一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法
【专利摘要】本发明提供一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，包括以下步骤：（1）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备；（2）含有外源基因的农杆菌菌液制备；（3）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化；（4）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的鉴定。本发明利用农杆菌介导的方法，将外源基因转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的基因组中，获得了尖孢镰刀菌西瓜专化型转基因菌株。该方法简单、快捷、重复性好、转化效率高，可用于尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株突变体库构建、寄主抗性筛选、寄主对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染的防卫反应、以及尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染及致病机理的研究。
【专利说明】一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法。
【背景技术】
[0002]西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染引起的维管束系统病害。病菌通过土壤、种子传播，在离开寄主的情况下，能存活5-6年，厚垣孢子可存活10年以上。西瓜枯萎病在西瓜生长的各个时期都会发生，据调查，发病瓜田一般减产30%，严重地块可达80%，甚至绝产，是国内外西瓜生产上最严重的病害之一，已成为制约西瓜生产的主要障碍。培育优质抗病且适合设施栽培的西瓜新品种是有效控制西瓜枯萎病的主要方法，但由于西瓜遗传基础狭窄，优质抗病种质资源极少，再加上对于尖孢镰刀菌西瓜专化型的分子遗传基础和致病机制了解不够透彻，迄今仍没有彻底解决问题。因此，要有效控制西瓜枯萎病的发生，首先需要深入研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的侵染过程和致病机理，鉴定出控制致病性的关键基因。
[0003]目前，国内外已有利用农杆菌介导的遗传转化方法转化真菌的报道，但已报道的方法或未涉及转化相关细节，或转化步骤繁琐。因此，为了获得带有标记基因的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株，构建尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株突变体库，急需一种高效、稳定且简便易行的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，为研究尖孢镰刀菌西瓜专化型菌的侵染过程和致病机理奠定基础，同时，为深入研究病原菌致病相关基因、病原菌与寄主互作以及病原菌的功能基因组学研究奠定基础。
【发明内容】
[0004]解决的技术问题:针对现有技术存在的不足，本发明提供一种简化的农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法。
[0005]技术方案:一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于包括以下4个步骤:
(1)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备；
(2)含有外源基因的农杆菌菌液制备；
(3)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化；
(4)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的鉴定。
[0006]上述所述步骤(1)方法如下:挑取枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝，在马铃薯固体培养基上培养7 d后，用培养基A收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至IxlO6个/mL，得到尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液，备用；
上述所述步骤(2) 的方法如下:将携带表达载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板A上划线，28°C培养48 h后，挑取单克隆，接种到5mL培养基B中，于25 °C，220rpm摇培48 h后用紫外分光光度计测0D_值，用培养基A稀释，使菌液0D_=0.15，然后将菌液稀释液在28°C振荡培养6 h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。
[0007]上述所述步骤(3)的转化方法如下:
1)将步骤(2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤(1)中制备的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液等体积混合，取200 U L混合液均匀涂布于不含抗生素的頂共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，25 °C避光共培养48 h；
2)共培养48h后，将滤膜揭下，反铺到培养基C上，25 °C培养48 h ；
3)48h后弃掉硝酸纤维素滤膜，将PDA筛选平板在25 °C继续培养至生长出转化子；
4)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25°C培养，保存得到的转化子，用于阳性鉴定。
[0008]上述所述的步骤(1)、(2)和(3)中的培养基A是加入了 200 Mmol ? L—1乙酰丁香酮的頂液体诱导培养基，IM液体诱导培养基出自(Bundock等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995,14:3206-3214);平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板，YEB平板是根据书本《分子克隆试验指南第三版》制备的；培养基B是加入了 50 mg -L^1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的MM液体基础培养基，MM液体基础培养基出自(Hooykaas等，J.Gen.M1-crobiol.1979，110:99-109);頂共培养平板出自(Bundock 等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);培养基 C 是加入了 60 mg ? I71 链霉素和 50 mg ? I71 潮霉素的马铃薯固体培养基。
[0009]上述所述步骤(4)的方法如下:
1)采用PCR方法，用绿色荧光蛋白基因的基因特异性引物检测转化子中外源基因的整
合；
2)采用OLYMPUSDP72荧光显微镜观察转化子是否携带外源基因。
[0010]上述所述的步骤(4)中的外源基因为绿色荧光蛋白基因，绿色荧光蛋白基因的基因特异性引物为:GFP-F:5’ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’，GFP-R:5’ -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。
[0011]有益效果:本发明以尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因转入到尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转基因菌株，该方法具有以下优点:
(1)简单、快捷:农杆菌AGL-1菌液和尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的孢子悬浮液等体积混匀后无需再培养，可直接涂布于硝酸纤维素膜表面，48h即可揭膜；
(2)重复性好:在不同的实验室由不同的研究人员操作均可获得稳定的转化子；
(3)转化效率高:约为560个转化子/IO6个分生孢子；
(4)可用于尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株突变体库的构建、寄主抗性筛选、寄主对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染的防卫反应、及尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染和致病机制的研究。
[0012]【专利附图】
【附图说明】
图1:尖孢镰刀菌西瓜专化型阳性转化子的荧光检测结果，其中灰色的部分表示绿色荧光，A:菌丝体，B:分生孢子。
[0013]图2:尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子的PCR检测结果，其中M:DL2000 DNA Marker ；1:阳性质粒的GFP基因PCR扩增结果；2-5:阳性转化子的GFP基因PCR扩增结果。
[0014]图3:铺有硝酸纤维素滤膜的IM共培养平板图。
[0015]图4:将硝酸纤维素滤膜反铺于PDA筛选平板图。
[0016]图5 =PDA筛选平板上生长的尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子图。
[0017]图6:尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子的二次筛选图。
【具体实施方式】
[0018]本实施方式中的枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株由国家蔬菜工程技术研究中心提供；携带表达载体PGFP的农杆菌AGL-1由江苏省农业生物学重点实验室提供；硝酸纤维素滤膜购于国药集团化学试剂有限公司。
[0019]本实施方式中的马铃薯固体培养基和PDA筛选平板是根据书本《分子克隆试验指南第三版》制备的；培养基A是加入了 200 Mmol ? L-1乙酰丁香酮的頂液体诱导培养基，頂液体诱导培养基出自(Bundock等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板，YEB平板是根据书本《分子克隆试验指南第三版》制备的；培养基B是加入了 50 mg ? L-1卡那霉素和50 mg ? L-1利福平的MM液体基础培养基，MM液体基础培养基出自(Hooykaas等，J.Gen.M1-crobiol.1979，110:99-109);頂共培养平板出自(Bundock 等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);培养基C是加入了 60 mg ? L—1链霉素和50 mg ? L—1潮霉素的马铃薯固体培养基。
[0020]本实施方式中的CTAB 提取缓冲液由 0.7mol/L NaClUOO mmol/L Tris-HCl pH
8.0、20mmol/L EDTAUOg/L PVP、20g/L CTAB 和 0.1% ^ -巯基乙醇组成；TE 缓冲液由 10mmol/L Tris-HCl 和 I mmol/L EDTA 组成，其 pH 为 8.0。
[0021]实施例1
农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其步骤如下:
1、尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备
用接种环挑取枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝，接种到马铃薯固体培养基上，28°C培养7 d，用6 mL培养基A和灭菌的小毛刷清洗病原菌孢子，将孢子液收集到灭菌的三角瓶中，用灭菌的双层纱布过滤，然后用培养基A稀释孢子液，用血球计数板计算分生孢子浓度，调节孢子液浓度至IxlO6个/mL，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。
[0022]2、含有外源基因的农杆菌菌液制备
将携带表达载体PGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板A上划线，28°C培养48 h后，挑取单克隆，接种到5mL培养基B中，于25 °C，220rpm摇培48 h后用紫外分光光度计测0D_值，用培养基A稀释，使菌液0D_=0.15，然后将菌液稀释液在28 0C振荡培养6 h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。
[0023]3、尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化
1)将步骤2中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤I中制备的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液等体积混合，取200 U L混合液均匀涂布于不含抗生素的頂共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面(如图3)，25 °C避光共培养48 h；
2)共培养48h后，将滤膜揭下，反铺到培养基C上(如图4)，25 °C培养48 h ；3)48h后弃掉硝酸纤维素滤膜，将PDA筛选平板在25 °C继续培养至生长出转化子(如图5)；
4)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选(如图6)，25V培养，保存得到的转化子，用于阳性鉴定。
[0024]4、尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的PCR鉴定
I)转化子基因组DNA的提取
采用CTAB法提取转化子基因组DNA，步骤如下:
1:、取50 mg新鲜菌丝，加600ML 2 x CTAB提取缓冲液和少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨；
%、将研磨后的溶液转入1.5mL无菌Eppendorf管中，于65 "€水浴保温30 min,加等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分摇匀，4 1:下8 000 X g离心5 min ；
I'、移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰冻乙醇，NaAc溶液的体积是上清液体积的10%，其pH为6.0，冰冻乙醇的体积是上清液体积的2.5倍，在-20 °C沉淀30 min ；
1、4 V 10000 X g离心5 min，弃上清液，用70%的无水乙醇清洗沉淀2_3次，通风干燥沉淀20 min,加TE缓冲液充分溶解，即为转化子基因组DNA溶液，-20 1:保存备用。
[0025]2) PCR扩增检测
为了确定外源基因在尖孢镰刀 菌西瓜专化型菌株基因组中的整合情况，采用PCR扩增方法进行了外源基因的特异性分子鉴定。
[0026]根据表达载体中绿色荧光蛋白基因序列设计基因特异性引物用于PCR扩增，引物序列分别为:
GFP-F:5，-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，
GFP-R:5’ -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’
扩增产物长度为708bp。
[0027]按表1依次在无菌的PCR反应管中加入PCR反应试剂，短暂涡旋混匀后将PCR反应管置于PCR仪中进行扩增。PCR扩增程序为:94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，58 V退火40 s,72 °C延伸50 s，30个循环；最后72 °C延伸5 min ；12 °C保温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图2 )。
[0028]表1 PCR反应体系 Table I PCR reaction system
【权利要求】
1.一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于包括以下4个步骤: (1)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备:挑取枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝，在马铃薯固体培养基上培养7 d后，用培养基A收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至IxlO6个/mL，得到尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液，备用； (2)含有外源基因的农杆菌菌液制备:将携带表达载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板A上划线，28°C培养48 h后，挑取单克隆，接种到5mL培养基B中，于25 °C，220rpm摇培48 h后用紫外分光光度计测OD_值，用培养基A稀释，使菌液0D_=0.15，然后将菌液稀释液在28°C振荡培养6 h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用； (3)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化: 1)将步骤(2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤(1)中制备的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液等体积混合，取200 U L混合液均匀涂布于不含抗生素的頂共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，25 °C避光共培养48 h； 2)共培养48h后，将滤膜揭下，反铺到培养基C上，25 °C培养48 h ； 3)48h后弃掉硝酸纤维素滤膜，将PDA筛选平板在25 °C继续培养至生长出转化子； 4)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25°C培养，保存得到的转化子，用于阳性鉴定； (4)尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于所述步骤(4)的方法如下:` 1)采用PCR方法，用绿色荧光蛋白基因的基因特异性引物检测转化子中外源基因的整合； 2)采用OLYMPUSDP72荧光显微镜观察转化子是否携带外源基因。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于:培养基A是加入了 200 Mmol ? L-1乙酰丁香酮的IM液体诱导培养基，培养基B是加入了 50 mg -T1卡那霉素和50 mg-T1利福平的丽液体基础培养基，培养基C是加入了 60 mg ? L—1链霉素和50 mg ? L—1潮霉素的马铃薯固体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于:平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板。
5.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于:所述外源基因为绿色荧光蛋白基因，绿色荧光蛋白基因的基因特异性引物为:GFP-F:5，-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，，GFP-R:5，-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3，。
【文档编号】C12R1/77GK103757046SQ201410003576
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】张曼, 羊杏平, 徐锦华, 刘广, 姚协丰, 李苹芳 申请人:江苏省农业科学院