Rna干扰载体片段、rna干扰载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用调控植物结瘤固氮能力的RNA干扰载体，包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构利用SEQ?ID?NO：2所示的基因片段构建，将基因片段插入到pTCK303载体的限制性内切酶KpnI/Spe?I和BamH?I/Sac?I酶切识别位点之间，得到重组RNA干扰载体。使所得RNA干扰载体转化受体植物，沉默受体植物中的对应基因，使受体植物的根组织具有增强的结瘤固氮能力。利用本发明构建的RNA干扰载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。
【专利说明】RNA干扰载体片段、RNA干扰载体及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别涉及来源于大豆的和根瘤发育相关的GmNNCl基因的RNA干扰载体及其在培育高固氮能力大豆新品种方面的应用。
【背景技术】
[0002]大豆是重要的粮油经济作物，其通过根部着生的根瘤可固定空气中的氮气，从而转化为植物可以吸收利用的氨态氮，为大豆生长发育提供了必需的氮素养料。由根瘤这一菌根共生器官介导的共生固氮过程不仅有利于大豆的生长，更极大促进了在减少肥料施入的同时大豆产量的提高。目前，提高固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。
[0003]大豆根系结瘤固氮是一个受到多个基因调控的非常复杂的生物学过程，目前越来越多的调控基因被报道。大豆中的FW2.2-likel(Libault et al.，2010)、GS52(Govindarajulu et al., 2009;Tanaka et al., 2011)和 CND 基因(Libault etal.，2009)均被证明可以调控根瘤的发育过程。2012年，大豆中编码14_3_3蛋白的SGF14c和SGF141基因被证明 [0004]AP2/ERF家族转录因子是植物中重要的一类转录因子，其被证明可以广泛参与植物各类生理过程，在花器官的发育，开花时间的调控，植物体的时态转换，育性等方面具有重要的调控作用(Chen, 2004; Jung et al., 2007; Zhao et al., 2007, Zhu et al.，2009)。目前尚未见到关于AP2/ERF调控豆科根瘤发育的报道。大豆中AP2/ERF基因功能的鉴定将为我们阐明大豆根瘤发育的分子机制提供依据，从而为通过生物固氮提高大豆的固氮效率另辟蹊径。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种RNA干扰载体及其培育高结瘤固氮植物的应用，尤其是提供一种培育具有高固氮能力的大豆新品种的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0007]—种用于构建RNA干扰载体的基因片段，此基因片段用于构建RNA干扰载体的发夹结构，所述基因片段的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，此片段作为正义链。
[0008]上述基因片段的互补核苷酸序列，即与正义链互补的反义链。
[0009]一种用于调控植物结瘤固氮能力的RNA干扰载体，包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构利用权利要求1或2所述的基因片段构建。
[0010]作为本发明的一种优选技术方案，所述骨架载体为PTCK303载体。
[0011]作为本发明的一种优选技术方案，所述发夹结构的间隔为PTCK303载体上的水稻内含子。
[0012]作为本发明的一种优选技术方案，正义链位于pTCK303载体中水稻内含子的上游，反义链位于水稻内含子的下游，整体构成了以水稻内含子为间隔的可形成发夹结构的双链RNA干扰载体。将基因片段插入到PTCK303的限制性内切酶KpnI/Spe I和BamH I/Sac I酶切识别位点之间，得到重组表达载体。
[0013]上述RNA干扰载体的用途，用于培育具有高结瘤固氮能力的植物。
[0014]上述RNA干扰载体的用途，使RNA干扰载体转化受体植物，沉默受体植物中的对应基因，使受体植物的根组织具有增强的结瘤固氮能力。
[0015]上述RNA干扰载体的用途，所述转化受体植物的方法为利用农杆菌介导的毛状根转化法；所述被沉默的基因为SEQ ID NO:1所示的基因。
[0016]上述RNA干扰载体的用途，所述受体植物为蝶形花科植物。
[0017]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:参看下述实施例3，利用本发明构建的RNA干扰载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为GmNNCl响应短期根瘤菌侵染的表达模式分析，在根瘤菌侵染早期的大豆根中，GmNNCl的表达受到显著抑制，该结果说明GmNNCl基因参与了大豆根系结瘤早期对根瘤菌的响应过程。
[0019]图2为GmNNCl响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析，在根瘤菌侵染的较长时间，即根瘤发生发育的过程中，GmNNCl基因的表达水平也出现了明显的下调，结果表明，GmNNCl参与调控大豆根系在根瘤菌侵染后的发生发育过程。
[0020]图3为下调表达GmNNCl后对大豆结瘤的表型分析，表明在完全相同的实验环境下，下调表达GmNNCl的转基`因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图3A和3B)，图3C为对转基因根系中GmNNCl的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmNNCl的表达是显著下调的。
【具体实施方式】
[0021]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0022]本发明构建的RNA干扰载体能够特异的沉默大豆中的GmNNCl基因。此基因属于AP2/ERF转录因子家族，其定位在大豆12号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，GmNNCl在大豆根中的表达受到根瘤菌侵染的抑制。通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析GmNNCl的下调表达可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmNNCl基因在大豆根瘤发育中具有重要的作用。
[0023]实施例1、GmNNCl基因早期响应根瘤菌侵染的表达模式分析
[0024]I)材料获取:实验所用材料为威廉姆斯82 (简称W82)。材料按照以下流程进行:大豆种子用70%的洒精灭菌30S，播种于低氮营养液浸泡的蛭石珍珠岩(3:1)混合基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000LUX，温度26°C，相对湿度为70%。播种后7天，每株接种慢生型根瘤菌USDAl 10菌液(OD600:0.08 )30ml，分别在接菌后O、1、3、6、12及24小时取大豆的根；
[0025]2)mRNA的分离:采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织50-100mg加入1.5mL离心管中然后加入ImlRNAVzol,裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体.室温放置5分钟；②加200 μ I氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12，000r/min，4°C离心IOmin ;③取500 μ I上清于另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置 IOmin, 12，000r/min,4°C离心 IOmin ;④加入 Iml75% 乙醇洗沉淀,8，000r/min,4°C离心5min，重复两次；室温风干IOmin左右，加20 μ I左右DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；
[0026]3)反转录为cDNA:将提取的mRNA用Promega公司的反转录酶AMV反转录为cDNA ；
[0027]4)实时荧光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex TagTM进行定量PCR分析；在20 μ I体系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10 μ 1、R0X Reference Dye II (50X) 0.4 μ 1、ddH206.8 μ I ;扩增程序为:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45cycles ；95°C 15s,60°C lmin，95°C 15s ;其中，正向引物为:CAATGGGCAGGAAAGAGC (SEQ ID NO:3);反向引物:ATGGCAGTCGATGGAAAGGT (SEQ IDNO:4)；
[0028]5)结果:参见附图1，在根瘤菌侵染早期的大豆根中，GmNNCl的表达受到显著抑制，该结果说明GmNNCl基因参与了大豆根系结瘤早期对根瘤菌的响应过程。
[0029]实施例2、GmNNCl在根瘤发育不同阶段的表达模式分析[0030]I)材料获取:实验所用材料为威廉姆斯82 (简称W82);材料按照以下流程进行:大豆种子用70%的洒精灭菌30S，播种于低氮营养液浸泡的蛭石珍珠岩(3:1)混合基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000LUX，温度26°C，相对湿度为70%。播种后7天，每株接种慢生型根瘤菌USDAl 10菌液(0D_=0.08) 30ml，分别在接菌后O、1、3、5、10天取大豆根及叶组织；
[0031]2)mRNA的分离:采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织50-100mg加入1.5mL离心管中然后加入Iml RNAVzoI,裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体.室温放置5分钟；②加200 μ I氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12，000r/min，4°C离心IOmin ;③取500 μ I上清于另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置 IOmin, 12，000r/min,4°C离心 IOmin ;④加入 Iml75% 乙醇洗沉淀,8，OOOr/min,4°C离心5min，重复两次；室温风干IOmin左右，加20 μ I左右DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；
[0032]3)反转录为cDNA:将提取的mRNA用Promega公司的反转录酶AMV反转录为cDNA ；
[0033]4)实时荧光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex TagTM进行定量PCR分析；在20 μ I体系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10 μ 1、R0X Reference Dye II (50X) 0.4 μ 1、ddH206.8 μ I ;扩增程序为:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45cycles ；95°C 15s,60°C lmin，95°C 15s ;其中，正向引物为:CAATGGGCAGGAAAGAGC (SEQ ID NO:3);反向引物:ATGGCAGTCGATGGAAAGGT (SEQ IDNO:4)
[0034]5)结果:参见附图2，在根瘤菌侵染的较长时间，即根瘤发生发育的过程中，GmNNCl基因的表达水平也出现了明显的下调，结果表明，GmNNCl参与调控大豆根系在根瘤菌侵染后的发生发育过程。
[0035]实施例3、利用RNA干扰载体下调GmNNCl基因，培育具有高结瘤固氮能力的转基因大豆。
[0036]I) Wilimas82大豆功能叶组织中总RNA的提取
[0037]研钵经180°C高温处理8小时或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAcd^经1%。DEPC水处理过夜后121°C高温湿热灭菌30分钟，枪头，离心管65°C烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA:
[0038](I)取50mg材料(叶片)用液氮研磨材料,加入Iml redzol试剂,充分匀楽;后,将匀浆液吸入1.5ml离心管，室温放置5min ；
[0039](2)加 200 μ I 氯仿，震荡混匀，静置 2-3min, 12000g4°C离心 IOmin ；
[0040](3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，-20°放置30min，12000g4°C离心IOmin ；
[0041](4) Iml75%乙醇洗沉淀，7500g离心5min,两次重复；室温风干IOmin左右，加20 μ I左右DEPC处理过的无菌水溶解沉淀。
[0042]2)反转录 PCR
[0043](I)在用DEPC处理过的的200 μ I PCR管中顺序加入5 μ L RNA和3 μ Loligo(dt) 18 ;4μ L dNTPs，65°C温育5min后迅速置于冰上冷却；
[0044](3)按以下顺序加入以下溶液:5XM_MLV buffer (invitrogen公司出品)4 μ I,RNaseinhibitorl μ I, M-MLVl μ 1,0.1M DTT2μ I ；
[0045](4)将上述反应液混匀，37°C反应1.5小时；
[0046](5)反应结束后，70°C处理IOmin灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链可用作PCR反应模板。
[0047]3)构建重组表达载体
[0048](I)GmNNCl基因片段的克隆
[0049]根据GmNNCl的编码序列(SEQ ID NO:1)，根据该序列设计引物对用于基因沉默(RNAi )的载体构建，根据载体PTCK303上的多克隆位点，引物末端分别引入Kpn I/Spe I和BamH I/Sac I酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmNNCl长为511bp的基因片段；引物序列为:
[0050]正向引物:GGGGTACCACTAGTGTCCAAGGAGGAATTCGTAC(SEQ ID NO: 5);反向引物:CGGGATCCGAGCTCGGATCAATGCCGATTCTCTC (SEQ ID NO:6)
[0051]扩增程序为:95°C5 分钟；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 个循环；72°C 70秒；PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化511bp左右的条带；回收的DNA片段与pMD19-T载体(Takara公司)连接，10μ I体系中加入Tvectorl μ I, solution I 5 μ I,回收片段4 μ I,混匀混合液，16°C连接过夜,热击法转入E.coli感受态细胞,过夜培养,挑阳性克隆,送交invitrogen公司测序。
[0052](2)重组表达载体的构建
[0053]a.提取含有正确测序的GmNNC1511bp基因序列的T载体质粒，用SpeI和SacI酶切获得正义的核苷酸序列，同一种PCR产物通过BamHI和KpnI酶切后获得反义的核苷酸序列；
[0054]b.将正义片段先克隆到PTCK303载体中水稻内含子的上游；
[0055]c.然后将反义片段克隆到已含有正义片段的重组PTCK303载体中水稻内含子的下游，最终构成了以水稻内含子为间隔的可形成发夹结构的dsRNA干扰载体；
[0056]d.将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5 α菌株，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmNNCl-RNAi。
[0057]4)农杆菌K599介导的毛状根转化:
[0058](I)农杆菌的转化
[0059]采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下:
[0060]a.取出冻存的200 μ I感受 态细胞，融化后加入5_10 μ I质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min ；
[0061]b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C (5min)融化后,加入800μ1 LB(无抗性)液体培养基，28°C低速振荡(150rpm)4-5h ；
[0062]c.1OOOOrpm, 30sec,去上清,加100 μ ILB液体培养基,悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素);
[0063]d.置28°C培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
[0064](2)农杆菌K599介导的毛状根转化
[0065]以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基(培养基配方:2 % 鹿糖，0.8 琼月旨粉(sigma), I XGAMBORG B-5BASAL (Phyto TechnologyLaboratories,货号:G398),pH调至5.7左右；)上萌发5天,待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min (OD600=0.6左右)后，将外植体转至1/2MS培养基(培养基配方:2%蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，0.5XMURA SHIGE &SK00G BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号:G519)，pH调至
5.7左右；)上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入无土基质(蛭石:珍珠岩=3:1)中，培养I周后接种根瘤菌USDAl 10 (OD600=0.08) 20ml/株，培养28天后收取根瘤，统计根瘤数量。
[0066]5.结果观察
[0067]结果如图3所示，表明在完全相同的实验环境下，下调表达GmNNCl的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图3A和3B)，图3C为对转基因根系中GmNNCl的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmNNCl的表达是显著下调的。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
【权利要求】
1.一种用于构建RNA干扰载体的基因片段，此基因片段用于构建RNA干扰载体的发夹结构，其特征在于:所述基因片段的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
2.权利要求1所述基因片段的互补核苷酸序列。
3.一种用于调控植物结瘤固氮能力的RNA干扰载体，包括骨架载体和发夹结构，其特征在于:所述发夹结构利用权利要求1或2所述的基因片段构建。
4.根据权利要求3所述的RNA干扰载体，其特征在于:所述骨架载体为PTCK303载体。
5.根据权利要求3所述的RNA干扰载体，其特征在于:所述发夹结构的间隔为PTCK303载体上的水稻内含子。
6.根据权利要求5所述的RNA干扰载体，其特征在于:正义链位于PTCK303载体中水稻内含子的上游，反义链位于水稻内含子的下游，整体构成了以水稻内含子为间隔的可形成发夹结构的双链RNA干扰载体。
7.权利要求3-6任一项所述的RNA干扰载体的用途，用于培育具有高结瘤固氮能力的植物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于:使RNA干扰载体转化受体植物，沉默受体植物中的对应基因，使受体植物的根组织具有增强的结瘤固氮能力。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于:所述转化受体植物的方法为利用农杆菌介导的毛状根转化法；所述被沉默的基因为SEQ ID NO:1所示的基因。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于:所述受体植物为蝶形花科植物。
【文档编号】C12N15/84GK103725683SQ201410003298
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】李霞, 王幼宁, 邹艳敏, 陈亮 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心