专利名称：包含疟原虫msp－1的c－末端片段的重组蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的来自感染哺乳动物尤其是人的疟原虫裂殖子形式中的主要表面蛋白的疫苗活性成分，一般称为MSP-1。
MSP-1已成为许多研究的主题。它在疟原虫类寄生虫尤其是恶生疟原虫的裂殖体阶段合成，并在疟原虫的肝阶段和细胞阶段(1,2,3,4)以裂殖子的一种主要表面成分的形式表达。因为该蛋白的显著特征并且在所有已知的疟原虫属的种类中保守，因此推测它可能是构建抗疟原虫疫苗(5、6)的一个候选物。
该蛋白的片段尤其是被观察到在例如寄生虫进入被感染宿主的红细胞的侵入期间形成的天然裂解产物也是如此。这样的裂解产物有分子量为42kDa的C-末端片段的(7、8)，其本身再次被裂解为具有通常表观分子量为33kDa的N-末端片段和具有通常表观分子量为19kDa的C-末端片段(9)，后者在借助于糖基磷脂酰肌醇(GPI)基团进行修饰后，通常仍保持固定在寄生虫膜上(10,11)。
还在红细胞内发育周期的早期阶段发现该片段(15,16)，从而作出这样的观察结论，即19kDa片段可起到仍然未知，但毫无疑问在再侵入过程中为必需的作用，这构成了过去形成的该蛋白可构成疫苗的尤其有效的耙标的假设基础。
应理解下面经常提及的来自疟原虫属的一些种类的p42和p19蛋白是指相应的该疟原虫的MSP-1蛋白的C-末端裂解产物，或广义地说指通过基因重组，或通过使用常规技术，如使用“AppliedSystem”合成仪的化学合成，或通过“Merrifield”型固相合成而获得的包含基本上相同的氨基酸序列的产物。为了方便，所提到的“重组p42”和“重组p19”指通过包含至少一个基因工程步骤的方法而获得的“p42”和“p19”。
面对获得大量恶性疟原虫寄生虫的困难以及不可能体外培养间日疟原虫，很清楚生产抗疟原虫疫苗的唯一方法是求助于使用重组蛋白或肽的方法。然而，由于其具有200kDa的很大的大小，生产全部MSP-1非常困难。这引导研究者研究其C-末端部分，它的(仍然未知的)作用可能更为重要。
已制备出并在猴中测试过的涉及恶性疟原虫MSP-1的C-末端部分的重组蛋白(12,40,41)为·大肠杆菌(40)中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p19；·大肠杆菌(12)中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p40；·与来自破伤风类毒素的多肽融合的并带有在酿酒酵母中产生的辅助T细胞表位的p19(12)；·在杆状病毒系统中产生的p42(41)。
包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p19蛋白，并混合有明矾或脂质体的组合物在六个接种的Aotus nancymal猴中没有一个显示出保护性效果(40)。
包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p42蛋白，并混合有弗氏完全佐剂的组合物当给予两类Aotus猴(A.nancymai和A.vociferans)时没有显示出保护性效果。酿酒酵母中产生的p19蛋白在两个A.nancymai种类的Aotus猴中显示出保护性效果(12)。而在两个A.vociferans种类的Aotus猴中没有保护性效果。
一些研究者(Chang等)还报导了在兔中使用在杆状病毒系统中产生的含有恶性疟原虫(18)中共有的氨基酸序列的重组p42蛋白进行的免疫试验。后边这些作者指出在兔中重组p42基本上以与完整重组MSP-1蛋白(gp195)相同的方式起作用。该p42蛋白结合弗氏完全佐剂已成为在易被恶性疟原虫感染的非人灵长类Aotus、狐猴(lemurinus grisemembra)中进行的疫苗接种试验中的主题(40)。结果表明3个动物中的2个被完全保护，第三个虽然显示出与对照类似的寄生虫血症，但是具有较长的潜伏期。然而推出如此诱导的抗寄生虫本身的抗体的保护性是冒险的。应该记住目前对于间日疟原虫和恶性疟原虫，在灵长类中没有非常满意的实验模型。对于恶性疟原虫和间日疟原虫开发出的松鼠猴模型，对恶性疟原虫开发的Aotus模型，是需要寄生虫种类适应并通常需要切除动物的脾以获得显著的寄生虫血症的人工系统。结果，来自该模型的疫苗接种对于人类仅具有有限的预测价值。
无论如何，用该重组蛋白可能获得的实际接种比例为多少仍是一个问题，记住下面报导的发现，即在来自疟原虫属相同种类的p42，尤其是在相应的p33中在许多情况下存在高可变区，这使得在用来自疟原虫属种类的p42接种的个体中所诱导的抗体抗相同种类其它个体感染的免疫保护性功效不确定(13)。
甚至可假设p42的N-末端部分的高多态性在通常观察到的对这类寄生虫的免疫逃避中起着明显的作用。
本发明的目的是生产可避免这些困难、其保护性效果在真正重要的实验模型或甚至直接在人中可验证的接种用重组蛋白。
更具体地说，本发明提供一种抗感染人的疟原虫型寄生虫的接种用组合物，它包含可能被或可能未被糖基化的重组蛋白作为活性成分，其必需的组成性多肽序列为·感染人的疟原虫型寄生虫的裂殖子形式表面蛋白1的19千道尔顿的C-末端部分(p19)的序列，其中所述C-末端片段在感染周期的进入人红细胞的穿透阶段末期通常仍然被锚定在寄生虫表面；·或仍能诱导在体内可抑制由于相应的寄生虫而导致的寄生虫血症的免疫应答的所述片段之部分的序列；·或与所述p19片段或该片段的所述部分免疫学等价的多肽的序列；和所述重组蛋白进一步包括在还原性介质中不稳定并优选组成被抗相应疟原虫所形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。
该构象表位的存在可在疫苗活性成分的保护性功效中起重要的作用。当它们在杆状病素系统中产生时，特别可在显示上面定义的其它特性的活性成分中发现它们。如果需要，下面将提到的“杆状病毒载体系统”是指由杆状病毒型载体本身和细胞系组成的整体，尤其是可被将要转化到这些细胞系的序列修饰的杆状病毒转化，并导致该转化序列表达的昆虫细胞系。在Longacre等(19)的文章中已描述了杆状病毒系统中这两种成分的优选实例。在下面的实施例中使用相同的系统。当然，不言而喻，杆状病毒和可被杆状病毒感染的细胞的变体可用来代替选择的那些。
尤其是，当它为非还原状态或为非不可逆还原的状态时，该重组蛋白被抗相应的疟原虫或抗类似的疟原虫所形成的人抗血清所识别，但当它被不可逆地还原时，则不被或仅在很小程度上被这些相同的抗血清所识别。
在还原介质，尤其是在存在β-巯基乙醇时，这些构象表位的不稳定特性可通过下面在实施例中描述的试验来证实。类似地，下面的实施例描述了可适用于用来获得本发明蛋白质的不可逆还原的实验条件。
从这点上来看，由Longacre等(14)生产的重组蛋白可用于该组合物。应该记住S.Longacre等成功地在含有编码间日疟原虫的p19的核苷酸序列的杆状病毒载体系统中，生产出来自间日疟原虫的MSP-1的重组p19，尤其是通过在多角体蛋白启动子的控制下，用包含编码下面定义的肽序列的序列的杆状病毒载体转染昆虫细胞〔草地夜蛾(sf9)细胞系〕的培养物，其中在所用的杆状病毒载体中序列以下面的顺序排列·多角体蛋白信号肽的35个碱基对的5′末端片段，其中用于启动该蛋白表达的甲硫氨酸密码子已突变(为ATT)；·编码对应于MSP-1N-末端部分的32个氨基酸肽的5′-末端核苷酸片段，包括MSP-1信号肽；·编码p19的核苷酸序列，或编码间日疟原虫的MSP-1蛋白的p42的序列，根据情况，以带有(被“锚定”形式)或失去(可溶形式)这些核苷酸序列的3′末端区的形式来提供这些序列，其最终C-末端表达产物被认为在将最终p19蛋白锚定在寄生虫膜上起着实质性作用；·2TAA终止密码子。
对于p42，来自MSP-1的C-末端区的序列从氨基酸Asp1325延至氨基酸Leu1726(锚定形式)或至氨基酸1705(可溶形式)，对于p19，序列从氨基酸Ile1602延至氨基酸Leu1726(锚定形式)或至氨基酸Ser1705(可溶形式)，应理解其起始和终止氨基酸已在上面描述的p42和p19的全部氨基酸序列是根据已测序的间日疟原虫的Belem分离物的基因(20)得来的。
使相同的载体系统中，使用编码猴疟原虫的p42和p19的核苷酸序列获得类似结果。对于猴疟原虫的兴趣是双重性的，它是感染恒河猴的与间日疟原虫极其接近的寄生种类。它还可感染人。而且，猴疟虫的天然宿主恒河猴和高帽猴(toque macaque)的可接近性也使得可检测来自猴疟原虫的MSP-1在天然系统中的保护功效。对于在人类中的反应，恒河猴被认为是最具代表性的一个种类。
尤其是，在使用高帽猴和两种重组多肽可溶性的p42和尤其是来自猴疟原虫的可溶性p19进行的接种试验中已获得了极好的结果，其中该两种重组多肽分别在杆状病毒系统中产生并在具有识别天然MSP-1蛋白的相应区域的单克隆抗体的亲和柱上纯化。进行下面观察在攻击感染后，仅用p19(三只猴子)及用p19和p42一起(三只猴子)免疫的六只猴子事实上均显示出几乎无效的免疫性。在用p42免疫的三只猴子中获得的结果是不显著的。它们中的两个如上所述，但是由于第三个显示出比在存在弗氏佐剂时用PBS缓冲液免疫的对照(3只猴子)或未免疫(3只猴子)时低的寄生虫血症，因此不甚清楚。
第二次攻击感染表明仅获得p19的猴子被保护了至少六个月。在该系统中(高帽猴，猴疟原虫)用p19及明矾进行的第二次接种试验显示出对于3只猴子中的2只猴子的明显保护。这是首次证实在存在明矾时MSP-1或其它重组抗原的保护性效果(42)。
使用恒河猴，用在杆状病毒系统、采用来自猴疟原虫的重组p19产生的重组多肽进行的特别有效的试验结果表明，各自包含来自其它疟原虫的重组p19的重组多肽必定以相同方式起作用。对于在人类中的疟原虫，它们比来自在“人工宿主”中用间日疟原虫或恶性疟原虫进行的试验的结果更有意义。
来自C-末端MSP-1部分(p19)的杆状病毒重组蛋白在天然系统中具有极其显著的抗疟原虫保护性效果，这构成了用于评价MSP-1对人的保护性效果的最具代表性的模型。
如果p19形式失去p42的N-末端部分的高可变区，则获得的保护性效果可选一步提高，它的效果在被接种的个体面临许多多态性的自然情况下可以是有害的。而且，p19看来拥有在p42中不存在的特定表位。
19kDa C-末端片段(其序列存在于疫苗活性成分中)在不存在通常位于相应的MSP-1蛋白中的p19序列的上游的任何多肽序列时，可以被限制在p19本身的序列。可是很显然，如果其存在不改变疫苗的活性成分的免疫学特性，则活性成分的必需组成性多肽序列还可包含属于p42自然裂解之前仍与相应的p19相连的33kDa(p33)N-末端片段的C-末端一侧的多肽序列。如从下面尤其是在实施例的描述中将看到的，疟原虫属的相同种类的各个株中p33的C-末端序列(参见图4中“区Ⅲ”肽序列的C-末端部分)也具有一定程度的同源性或基本保守的序列，例如在感染人的疟原虫的不同变种中程度为至少80％，这样它们基本上不改变活性成分的接种性质(图4中其序列相当于区Ⅳ)，尤其是使用从该图中得到的假设时；在p19和p33的区Ⅲ之间的推测的裂解位点位于特别保守区(LNVQTQ)中的亮氨酸和天冬酰胺残基之间。
当存在时，p33的C-末端多肽序列通常包含少于50个氨基酸残基，或甚至少于35，优选少于10个氨基酸残基。
相反，疫苗的活性成分的必需组成性多肽序列不需要包含编码p19的全部序列，当然前提是保持诱导抗寄生虫的抗体的能力。尤其是，“片段部分”的分子量为10-25kDa，尤其是10-15kDa。优选地，该多肽片段部分包含两个EGF(表皮生长因子)区的至少一个。
显然，技术人员可区分活性片段和不再有活性的那些片段，尤其通过实验产生含具有不同长度来源于p19的插入物的修饰载体，分别通过与适宜的限制性酶反应，或通过外切核酸酶与编码p19的片段接触不同时间，从编码p19的序列获得所述插入片段；可接着检测来自由相应修饰的载体转化的相应真核细胞，尤其是昆虫细胞中的这些插入物的表达产物产生保护性效果的能力，尤其是在下面实施例中描述的实验条件下。特别地，这些插入物的表达产物必须能抑制体内由相应的完整的寄生虫所引导的寄生虫血症。
因此，本发明包括所有接种用组合物，其中活性成分的必需组成性多肽序列由可诱导与由p19或上面定义的片段产生的等价细胞和/或体液免疫应答的肽构成，前提是在序列中加入、缺失一些氨基酸或被其它的氨基酸取代将不导致被修改的肽的抑制所述寄生虫血症的能力的大的改变-下文称为“免疫等价肽”。
p19片段自然也可以在N-末端侧或C-末端侧或借助于肽键与具有接种潜力的其它胞质蛋白片段相连(如来自间日疟原虫(29)的Duffy结合蛋白或来自恶性疟原虫的EBA-175(30)和(31)，它的一个区特异性地富含半胱氨酸)，前提是它抑制体内通常由相应寄生虫所诱导的寄生虫血症的能力不发生变化，除非被增大。
在p19的N-末端最后的上游，编码p19或其部分的片段还可包含例如所采用的信号肽的C-末端片段的不同肽序列，如MSP-1蛋白的信号肽片段。该序列优选包含少于50个氨基酸，例如10-40个氨基酸。
这些评述类似地适合于来自其他疟原虫尤其是恶性疟原虫的p19，恶性疟原虫是寄生虫中主要的种类，引起一种最严重疟疾形式。
然而，如果要获得能进行免疫保护性试验的可观数量，非常难于将上面总结的在杆状病毒系统中产生间日疟原虫或猴疟原虫的重组p19的方法不加改变地更换到的产生恶性疟原虫的重组p19中，而产生令人满意的产率。
本发明还提供在很大程度上克服这个问题的方法。这样在杆状病毒系统的表达载体中还可以使用替代天然核苷酸序列的编码恶性疟原虫p19的合成核苷酸序列来获得更高产率的恶性疟原虫p19和面临类似困难的其它疟原虫的p19，其中该合成核苷酸序列编码相同的p19，但其特征在于具有比天然核苷酸序列更高的G和C核苷酸比例。
换句话说，本发明是依据下面发现而得出的，即在杆状病毒系统中编码p19的核苷酸序列的表达明显与待表达核苷酸序列中的连续密码子与可被杆状病毒转化的宿主细胞的“细胞机器”的提高的相容性相关，这在通常包含在这些杆状病毒中并在被感染宿主细胞中表达的天然核苷酸序列中可观察到；因此天然恶性疟原虫核苷酸序列的表达不好或甚至完全没有表达；因此也可能解释了由Longacre等(14)观察到的在杆状病毒系统中间日疟原虫的p19的更为有效的表达，以及发明人已证明的来自相应的天然p19核苷酸序列的猴疟原虫的序列，因为它们比编码恶性疟原虫p19的天然核苷酸序列具有相对更大量的G和C核苷酸。
因此本发明更一般地提供一种重组杆状病毒类型的修饰载体，在包含于所述载体中并被所述载体转化的细胞识别的启动子的控制下，其包含编码可被杆状病毒系统利用的信号肽的第一核苷酸序列，其特征在于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，也受所述启动子的控制并编码肽序列·感染人类的非间日疟原虫的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道尔顿(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，该C-末端片段在进入红细胞的穿透阶段的末期通常仍然被锚定在寄生虫表面；·或该肽片段的一部分，前提是来自杆状病毒系统中的第二序列的表达产物仍能诱导可抑制体内由于相应寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应答；·或通过氨基酸的加入、缺失或取代但不导致其诱导类似于由所述p19肽片段或所述片段的所述部分产生的细胞和/或体液免疫应答能力发生大的改变的所述C-末端肽片段(p19)或所述肽片段部分的免疫等价肽；和如果需要，所述核苷酸序列具有构成它的全部核苷酸的40％-60％范围的G和C核苷酸含量，优选至少50％。可通过构建合成基因获得该序列，其中天然密码子已被变化为不改变它们翻译(保持肽序列)的富含G/C的密码子。
由合成DNA提供的核苷酸序列相对于天然基因序列或cDNA，可能具有至少10％改变的密码子，但仍保留了天然翻译序列的特征，即保持氨基酸序列。
不能排除G和C核苷酸含量可进一步增加，前提是由此导致产生的重组肽，或免疫等价肽的氨基酸序列的改变尤其是在下面将描述的试验中不导致形成的重组蛋白的免疫性质或保护性性质的丧失。
这些评述自然适用于感染人类的其它疟原虫，尤其是其中编码相应p19的天然核苷酸序列具有与杆状病毒系统中的有效表达相容不好的T和A核苷酸含量的那些。
编码所使用信号的序列可为通常与有关的疟原虫的天然序列相关的那些。如果可被识别作为杆状病毒系统中的信号时，则它还可来源于其它疟原虫，如间日疟原虫或猴疟原虫或其它生物。
在一种情况下，所述载体中的编码p19或其片段的序列失去将天然蛋白锚定在为其来源寄生虫上的序列，在这种情况下，表达蛋白通常被分泌至培养基中(可溶形式)。在这方面也很明显，即在本发明的条件下，产生的重组蛋白的可溶和锚定形式，尤其是当它们来自恶性疟原虫或猴疟虫或间日疟原虫时，趋于形成寡聚体，这个性质可能作为所形成重组蛋白的增加的免疫原性的原因。
本发明还涉及这样的载体，其中编码序列包含编码通常参与诱导将天然蛋白锚定在表达它的宿主的细胞膜上的p19的疏水性C′-末端的最后序列的最后的3′-末端序列。该3′-末端的最后序列对于编码可溶性p19部分的序列也可以是异源的，例如当它编码将产生的整个重组蛋白锚定在所采用的杆状病毒系统的宿主的细胞膜上的序列时，相当于来自间日疟原虫或来自其它生物的3′-末端序列。该锚定序列的一个实例为可在草地夜蛾(32)类型的昆虫细胞中表达的CD59抗原的GPI或CD14人蛋白(33)的GPI。
本发明自然还涉及重组蛋白，这些蛋白包括被抗相应的疟原虫所形成的人血清所识别的构象表位。
通常，本发明还涉及上述类型的任何重组蛋白，前提是它包含例如在杆状病毒系统中产生的那些构象表位，尤其是在还原介质中不稳定的那些。
本发明自然还涉及所述重组蛋白，不论它们为可溶形式或被具有锚定区，尤其是锚定至杆状病毒系统所采用的细胞宿主上的形式。
本发明还包括在所采用的杆状病毒系统中自发产生的或使用常规蛋白质寡聚体化方法随后产生的寡聚体。最常用的方法包括戊二醛法。然而，可使用任何用于桥接蛋白中各个胺与羧基官能团的常规系统。作为实例，可使用描述在欧洲专利申请EP-A-0602079中的任何方法。
术语“寡聚体”指包含2-50个单体单元的分子，每个单体单元包含如上所定义的能形成聚集物的p19或其片段。本发明还包括如上定义的p19或p19片段与用于生产疫苗的载体分子，如聚赖氨酸-丙氨酸，借助于共价或非共价键形成的任何结合产物。利用它们的接种用组合物也形成了本发明的一部分。
本发明还进一步涉及采用这些寡聚或结合重组蛋白，包括来自间日疟原虫的蛋白的疫苗组合物，其中这些评述也延伸至这些重组蛋白寡聚体。
本发明还包括这样的组合物，其中上面定义的重组蛋白与佐剂如明矾结合。包含允许它们锚定至产生它们的细胞的膜上的C-端末端区的重组蛋白可有利地与可形成适于生产疫苗的脂质体的脂质一起结合使用。非限制性地，可使用描述在J.Delattre等，INSERM,1993的题目为“Les liposomes aspects technologique biologique etpharmacologlque”〔脂质体工艺学、生物学和药理学状况〕的出版物中脂质。
无论对于适当的接种部分为同源或异源的锚定区，重组蛋白中的锚定区的存在促进亲细胞抗体的产生，尤其是在鼠中可具有特别高的保护性活性的IgG2a和IgG2b类型，这样可省去将这样构建的疫苗活性成分与用来产生脂质体形式的非脂质佐剂结合。这相当于一个很大的优点，因为在使其能被贮存和运输的条件下，脂质体可被冷冻干燥，而不需要一系列的冷贮存措施。
本发明的其它特征从下面对本发明重组蛋白及可产生它们的条件的实施例的描述中将变得很清楚。这些实施例不限制本发明的范围。
PfMSP1p19S(可溶)(来自恶性疟原虫的可溶性p19)的构建的描述重组构建物pfMSP1p19S包含对应于8个碱基对的前导序列和来自间日疟原虫MSP-1的头32个氨基酸即从Met1-Asp32(Belem分离物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，接着是GluPhe(由于连接两个片段的EcoR1位点)的DNA。这后面是
图1描述的编码恶性疟原虫MSP1p19从Asn1613-Ser1705的合成基因(Uganda-Palo Alto分离物；Chang等，1988，实验寄生虫学，67,1)。构建物由两个TAA终止密码子终止。该构建物产生的重组蛋白从昆虫细胞中分泌在培养物上清中。
为了比较，用相同方法在类似于用来产生上面p19的条件下产生重组构建物，但是使用由Chang等，实验寄生虫学67,1；1989描述的恶性疟原虫株(FUP)的相应DNA的直接拷贝构成的编码序列。天然的基因拷贝(从天冬酰胺1613-丝氨酸1705)通过PCR从天然基因形成。
图1A表明合成基因(Bac19)和“天然基因”(pF19)的序列。
可以看出编码来自恶性能疟原虫的p19的天然序列的93个密码子中的57个密码子发生了改变(它们中的55个的第三个核苷酸和其它2个密码子中的第一和第三个核苷酸)。在上述条件下，将新的密码子加入到5′末端以导入肽信号并导入用于克隆的EcoRⅠ位点，类似地加入在恶性疟原虫p19中不存在的两个终止密码子以获得表达终止信号。位于连续密码子上面的各个字母对应于各个连续的氨基酸。星号(*)表示终止密码子。垂直线表明在两个序列中相同的核苷酸。PfMSP1p19A构建(锚定的GPI)(恶性疟原虫的锚定p19)的描述PfMSP1p19A构建物具有上面的特征，只是合成序列(图1B)编码恶性疟原虫的MSP1p19(Uganda-palo alto分离物)从Asn1613到Ile1726，接着是两个TAA终止密码子。该构建物产生通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)类型的结构锚定在感染细胞的质膜上的重组蛋白。
图1C代表在切除信号序列之前的PfMSP1p19S重组蛋白序列。
图1D代表在切除信号序列之后的PfMSP1p19S重组蛋白序列。
图1C和1D中下划线的氨基酸来自于用来连接来源于间日疟原虫的MSP-1的N-末端部分的核苷酸序列(具信号肽)和恶性疟原虫的MSP-1p19的EcoRⅠ位点。
图2通过免疫印迹，在存在(还原)或不存在(非还原)B-巯基乙醇时，使用SDS-PAGE分析通过免疫亲和纯化的可溶性重组PfMSP1p19抗原。在2％SDS存在下，加热至95℃后，将样品上样至凝胶中。在这些条件下，仅有共价键(二硫桥)可以抵抗解聚作用。左手边的印迹用与天然p19的线性表位反应的单克隆抗体来显示。右手边的印迹用来自由于恶性疟原虫而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的13份人抗血清的混合物来显示。这些结果表明重组杆状病毒分子可重现其大部分被人抗血清识别的聚合物形式的构象表位。
图2B在非还原(NR)，仅在带电介质中还原(R)和被不可逆还原(IR)条件下，用来自间日疟原虫和猴疟原虫的纯化的重组MSP-1p19的人抗血清进行的免疫印迹分析本项工作是基于这样一种想法，即杆状病毒表达系统大量正确重现在体内存在于MSP-1的C-末端部分的构象表位。测定这种性质的最好方法(在不存在相当于p19的天然纯化的蛋白时，它可能是唯一可能的方法)是研究重组蛋白与暴露于疟原虫的个体抗血清的反应性，这反映出如人免疫系统“看见”的天然蛋白。
因此，在存在(还原的)或不存在(非还原的)DTT时，使用SDS-PAGE(15％)，通过免疫印迹分析免疫亲和纯化的可溶性重组PvMSP-1p19和PcMSP-1p19抗原。在2％SDS存在下，加热至95℃后，将样品上样至凝胶中。如下进行不可逆的还原将蛋白重新悬浮于0.2M Tris-HCl,pH8.4,100mM DTT,1.0％SDS中，并在70℃加热30分钟。在用水稀释后，加入丙烯酰胺至最终浓度为2M,37℃下，在氮气氛中在黑暗中将混合物保温1小时。用来自由于间日疟原虫而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的25份人抗血清的混合物来显示免疫印迹。V和C分别指来自间日疟原虫和猴疟原虫的MSP-1的蛋白。应该注意到不可逆还原的重组蛋白未显示出与人抗血清的反应性，而非不可逆还原的蛋白或未还原的蛋白显示出良好的反应性。(由于在其糖基化状态时与硝酸纤维素纸结合不好，所以未还原的Pv MSP-1p19有些弱)。这些结果表明人抗血清对杆状病毒MSP-1p19分子的识别大部分取决于(如果不是完全)对还原作用敏感的在该系统中被重制的构象表位。
图3-37℃下，在存在来自恶性疟原虫裂殖子并用等电聚集分离的蛋白级分时，将可溶性PvMSP1p42重组抗原(Longacre等，1994，同上)保温5小时。接着在存在(还原的)或不存在(未还原的)β-巯基乙醇时，通过免疫印迹分析样品。将等电聚焦级分5-12和在存在(Tex)或不存在(T)去污剂时制备的两个全裂殖子提取物进行分析。用对间日疟原虫的MSP1p42和MSP1p19特异性的单克隆抗体显示免疫印迹，结果表明在可用去污剂提取的恶性疟原虫裂殖子中具有蛋白水解活性。在一些级分中的对p42的消化看来导致消化产物(p19)的聚合作用；这种聚合作用可能与二硫桥的形成相关，因为在存在β-巯基乙醇时，高分子量形式消失而有利于分子量为约19kDa的分子(Tex-R)。因此在这些实验中观察到的p19的聚合作用可以是该分子在体内的固有性质。
图3B:p42和p19抗原对间日疟原虫抗-MSP-1人应答的不同分布使用如下的ELISA抑制方法，比较对间日疟原虫具有获得性免疫的个体的抗血清对间日疟原虫MSP-1p42和p19抗原的识别。将来自由于间日疟原虫而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的25份人抗清血的混合物稀释至1∶5000，室温下，单独地或在存在1mM纯化的间日疟原虫重组p42或p19时保温4小时。将混合物转移至已在4℃下用500ng/ml纯化的吸附重组p42或p19包被18小时的微量滴定孔中，并在室温下保温30分钟。在用含0.1％Tween 20的PBS洗涤后，加入与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG,37℃下，将混合物保温1小时。通过在492nm下读取光密度来获得酶活性。根据不存在竞争性抗原时对微量滴定平板上覆盖抗原的100％抗血清活性的值来计算抑制百分数。使用Statview程序来计算统计数据。每一个柱代表根据4-12次测定的竞争/吸附抗原对的平均抑制百分数；竖线相当于95％置信区间。星号(*)指在存在衣霉素时产生的抗原，因此没有N-糖基化。这些测定的重要参数为对抗血清在ELISA曲线敏感区域内的1∶5000稀释，以及包括低亲和性表位竞争的1mM竞争性抗原浓度。因此这些数据反映出两个被比较抗原之间的最大相似性。结果表明大多数(如果不是所有)被人抗血清识别的p42表位存在于p19中，因为在存在后者时，人抗血清抗p42的反应性的抑抑制与被p42抗原本身的抑制一样多。然而，相反，由于人抗血清抗p19的反应性被p42的抑制比被p19本身的抑制小得多，因此约20％由人抗血清识别的p19表位不存在于p42或在p42上不可接近。仅在将p42裂解为p19和p33后者才形成或释放该p19的特异性表位。这些结果不受糖基化作用的影响表明这种作用确实是由于p19和p42的肽成分之间的差异而不是由于糖基化作用的差异。这些结果预示这样一个事实，即p19具有与p42截然不同的免疫性质。PcMSP1p19S(可溶性)构建物(猴疟虫的可溶性p19)的描述从猴疟原虫株(P.cynomolgi ceylonesis)(22-23)的克隆获得用于上面构建物的DNA。该虫株通过其天然宿主(Macaca sinica)连续传代和借助于蚊子的循环传播(27)而得以保持。
处于成熟裂殖体阶段的血液寄生虫从当寄生虫血症达到5％水平时的被感染的猴子中获得。接着使用在(25)中描述的方法对它们进行纯化。按在(26)中所描述的提取DNA。
使用图4中划线的来自间日疟原虫的寡核苷酸，借助于PCR反应产生1200个碱基对的片段。5′寡核苷酸包含EcoRⅠ限制性位点，3′寡核苷酸包含两个合成TAA终止密码子，其后是BgⅢ位点。借助于这些EcoRⅠ和BgⅢ位点以及连接反应将该片段导入已包含间日疟原虫MSP-1蛋白信号序列的pVLSV200质粒(19)中。该新质粒(pVLSV200C42)被用来分析DNA序列。
比较猴疟原虫和相应的间日疟原虫的序列。黑色箭头表示推测的第一和第二个裂解位点。通过从恶性疟原虫的已知位点类推来确定它们(27,28)。竖线和水平箭头定位所研究约4个区域的界限。区域4相当于编码猴疟原虫p19的序列、糖基化位点加框，保守的半胱氨酸下划线。图4的下面部分表明间日疟原虫和猴疟原虫的两个分离物之间的相同的百分数。
重组构建物PcMSP1p19S包含相当于如下的DNA前导序列的8个碱基对和间日疟原虫的MSP-1的从Met1至Asp32头32个氨基酸(Belem分离物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，其后为连接这两个片段的GluPhe(由于EcoRⅠ位点)，这后面是编码猴疟原虫MSP1p19的从Lys276至Ser380(Ceylon株)的序列。该构建物由两个终止密码子终止，该构建物产生分泌在被感染细胞的培养物上清中的重组蛋白。通过使用特异性识别恶性疟原虫p19的单克隆抗体的免疫亲和层析纯化重组PfMSP1p19蛋白通过使用详细描述在Pharmacia采用的方法中的标准方法，将70mg单克隆抗体(从G17.12杂交瘤获得，该杂交瘤于1997年2月14日保藏在CNCM〔国家微生物培养物保藏中心〕(法国巴黎)，其保藏登记号为I-1846；该G17.12杂交瘤从产生识别恶性疟原虫p19的IgG 2a/k的X63Ag8 653骨髓瘤构建)结合至3g活化的CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)来制备层析树脂。4℃下，将包含可溶性PfMSP1p19的培养上清与层析树脂分批保温16小时。将柱用20体积的含0.05％ NP4O,0.5M NaCl的PBS洗涤一次；用5体积的PBS洗涤一次并用2体积10mM磷酸钠(pH6.8)洗涤一次。用30ml 0.2M甘氨酸(pH2.2)进行洗脱。洗脱液用1M磷酸钠(pH7.7)中和，接着通过超滤和对PBS透析将其浓缩。为了纯化被锚定的PfMSP1p19，所有洗涤和洗脱溶液均包含0.1％的3-(二甲基-十二烷基铵基)丙烷磺酸盐(Fluka)。在松鼠猴Saimiri sciureus中的重组间日疟原虫(p42和p19)MSP1接种试验。
该接种试验在雄性脾未被切除的2-3岁的松鼠猴(Saimirisciureus boliviensis)中进行。用约50-100μg经免疫亲和纯化的每种重组可溶性PvMSP1p42和p19(19)以3周的间隔对3只猴肌肉内注射3次。如下使用完全和不完全弗氏佐剂第1次注射1∶1FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；第3次注射FIA。将这些佐剂组合物与抗原的PBS溶液以1∶1混合。使用相同方法使五只对照猴子接受在大肠杆菌中产生的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)抗原。在最后感染2.5周后，通过注射2×108被适应的间日疟原虫种类(Belem)感染的红血细胞来进行攻击感染。通过检查被Giemsa染色的涂片来每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。
图5中的曲线表明以作为感染后时间(天)的函数的每微升血中的被寄生的红血细胞数目(纵坐标，对数比例)测定的寄生虫血症中的差异。曲线A相当于在三只接种猴子中观察到的平均值；曲线B相当于在五只对照猴子中的平均值。
对图的研究表明接种的效果是极大地降低了寄生虫血症。在高帽猴Macaca sinica中的重组猴皮疟原虫(p42和p19)MSP1接种试验如下使用15只捕获的猴子(1)3只动物被注射100μg可溶性PcMSP1p42；(2)3只动物被注射35μg(第一次注射)或50μg(第二次和第三次注射)可溶性PcMSP1p42；(3)三只动物被注射PcMSP1p42和p19的混合物；(4)三只动物被注射佐剂加PBS；(5)三只动物未被注射。在上述方案中使用了弗氏完全和不完全佐剂。以4周的间隔进行肌肉内注射。在最后注射4周后，通过注射2×105被猴疟原虫感染的红血细胞来进行攻击感染。通过用Giemsa检测寄生虫血症来每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。仅在计数400个涂片范围后才将寄生虫血症划分为阴性。寄生虫血症以被寄生的红血细胞的百分数来表示。
图6A-6G表明所获得的结果，其中每一个均显示作为感染后的时间函数(沿横坐标，天数)的在攻击动物中观察到的寄生虫血症(沿纵坐标，以对数比例的被寄生细血细胞的百分数表示)。
结果涉及·在图6A中；未接种的对照动物；·图6B涉及接受了包含弗氏佐剂的盐溶液的动物；·图6C是为了突出从对动物施用弗氏佐剂产生的相对结果(变化显然是不明显的)，将图6A和6B进行叠加；·图6D提供在用p42接种结束时所获得的结果；·图6E涉及仅用p19接种的动物；·最后，图6F涉及用p19和p42的混合物接种的动物。
p42当然诱导一定水平的保护。然而，如图6E和6F所示，由本发明的重组p19产生的保护相对更好。
可提出这样的假设，即提高的保护作用来自p42的第二次裂解，伴随裂解的是释放游离的半胱氨酸，结果形成分子内桥而导致在三种试验的重组蛋白中极具特征的p19多聚体。
用来产生图(6A-6F)的数据在图6G中给出。
猴疟原虫的高帽恒河猴接种试验，仅用p19接种的猴的第二次攻击感染和对照(图8)
6个月后，未进行其它接种，接受了p19 MSP-1及FCA/FIA的3只猴(图6E)和接受了包含弗氏佐剂的盐溶液的3只恒河猴(图6B)和2只新的未受影响的未被接种的猴子通过注射1×106个感染猴疟原虫的红血细胞接受新的攻击感染。通过检查Giemsa染色每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。仅在计数400个染色范围后才将寄生虫血症划分为阴性。寄生虫血症以被寄生的红血细胞的百分数表示(在图8D中提供了用来得出图8A-C的数据)。各组中除开1只动物有1天显示0.008％寄生虫血症外，早在6个月前经历了攻击感染的6只免疫动物没有可检测的寄生虫血症(图8A和8B)。两个未受影响的对照显示具有最大为0.8％并持续21天的通常的寄生虫血症(图8C)。因此，尽管在第一次攻击感染后不存在寄生虫血症或非常轻微，接种了MSP-1p19的3只动物比在第一次攻击感染后显示出全部通常感染的3只对照晚6个月还受保护。这些结果提示p19的保护期为至少6个月。在猴疟原虫高帽恒河猴系统中用p19和明矾进行的接种试验(图9)使用完全(FCA)或不完全(FIA)弗氏佐剂获得前面的阳性保护结果。然而，目前唯一在人中被允许的佐剂为明矾。出于这个原因，我们在存在明矾作为佐剂时，在高帽恒河猴中用猴疟原虫MSP-1p19进行接种试验。如下使用6只捕获的恒河猴(1)3只动物被注射4个剂量的50mg重组猴疟原虫MSP-1p19和20mg明矾；(2)3只动物被4次注射生理盐水和10mg明矾。以4周的间隔进行肌肉注射。在最后注射4周后，通过注射2×105个被猴疟原虫感染的红血细胞进行攻击感染。通过检查Giemsa染色涂片每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。仅在计数400个涂片范围之后才将寄生虫血症划分为阴性。以被寄生的红血细胞的百分数来表示寄生虫血症。该实验结果如下。用重组p19和明矾免疫的3只恒河猴中的2只攻击感染后在感染期总寄生虫血症(图9A和9B)比用生理盐水和明矾(图9D)免疫的3只对照恒河猴少约30倍。用p19免疫的第三只恒河猴(图9C)与对照没有明显不同。对于描述在图9中的在高帽恒河猴macaca sinica中使用猴疟原虫p19的接种试验，用来产生图(9A-9D)的数据提供在(图9E)中。虽然结果没有以前的结果惊人(图6、8)，但这是首次观察到重组MSP-1和明矾的显著的保护作用。图10在松鼠猴中用重组恶性疟原虫p19进行的接种试验。
如下使用囚禁中饲养的20只约3岁Saimiri sciureus guyanensis(松鼠猴)如下在存在弗氏佐剂时，4只动物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第二次注射1∶4FCA/FIA；第三次注射FIA。接着以1∶1将这些佐剂组合物与抗原的PBS溶液混合；(2)2只对照动物接受如(1)所描述的弗氏佐剂和仅PBS；(3)在存在10mg明矾时，4只动物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19(Alu-Gel-S,Serva)；(4)2只对照动物接受10mg明矾和仅PBS；(5)4只动物被注射约50-100mg如下被重构到脂质体中的GPI锚定的PfMSP-1p19真空干燥300mmol胆固醇和300mmol磷脂酰胆碱，并被重新悬浮在含1.4mg PfMSP-1p19,GPI的330mM.N-辛基葡糖苷的PBS溶液中。用吸附剂Bio-Beads SM-2(Bio-Rad)将溶液对PBS渗析，通过离心浓缩形成的脂质体，并重新悬浮在PBS中。用保存在4℃的新制脂质体进行第1次注射，用已冷冻贮存的脂质体进行第2和第3次注射；(6)2只动物被注射不存在如(5)中描述的p19,GPI的以相同方式制备的对照脂质体；(7)2只动物被注射了生理盐水。以4周的间隔进行三次肌肉内注射。通过注射1×106个被恶性疟原虫感染的红血细胞来进行攻击感染。通过检查Giemsa染色涂片每天确定所有动物中的寄生虫血症评价保护作用。寄生虫血症以被寄生的红血细胞的百分数来表示。该接种试验的结果示于图10,A-G中。
在攻击感染后，用弗氏佐剂或脂质体中的p19免疫的组被证明具有与对照组类似的寄生虫血症(一只被接种弗氏佐剂中p19的动物(29号)由于与接种无关的原因(心脏疾病)，在攻击感染后几天死亡)。在这两组中抗原的施用不规(弗氏佐剂的不良乳化，被冻凝的脂质体)未能使这些结果的重要性被完全评价。在明矾组中，2只动物在感染期间显示的全部寄生虫血症比对照少约4倍，1只动物比对照少约3倍，1只动物类似于对照。由于对照的可变性，可能由于用于攻击感染的寄生虫株未很好地适应仅仅最近在Cayenme开发的非脾切除的松鼠猴模型，解释该实验有些困难。然而，虽然不太完美，但使用明矾的实际效果却是令人鼓舞的，因为我们的抗原看来是目前与明矾结合已显出一定效果的唯一的重组恶性疟原虫MSP-1形式。在松鼠猴中用重组恶性疟原虫p19进行的接种试验(如图10的相同试验)如下以4周的间隔将囚禁饲养的猴子经肌肉内注射两次1mL接种物(1)在存在如下弗氏佐剂时，4只动物被注射50μg可溶性PfMSP1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；接着以1∶1与抗原的PBS溶液混合；(2)在存在10mg明矾时，4只动物被注射50μg可溶性PfMSP1p19；(3)4只动物被注射约50μg GPI锚定的重构在由1∶1摩尔胆固醇和磷脂酰胆碱组成的脂质体中的PfMSP1p19。在第二次注射后，将动物饲养17天。
将来自由于恶性疟原虫(成熟形式占大多数)导致带有30％寄生虫血疟的松鼠猴的红细胞用PBS洗涤，在存在2％SDS和2％二硫苏糖醇时，将残留物稀释8倍，在上样至7.5％(分离胶)和4％(浓缩胶)聚丙烯酰胺凝胶之前加热至95°。在转移至硝酸纤维素上之后，如下使用抗血清进行免疫印迹分析(1)将用弗氏佐剂中可溶性PfMSP1p19接种的4只猴子的抗血清收集物稀释20倍；(2)将用明矾佐剂中可溶性PfMSP1p19接种的4只猴子的抗血清收集物稀释20倍；(3)将用脂质体中的锚定PfMSP1p19接种的4只猴子的抗血清收集物稀释20倍；(4)50mg/ml与PfMSP1p19的线性表位反应的单克隆抗体；(5)将来自约20只重复感染恶性疟原虫并变得可不受任何后继恶性疟原虫感染的猴子SH190抗血清收集物稀释500倍；(6)将未受影响的猴子(从未暴露在恶性疟原虫中)的抗血清收集物稀释20倍。
结果表明用PfMSP1p19接种的猴子的3份抗血清收集物强烈及特异性地与非常高分子量的复合物(扩散在浓缩胶中)反应，这些复合物存在于含更多成熟形式的寄生虫提取物中。这些结果支持了这样的假设，即在体内存在PfMSP1p19的特异性聚集物，尤其是其寡聚体形式，其包含被重现于在杆状病毒系统中合成的重组pfMSP1p19分子中的表位。
图7也说明这些结果。它显示在凝胶上产生的免疫印迹。头三个凝胶泳道说明猴子对注射p19的体内应答〔(1)与弗氏佐剂，(2)与明矾，(3)以脂质体形式〕，尤其是高分子量复合物的存在支持了在体内成熟阶段(当p42被裂解为p19和p33)特有的寡聚体形式的p19聚集的假设。
该接种试验还包括与前面注射相同的第三次注射。使用弗氏佐剂的注射仅包含FIA。
对于每组有两只动物对照，即注射了PBS和弗氏佐剂的2只对照动物注射PBS和明矾的2只对照动物；注射了脂质体而没有蛋白的2只对照动物；和注射了PBS而没有佐剂的2只对照动物。如上面描述的来评价保护作用。
图7B该图的数据来自松鼠猴/恶性疟原虫接种试验(下面的图10)。数目相当于图10中提到的各只猴子。用于该图中的技术和方法与图7中的一样，只是在三次注射后攻击感染那天检测各只猴子的每份抗血清，并将SHI抗血清以1∶250稀释。结果表明用p19和明矾接种的4只猴子的抗血清强烈并特异性地与非常高分子量的复合物反应，而用p19和弗氏佐剂或脂质体接种的其它组的猴子仅显示出与这些复合物很小的反应性。由于用p19和明矾接种的猴子也是被保护得最好的，因此与高分子量复合物的反应性看来指示了保护性效果，尽管该组中一只猴子相对于对照组没有被保护且另一只仅被部分保护。
当然本发明还涉及其它应用，如在下面根据一些实例描述的那些，虽然这些本质上是非限制性的。治疗用途该重组分子PfMSP1p19可被用来产生特异性抗体，该抗体可通过被动转移用作由于恶性疟原虫导致的具有死亡危险的严重疟疾的治疗剂。诊断用途来自杆状病毒的重组分子PvMSP1p42、PvMSP1p19和PfMSP1p19可以并且已被用来产生特异性的鼠单克隆抗体，这些抗体与来自其它种的如兔或山羊的多克隆抗-MSP1p19抗血清结合可形成疟疾的半定量诊断试验的基础，用于区别可致死的由恶性疟原虫导致的疟疾和通常为非致命的由间日疟原虫导致的疟疾。该试验的原理是捕获和定量血液中包含p19部分的任何MSP-1分子。
此处，MSP1p19分子的优点如下(ⅰ)它在相同种中极其保守，而在不同种之间具有足够的不同，使得易于产生种类特异的反应物。在来自PfMSP1p19和PvMSP1p19的抗体之间未观察到交叉反应；(ⅱ)虽然不准确地知道，但MSP1p19的作用看来是足够地重要，因为该分子不会显著变化或被删除而对寄生虫无致死效果。(ⅲ)它是在所有裂殖子中发现的主要抗原，因此原则上它必定在甚至是低的寄生虫血症时可被检测并与寄生虫血症成比例。(ⅳ)由于来自杆状病毒的重组MSP1p19分子看来重现了MSP1p19天然结构的大部分，因此针对该蛋白产生的抗体将很好地适应于诊断用途。
1996年2月1日根据布达佩斯条约Rule 6.1条，下面指出的微生物已以下面的登记号被保藏指称代号 登记号PvMSP1p19A1-1659PvMSP1p19S1-1660
PfMSP1p19A1-1661PfMSP1p19S1-1662PcMSP1p19S1-1663本发明还涉及这些抗体尤其是固定在固体载体上(例如用于亲和层析)的抗体用于纯化起初包含在混合物中的p19类肽的用途。
纯化指将该混合物与抗体接触，解离抗原-抗体复合物并回收纯化的p19类型的肽。
本发明还涉及疫苗组合物，其也包括蛋白或片段的混合物，尤其是这类混合物·恶性疟原虫p19和间日疟原虫p19；·恶性疟原虫p19和恶性疟原虫p42，如果需要，后者失去其最可变的区域；·间日疟原虫p19和间日疟原虫p42，如果需要，后者失去其最可变的区域；·恶性疟原虫p19和恶性疟原虫p42，如果需要，后者失去其最可变的区域，和间日疟原虫p19和间日疟原虫p42，如果需要，后者失去其最可变的区域。
在这种情况中，最可变的区域被定义为区域Ⅰ或区域Ⅱ及区域Ⅲ的全部或一部分，优选除去的区域Ⅲ的部分是与区域Ⅱ并列的部分(保守部份位于p33 C-末端这一侧，与p19靠近)。区域Ⅱ和Ⅲ示于图4中。
本发明不局限于生产人疫苗。它还可适用于使用来自感染哺乳动物的寄生虫的相应蛋白或抗原及在相同条件下的产物生产兽医疫苗组合物。已知相同类型的感染巴贝虫病还出现在牛、猪和马中。巴贝虫属种类的一种抗原与MSP-1的蛋白部分有高度的构象一致性(尤其是在两个EFG样和富含半胱氨酸区)和功能一致性〔(36),(37)和(38)〕。
已描述了使用抗这些寄生虫的可溶性抗原的兽医疫苗(39)。
不言而喻用于这些混合物中的p19在分别考虑时也可如前面所述地进行修饰。
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本发明还涉及分泌选择性识别感染人的非间日疟原虫的疟原虫属类寄生虫的裂殖子形式中的MSP-1蛋白的p19而不识别间日疟原虫的特异性抗体的杂交瘤。
尤其是，这些杂交瘤分泌不识别间日疟原虫p19并特异性识别恶性疟原虫p19的单克隆抗体。
本发明还涉及一种杂交瘤，其特征在于它产生特异性识别间日疟原虫的p19和猴疟原虫的p19的特异性抗体。F10-3杂交瘤从产生识别间日疟原虫p42糖蛋白的IgG 2b/k的X63 Ag8653骨髓瘤构建。
权利要求
1．一种重组蛋白，其必要组成性多肽序列为·感染哺乳动物尤其是人的非间日疟原虫的疟原虫属类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)C-末端片段的序列，该C-末端片段通常在感染周期中其进入人红细胞的穿透阶段末期仍然锚定在寄生虫表面；·或仍能诱导可在体内抑制由于相应的寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应答的该片段的一部分的序列；·或能诱导与由所述p19片段或该片段的所述部分产生的等价的细胞和/或体液免疫应答的肽的序列；和所述重组蛋白可能进一步包含在还原介质中不稳定的并组成对抗相应疟原虫而形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。
2．根据权利要求1的重组蛋白，其特征在于当它为非还原状态或非不可逆还原状态时，它可被抗相应疟原虫或抗同源的疟原虫而形成的人抗血清识别，但当它为不可逆还原状态时，它不能被这些相同的抗血清识别或仅在很小程度上被识别。
3．根据权利要求1或2的蛋白，其特征在于它抑制人抗血清与在相同条件下产生的相应的p42以及p42本身的免疫反应性，而p42仅可部分抑制所述人抗血清对p19的反应性。
4．根据权利要求1-3任一项的重组蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该侧与p19相连，所述p33的最后C-末端多肽序列当存在时包含少于50个氨基酸残基。
5．根据权利要求1-3任-项的重组蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该侧与p19相连，所述p33的最后C-末端多肽序列当存在时包含少于10个氨基酸残基。
6．根据权利要求1-3任一项权利要求的重组蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该侧与p19相连，所述p33的最后C-末端多肽序列当存在时限于保留感染人的疟原虫如恶性疟原虫或间日疟原虫中的相当程度的保守性的序列。
7．根据权利要求1-6任一项的重组蛋白，其特征在于p19片段的所述部分包含通常包含在该p19中的两个EGF区域中的至少一个。
8．根据权利要求1-7任一项的重组蛋白，其特征在于所述p19片段或p19片段的所述部分的分子量为10-25kDa，尤其是10-15kDa。
9．根据权利要求1-8任一项的重组蛋白，其特征在于它还包含使p19片段能锚定在表达所述重组蛋白的宿主细胞上的糖基磷脂酰肌醇(GPI)基团，其中宿主细胞尤其是真核细胞，优选可被杆状病毒感染的昆虫细胞。
10．根据权利要求1-8任一项的重组蛋白，其特征在于它失去了极其疏水的C-末端部分，该C-末端部分参与诱导将所述重组蛋白锚定至表达它的宿主的细胞膜上，其中宿主细胞尤其是真核细胞，优选为可被杆状病毒感染的昆虫细胞。
11．根据权利要求10的重组蛋白，其特征在于它为水溶性的。
12．根据权利要求1-11任一项的重组蛋白，其特征在于它包含恶性疟原虫的MSP-1蛋白的p19序列或相应片段的所述部分。
13．根据权利要求1-12任一项的重组蛋白，其特征在于它包含猴疟原虫的MSP-1蛋白的p19序列或相应片段的所述部分。
14．根据权利要求1-13任一项的重组蛋白的寡聚体。
15．根据权利要求14的寡聚体，其特征在于它包含如权利要求1-13任一项中定义的重组蛋白的所述多肽序列的2-50个单体单位。
16．根据权利要求1-14任一项的重组蛋白，其特征在于它与用于生产疫苗的载体分子结合。
17．一种抗感染人的疟原虫类寄生虫的接种组合物，它包含作为活性成分的重组蛋白，该重组蛋白的必要组成性多肽序列为·感染人的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的进入人红细胞的穿透阶段的末期，所述C-末端片段通常仍锚定在寄生虫表面；·或任能诱导可在体内抑制由于相应的寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应答的该片段的一部分的序列；·或能诱导与由所述p19片段或该片段所述部分产生的等价的细胞和/或体液免疫应答的肽的序列；和所述重组蛋白进一步包含在还原介质中不稳定，并组成由抗相应疟原虫而形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。
18．根据权利要求17的接种组合物，其特征在于其活性成分由根据权利要求2-13任一项或16的重组蛋白，或根据权利要求14或权利要求15的寡聚体组成。
19．一种抗感染人的疟原虫类寄生虫的接种组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求17或权利要求18的重组蛋白的寡聚体。
20．一种抗体，其特异性识别感染人的非间日疟原虫的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的MSP-1蛋白的p19，并且它不识别间日疟原虫。
21．根据权利要求20的抗体，其特征在于它为单克隆的。
22．根据权利要求20的抗体，其特征在于它为单克隆抗体，并且在于它特异性识别恶性疟原虫的p19。
23．根据权利要求20的单克隆抗体，其特征在于它特异性识别间日疟原虫的p19。
24．一种区分由间日疟原虫导致的寄生虫感染和由其它疟原虫导致的寄生虫感染的区别诊断方法，其特征在于将被疟原虫感染的生物样品与根据权利要求23的抗体和与根据权利要求21或权利要求22的抗体接触，并依情况检测免疫反应的产生或未产生。
25．一种重组杆状病毒类型的修饰载体，其在包含于所述载体中并被所述载体转化的细胞识别的启动子的控制下，包含编码可与杆状病毒系统中的表达相容的信号肽的第一核苷酸序列，其特征在于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，也受所述启动子的控制并编码肽序列·感染人类的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道尔顿(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，该C-末端片段在进入红细胞的穿透阶段的末期通常仍然被锚定在寄生虫表面；·或该肽片段的一部分，前提是第二序列在杆状病毒系统中的表达产物仍能诱导可抑制体内由于相应寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应答；·或能诱导等价于由所述p19肽片段或所述肽片段部分产生的应答的细胞和/或体液免疫应答的肽；和所述核苷酸序列具有构成它的全部核苷酸的40％-60％范围的G和C含量，优选至少50％。
26．根据权利要求25的修饰载体，其特征在于所述第二个多肽序列与在权利要求2-13任一项中定义的一致。
27．根据权利要求2S的修饰载体，其特征在于第二个核苷酸序列为合成序列。
28．根据权利要求25-27任一项的修饰载体，其特征在于第一核苷酸序列编码来自间日疟原虫并通常与疟原虫MSP-1蛋白相连的信号肽。
29．根据权利要求25-28任一项的修饰载体，其特征在于第二核苷酸在3′末端失去疏水性的C-末端的最后序列，该序列参与诱导将所述重组蛋白锚定至表达它的宿主的细胞膜上，尤其是可被杆状病毒感染的昆虫细胞。
30．根据权利要求25-29任一项的修饰载体，其特征在于它由修饰的杆状病毒组成。
31．一种生物体，尤其是Sf9型昆虫细胞，其可被并且已被根据权利要求25-29任一项的修饰载体转染。
32．含有第一核苷酸序列的合成DNA，其中第一核苷酸序列的至少一部分编码下列肽序列·恶性疟原虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的其进入人红细胞的穿透阶段的末期，所述C-末端片段通常锚定在寄生虫表面；·或该肽片段的一部分的序列，前提是所述DNA在杆状病毒系统中的表达产物仍能诱导在体内可抑制由于相应寄生虫而导致的寄生虫血疟的免疫反应；·或能诱导与由所述p19肽片段或该片段的所述部分产生的等价的细胞和/或体液类型的免疫应答的肽的序列；和所述核苷酸序列还具有占组成所述合成DNA的核苷酸总量的40-60％，优选至少50％的G和C核苷酸含量。
33．根据权利要求32的合成DNA序列，其特征在于其第一核苷酸序列在其3′末端失去了编码疏水C-末端最后区域的序列，该疏水性C-末端最后的区域通常参与诱导将p19蛋白锚定至表达它的宿主的细胞膜上，尤其是可被杆状病毒转化的昆虫细胞。
34．根据权利要求32或权利要求33的合成DNA序列，其特征在于第一核苷酸序列之前是编码通常与疟原虫MSP-1蛋白相连的信号肽的信号核苷酸序列，其与主要序列同源或异源。
35．根据权利要求34的合成DNA序列，其特征在于信号序列来自间日疟原虫。
36．根据权利要求32-35任一项的合成DNA，其特征在于所述第一核苷酸序列包括编码多肽细胞膜锚定区的3′-末端序列，所述锚定区将表达的重组蛋白固定至用含所述合成DNA的载体转化的宿主细胞的膜表面，其中所述3′-序列与主要核苷酸序列同源，或是异源的，尤其是来自间日疟原虫的序列。
37．根据权利要求36的合成DNA，其特征在于3′-末端序列来自间日疟原虫。
38．根据权利要求32-36任一项的合成DNA序列，其特征在于它失去了所述3′-末端序列。
39．根据权利要求25的杆状病毒类型的载体，其特征在于它选自·以登记号I-1659保藏在CNCM〔全国微生物培养物保藏中心〕的病毒；·以登记号I-1660保藏在CNCM的病毒；·以登记号I-1661保藏在CNCM的病毒；·以登记号I-1662保藏在CNCM的病毒；·以登记号I-1663保藏在CNCM的病毒。
40．分泌具有权利要求21-23任一项的抗体的特征的单克隆抗体的杂交瘤。
41．一种从肽混合物中分离具有指定特异性的p19肽的方法，其特征在于通过将所述肽混合物与根据权利要求20-23任一项的相应抗体接触，优选为已固定在不可溶载体上的抗体，接着解离所形成的抗原-抗体复合物，并回收纯化的p19肽。
42．根据权利要求1-13任一项的蛋白质或根据权利要求15或16的寡聚体在制备可诱导抗疟原虫感染的免疫应答的免疫原组合物中的用途。
43．一种疫苗组合物，包含作为活性成分的根据权利要求1-13任一项的蛋白与需要时至少除去了保守性较差部分的相应的p42，或来自与产生所述蛋白同源的寄生虫的另一重组p19或p42类蛋白的混合物。
44．根据权利要求23的疫苗组合物，其特征在于活性成分的混合物选自下面的混合物·恶性疟原虫p19和间日疟原虫p19；·恶性疟原虫p19和恶性疟原虫p42；·间日疟原虫p19和间日疟原虫p42，如果需要，去除了其最可变区；·恶性疟原虫p19和恶性疟原虫p42，如果需要，去除了其最可变区，和间日疟原虫p19和间日疟原虫p42，如果需要去除了其最可变区。
45．根据权利要求40的杂交瘤，其特征在于它已于1997年2月14日保藏在CNCM(巴黎，法国)，登记号为I-1846。
全文摘要
本发明涉及一种在杆状病毒系统中制备的重组蛋白,其必要组成性多肽序列为感染人的疟原虫属类寄生虫尤其是恶性疟原虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP－1蛋白)的19kDa(p19)C－末端片段的序列,该C－末端片段通常在感染周期中其进入人红细胞的穿透阶段末期仍然锚定在寄生虫表面。所述重组蛋白可用于生产抗疟疾的疫苗。
文档编号C12N5/10GK1222936SQ97193033
公开日1999年7月14日 申请日期1997年2月14日 优先权日1996年2月14日
发明者S·朗加克里-安德里, C·罗斯, F·纳托, J·W·巴恩维尔, K·曼迪斯 申请人:巴斯德研究所, 纽约大学