物在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都显示有良好的α淀粉酶活性，并且显著高于(P<0.01)含单种α淀粉酶基因的酿酒酵母工程菌或产α淀粉酶的天然菌株的表达产物的α淀粉酶活性。 说明a.含单种α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的构建的方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌的构建的方法的差别在于表达载体的构建；含单种α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体的构建方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体构建的方法的差别在于前者只含ー种α淀粉酶基因表达框架，而后者含三种α淀粉酶基因表达框架。c. α淀粉酶活性測定方法应用可溶淀粉平板測定方法。制备含2%可溶淀粉的琼脂平板，将牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同浓度的α淀粉酶标准溶液和不同菌株的发酵液加于不同的牛津杯中，并在每个杯中加入50 μ I磷酸盐缓冲液。于50°C放置12小时，然后用碘-碘化钾(I2-KI)溶液染色，计算透明圈直径。对以上实验进行三个重复，结果分析取平均值。根据不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈绘制标准曲线；根据测试样品的透明圈直径和不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈标准曲线计算出各个测试菌株的发酵液的α淀粉酶活性。实施例3:3. I构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体3. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pBD。3. I. 2获取基因①用反转录PCR扩增大麦的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5 ’ C A GCGGCCGCC T A 色 TGATGATGATGATGATGI;
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用植物RNA提取试剂盒提取大麦的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是大麦的α淀粉酶基因序列。②用PCR扩增地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信号肽)引物I : 5 ’ GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:
5，A A GCGGCCGCC T A ^TGATGATG ATGATG ATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是地衣芽孢杆菌的含信号肽的α淀粉酶基因序列。[说明地衣芽孢杆菌基因组DNA提取方法将地衣芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]③用反转录PCR扩增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3;[说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A KtGATGATGATGATGATG|i
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [说明5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]应用真菌RNA提取试剂盒提取曲霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是曲霉的α淀粉酶基因序列。3. I. 3分别构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体。 ①用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子序列引物I :5’ CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3’引物2:5’ GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA[巨大枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法将枯草芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]，以巨大芽孢杆菌的基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCC
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC TGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列引物I.5，CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3 引物2.5，CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3 [说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]。提取枯草芽孢杆菌基因组DNA(基因组DNA提取方法同以上所述的巨大枯草芽孢杆菌的基因组DNA提取方法)，以基因组DNA为模板应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.含大麦的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和Τ4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBD载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的大麦的α淀粉酶基因序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PBD1。B.含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的构建 通过DNA限制性内切酶和Τ4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBD载体的多克隆位点；将PCR扩增获得的地衣芽孢杆菌的包含信号肽的α淀粉酶基因序列重组于pBD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止子序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PBD2。C.含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和Τ4 DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBD载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将反转录扩增获得的曲霉的α淀粉酶基因序列重组于PBD载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pBD载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的载体称为PBD3⑦完成枯草芽孢杆菌表达载体的构建A.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切下pBD2和pBD3载体的表达框架，并将其切下的两个表达框架重组于PPDl的多克隆位点。此载体称为PBD123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将枯草芽孢杆菌的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPD123载体的多克隆位点，构成含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图3)。3. 2构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌用电转化方法将以上构建的枯草芽孢杆菌表达载体(见附图3)转化枯草芽孢杆菌，将经过电转化的枯草芽孢杆菌细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用大麦的α淀粉酶基因的特异引物、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因的特异引物和曲霉的α淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种α淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用Hi s6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的三种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明大麦的α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种混合α淀粉酶的重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。3. 3生产重组大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶分别将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含大麦的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、不含α淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌和天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌(应用于I. I. 2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌菌株)分别接种于LB培养基(I %胰蛋白胨，I %氯化钠，O. 5%酵母提取物)中，30°C摇床发酵两天；将曲霉(应用于I. I. 2所述的PCR扩增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C摇床发酵3天。以上所述的每个菌株的发酵都是一式三份。分别收集其发酵液上清于50°C、70°C和80°C条件分析其发酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和碱性(pH8. 5)环境下的α淀粉酶活性。结果表明，将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清(每升)在以上所述的温度和PH的平均α淀粉酶活性分别是50°C和ρΗ4(175358单位)、50°C和 pH5 (285105 单位)、50°C和 pH7 (318814 单位)、50°C和 pH8. 5(142762 单位)、70 V 和 pH4 (233669 单位)、70°C 和 pH5 (367059 单位)、70°C 和 pH7 (445030 单位)、70 °C和 pH8. 5(210096 单位)、80°C 和 pH4 (239046 单位)、80°C 和 pH5 (426087 单位)、80°C 和PH7 (318690单位)、80°C和ρΗ8· 5 (260819单位)；含大麦的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清(每升)在大麦的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ5和70°C)的平均α淀粉酶活性是218095単位；含地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ8. 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是138990单位；含曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和pH(70°C和ρΗ4)的平均α淀粉酶活性是103027单位；天然的产α淀粉酶的地衣芽孢杆菌的发酵液上清(每升)在地衣芽孢杆菌的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ8· 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是82917単位；曲霉的发酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最适合的温度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是7834単位；不含α淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌的发酵液上清(每升)在以上所述的各种温度和PH都没有测到α淀粉酶活、性。以上发酵表达产物的酶活性分析的结果表明含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌表达的α淀粉酶在酸性、中性和碱性以及不同的试验温度都具有良好的α淀粉酶活性，并且其α淀粉酶活性显著高于(P <0.01)含单种α淀粉酶基因的工程菌或产α淀粉酶的天然菌株的表达产物的α淀粉酶活性。说明a.含单种α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的构建的方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的构建的方法的差别在于表达载体的构建；含单种α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体的构建方法与含三种α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体构建的方法的差别在于前者只含ー种Ct淀粉酶基因表达框架，而后者含三种α淀粉酶基因表达框架。 c. α淀粉酶活性測定方法应用可溶淀粉平板測定方法。制备含2%可溶淀粉的琼脂平板，将牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同浓度的α淀粉酶标准溶液和不同菌株的发酵液加于不同的牛津杯中，并在每个杯中加入50 μ I磷酸盐缓冲液。于50°C放置12小时，然后用碘-碘化钾(I2-KI)溶液染色，计算透明圈直径。对以上实验进行三个重复，结果分析取平均值。根据不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈绘制标准曲线；根据测试样品的透明圈直径和不同浓度的α淀粉酶标准的透明圈标准曲线计算出各个测试菌株的发酵液的α淀粉酶活性。
权利要求
1.一种生产α淀粉酶的方法，其特征在于，其具体步骤如下 1)、应用分子生物学技术克隆大麦的α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因； 2)、分别构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体； 3)、将毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子，将酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母从而获得酿酒酵母重组子，将枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌从而获得枯草芽孢杆菌重组子； 4)、筛选高表达以上所述的三种α淀粉酶的毕赤酵母重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种α淀粉酶的酿酒酵母重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌，筛选高表达以上所述的三种α淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌； 5)、分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合α淀粉酶。
2.根据权利要求I所述ー种生产α淀粉酶的方法，其特征在干利用权利要求I所述的生产α淀粉酶的方法制备成重组混合α淀粉酶产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产α淀粉酶的方法。属生物技术领域。首先分别克隆大麦、地衣芽孢杆菌和曲霉的α淀粉酶基因；构建含以上三种α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将载体分别转化相对应的宿主菌；分别筛选高表达α淀粉酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合α淀粉酶。与传统的由单基因编码的α淀粉酶不同，本发明生产的重组混合α淀粉酶的适合反应的温度和pH范围广，适合于多种用途；并且，含多基因表达框架的工程菌表达的α淀粉酶的产量明显高于含单基因的工程菌表达的α淀粉酶的产量，起到降低生产成本作用。
文档编号C12N9/30GK102747058SQ20121025184
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者刘振旺, 张添元, 张爱联, 符仙, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所