用含硫盐结晶蛋白质的制作方法

专利名称：用含硫盐结晶蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种简单的，廉价的并且十分有效的用盐结晶蛋白质的方法。
现有技术对于工业目的，酶通常以液体或者无定形物提供。当尚未以液体提供时，它们通常以无定形物提供，因为通常认为结晶酶的已知方法太昂贵以致于不能用于工业规模。
有大量关于结晶酶的文献。由于结晶酶的技术具有高度经验性，因此要使特定结晶方法的结果一般化是困难的。
迄今为止已知蛋白质结晶方法大多数的特征性特点是纯化的和浓缩的初始溶液，十分长的结晶时间，以及化学药品(如盐)的高消费，参考文献可参见，例如，生物工程和生物技术48,1995,P.316-323。
已描述了利用聚乙二醇的工业酶结晶方法，参考文献可参见WO95/01989。
通过从溶液中浸提出盐，然后调节溶液的pH到酶的pI水平附近来结晶酶是可能的，这一点也已描述过，参考文献可参见WO94/22903。
发明概述在本发明中，人们惊奇地发现，将可氧化的含硫盐作为结晶盐非常有效它们可以以少量用于不纯的溶液中，以一种简单的，廉价的和对环境无害的方法对该溶液进行短时间的结晶并且得到高产率。
因此，本发明提供了一种从蛋白质溶液结晶蛋白质的方法，该方法包括(a)用包含硫原子的盐处理蛋白质溶液，所说的硫原子具有低于6的氧化态；(b)以结晶形式回收蛋白质。
附图简述通过参考附图进一步说明本发明，其中

图1显示其温度斜线温度和时间之间的关系，该关系用来控制如实施例1所描述的初级成核速率。
发明详述本发明提供一种从蛋白质溶液中，特别是从发酵(培养)肉汤中结晶蛋白质或者多肽的方法。
除兴趣蛋白质外，发酵肉汤还包含许多其它的化合物，诸如底物化合物，例如，碳水化合物和盐类，细胞，以及其它代谢物如核酸和其它蛋白质。
优选地，本发明的方法利用发酵肉汤，首先将发酵肉汤通过例如絮凝、离心、过滤、微型过滤、超滤、渗滤、电透析、吸附、沉淀、蒸发、或者它们的任何组合进行纯化。
由于本发明的方法对于相对不纯的溶液非常起作用(参见实施例1)，因此在结晶作用之前，纯化通过利用层析方法从发酵肉汤中获得的蛋白质溶液通常是不必要的。
在更具体的实施方案中，本发明的方法包括通过本质上已知的方法浓缩包含蛋白质的溶液。这样的方法包括通过超滤、渗滤、透析、或者蒸发进行浓缩。
虽然浓缩包含蛋白质的溶液对于结晶作用来说不是必不可少的，但是从处理和产率方面来看却是方便的。由于实际原因，可以将包含蛋白质的溶液浓缩成蛋白质含量为0.1至25％(W/W)，优选的是0.5至20％(W/W)，更优选的是1至15％(W/W)，特别优选的是5至12％(W/W)。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法运用于酶的结晶，特别是该酶选自下组蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶或者氧化还原酶。蛋白酶按照本发明结晶的合适的蛋白酶包括可以是来自细胞(如微生物)的发酵产物的任何蛋白酶。优选的是细菌或者真菌来源。包括化学或者基因修饰突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选的是碱性微生物蛋白酶或者胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草菌素，尤其是那些从芽孢杆菌产生的枯草菌素，例如，枯草菌素Novo，枯草菌素Carlsberg，枯草菌素309，枯草菌素147和枯草菌素168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或者牛来源的)和在WO89/06270中描述的镰孢属蛋白酶。
优选的市售蛋白酶包括那些Novo Nordisk A/S(丹麦)以商品名Alcalase,Savinase,Primase,Durazym和Esperase出售的蛋白酶，那些Gist-Brocades以商品名Maxatase,Maxacal,Maxapem和Properase出售的蛋白酶，那些Genencor International以商品名Purafect和Purafect OXP出售的蛋白酶，以及那些Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的蛋白酶。脂肪酶按照本发明结晶的合适的脂肪酶包括可以是来自细胞(如微生物)的发酵产物的任何脂肪酶。优选的是细菌或者真菌来源的。包括化学或者基因修饰突变体。
有用脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如，如EP258068和EP305216中所描述的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如，如EP238023中所描述的，假丝酵母属(Candida)脂肪酶，如Candidaantarctica脂肪酶，例如，如EP214761所描述的Candida antarctica脂肪酶A或者B，诸如产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)和假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶之类的假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如，如EP218272中所描述的，葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶，例如，如EP331376中所描述的，Pseudomonas stutzeri脂肪酶，例如，如BP1,372,034中所公开的，Pseudomonas fluorescens脂肪酶，芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶(Dartois等，(1993)，生物化学生物物理学报1131,253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。
此外，一些克隆脂肪酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等描述的Penicillium camembertii脂肪酶(Yamaguchi等，(1991)，基因103,61-67),Geotricum candidum脂肪酶(Schimada,Y.等，(1989)，生物化学杂志106,383-388)，以及各种诸如Rhizopus delemar脂肪酶(Hass M.J等，(1991)，基因109,117-113)，雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科学，生物技术，生物化学56,716-719)和Rhizopus oryzae脂肪酶之类的根霉属(Rhizopus)脂肪酶。
也可以将诸如角质酶之类的其它类型的脂解酶进行结晶，例如，如WO88/09367所描述的由门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)生成的角质酶，或者由Fusarium solani pisi生成的角质酶(例如WO90/09446所描述的)。
尤其合适的脂肪酶是诸如M1 LipaseMT,Luma fastMT和LipomaxMT(Gist-Brocades),LipolaseMT和Lipolase UltraMT(NovoNordisk A/S)的脂肪酶，以及脂肪酶P″Amano″(Amano药物有限公司)。淀粉酶按照本发明结晶的合适的淀粉酶(α或者β)包括可以是来自细胞(如微生物)的发酵产物的任何淀粉酶。优选的是细菌或者真菌来源的。包括化学或者基因修饰突变体。
例如，淀粉酶包括从芽孢杆菌属(Bacillus)获得的α-淀粉酶，特别是在英国专利说明书No.1,296,839中更详细描述的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的特殊菌株。市售的淀粉酶是DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(由Novo Nordisk A/S提供的)以及RapidaseTM和Maxamyl PTM(由Gist-Brocades提供的)。
其它有用的酶是例如从芽孢杆菌属，热厌氧杆菌属(Thermoanaerobactor或者Thermoanaerobacterium)获得的CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC2.4.1.19)纤维素酶在本文中，所说的术语″纤维素酶″是指催化纤维素降解成葡萄糖，纤维二糖，丙糖和其它纤维寡糖的酶。
在本发明的一个优选的实施方案中，结晶的纤维素酶是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，优选的是单组分(重组)内切葡聚糖酶。
优选地，所说的纤维素酶是微生物纤维素酶，更优选的是细菌或者真菌纤维素酶。
细菌纤维素酶的有用例子是来源于下组细菌或者可由下组细菌产生的纤维素酶，这组细菌选自假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，纤维单胞菌属(Cellulomonas)，梭菌属(Clostridium)，Microspora，栖热袍菌属(Thermotoga),Caldocellum以及放线菌属(Actinomycets)如链霉菌属(Streptomyces)，高温单孢菌属(Termomonospora)和热酸菌属(Acidothemus)，特别是解纤维假单胞菌(Pseudomonas cellulolyticus)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi),Microspora bispora，褐色高温单孢菌(Termnomonospora fusca),Termomonospora cellulolyticum和解纤维热酸菌(Acidothemus cellulolyticus)。
有用的结晶的纤维素酶是酸性纤维素酶，该酸性纤维素酶是来源于下组真菌或者可由下组真菌产生的，这些真菌选自由木霉属(Trichoderma)，漆斑菌属(Myrothecium)，曲霉属(Aspergillus)，Phanaerochaete，脉孢菌属(Neurospora),Neocallimastix和葡萄孢属(Botrytis)组成的属，特别是选自绿色木霉(Trichoderma viride),Trichoderma reesei,Trichoderma longibrachiatum,Myrotheciumverrucaria，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae),Phanaerochaete chrysosporium，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa),Neocallimastix partriciarum和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
另一种有用的结晶的纤维素酶是中性或者碱性纤维素酶，优选的是真菌的中性或者碱性纤维素酶，该纤维素酶来源于下组真菌或可由下组真菌产生曲霉属(Aspergillus)，青霉属(Penicillium)，毁丝霉属(Myceliophthora)，腐质霉属(Humicola)，耙菌属(Irpex)，镰孢属(Fusarium),Stachybotrys，帚霉属(Scopulariopsis)，毛壳属(Chaetomium)，疣孢霉属(Mycogone)，轮枝孢属(Verticillium)，漆斑菌属(Myrothecium),Papulospora，粘帚霉属(Gliocladium)，头孢霉属(Cephalosporium)和顶孢霉属(Acremonium)组成的属，特别是选自下组Humicola insolens，尖镰孢(Fusarium oxysporum)，嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)，微紫青霉(Penicillium janthinellum)和Cephalosporium sp，优选的是由Humicola insolens,DSM 1800，尖镰孢，DSM2672，嗜热毁丝霉CBS117.65，以及Cephalosporium sp.,RYM-202。
其它有用的结晶的纤维素酶的例子是纤维素酶的变体，其母体酶是真菌或者细菌来源的纤维素酶，例如可由真菌腐质霉属(Humicola)，木霉属(Trichoderma)或者镰孢属(Fusarium)的菌株产生的纤维素酶。氧化还原酶按照本发明结晶的氧化还原酶包括过氧化物酶和氧化酶(如漆酶)。过氧化物酶显示过氧化物酶活性的酶可能是任何由酶分类号EC1.11.1.7所包括的显示过氧化物酶活性的过氧化物酶，或者由此所衍生的任何片段。
优选地，在本发明的方法所使用的过氧化物酶是可由微生物(如真菌或者细菌)产生的。一些优选的真菌包括属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢菌纲Hyphomycetes的菌株，例如，镰孢属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，木霉属(Tricoderma)，漆斑菌属(Myrothecium)，轮枝孢属(Verticillum),Arthromyces，卡尔黑霉属(Caldariomyces),Ulocladium,Embellisia，枝孢属(Cladosporium)或者Dreschlera，特殊是尖镰孢(Fusarium oxysporun)(DSM2672)，Humicola insolens,Trichoderma resii,Myrothecium verrucana(IFO6113)，黄萎轮枝孢(Verticillum alboatrum)，大丽花轮枝孢(Verticillumdahlie),Arthromyces ramosus(FERM P-7754),Caldariomycesfumaso,Ulocladium chartarum,Embellisia alli或者Dreschlerahalodes。
其它优选的真菌包括属于担子菌亚门(Basidiomvcotina)，担子菌纲(Basidiomvcetes)的菌株，例如鬼伞属(Coprinus)，展齿革菌属(Phanerochaete)，云芝属(Coriolus)或者栓菌属(Trametes)，特别是灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)f.microsporus(IFO 8371)，长根鬼伞(Coprinusmacrorhizus),Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)或者栓菌属(以前称为多孔菌属(Polyporus))，例如杂色栓菌(Trametes versicolor)(例如PR4 28-A)。
进一步优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina),Mycoraceae纲的菌株，例如根霉属(Rhizopus)或者毛霉属(Mucor)，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。
一些优选的细菌包括放线菌目(Actinomycetales)的菌株，例如，类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)，热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)或者轮丝链轮丝菌轮丝亚种(Streptoverticillum verticillium ssp.verticillium)。
其它优选的细菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(ATCC12905)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides),Rhodomonas palustri，乳链球菌(Streptococcus lactis),Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)或者荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。
进一步优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)(例如，变绿粘球菌(Myxococcus virescens))的菌株。
特别地，重组产生的过氧化物酶是优选的，例如，从Coprinus sp.所产生的过氧化物酶，特别是按照WO92/16634的长根鬼伞(Coprinusmacrorhizus)或者灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)，或者其变体，例如如WO93/24618和WO95/10602所描述的变体。漆酶和漆酶相关的酶在本发明的上下文中，漆酶和漆酶相关的酶包括由酶分类号EC1.10.3.2所包括的任何漆酶，由酶分类号EC1.10.3.1所包括的任何chatechol氧化酶，由酶分类号EC1.3.3.5所包括的任何胆红素氧化酶或者由酶分类号EC1.14.18.1所包括的任何一元酚单加氧酶。
微生物漆酶可能来源于细菌或者真菌(包括丝状真菌和酵母)，并且合适的例子包括由曲霉属，脉孢菌属(Neurospora)(例如Neurosporacrassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)(例如Trametes villosa和杂色栓菌(Trametes versicolor))，丝核菌属(Rhizoctonia)(例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))，鬼伞属(Coprinus)(例如褶纹鬼伞(Coprinus plicatilis)和灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)),Psatyrella，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如Myceliophthorathermophila),Schytalidium，多孔菌属(Polyporus)(例如Polyporuspinsitus)，射脉菌属(Phlebia)(例如Phlebia radita(WO92/01046))，或者云芝属(Coryolus)(例如毛云芝(Coriolus hirsutus)(JP2-238885))的菌株产生的漆酶，特别是由栓菌属(Trametes)，毁丝霉属(Myceliopthora),Schytalidium或者多孔菌属(Polyporus)可获得的漆酶。盐我们已惊奇地发现，低浓度的可氧化的含硫盐(即，包含至少一个具有氧化态低于6的硫原子的盐，特别是包含至少一个具有氧化态从2到4的硫原子的盐)从不纯的溶液中可以产生酶晶体，其中晶体的纯度和晶体的产率都非常好。进而，与用其它盐进行结晶相比，它可以改善晶体的形态，因为晶体比较大(参见实施例1)。
按照本发明迅速完成结晶以致于在通常情况下添加稳定剂或者抑制剂至蛋白质溶液中是不必要的。
由于这些盐通常在水中容易溶解，因此按照本发明优选的含硫盐是碱盐或者铵盐，例如Na2S2O3、Na2SO3、NaHSO3、Na2S2O4、Na2S2O6×2H2O、Na2S3O6、Na2S4O6、Na2S2O5、HSCH2COONa、K2S2O3×1/3H2O、K2SO3×2H2O、KHSO2、K2S2O6、K2S3O6、K2S4O6、K2S2O4、Li2SO3×H2O、Li2S2O6×2H2O、(NH4)2SO3、LiHSO3、KHSO3、(NH4)HSO3、NaSCN或者KSCN。
特别优选的是亚硫酸盐或者硫代硫酸盐。
按照本发明的含硫盐可以是唯一添加的盐或者可以是混合物的一部分，该混合物除含硫盐之外还包含其它盐，这样的混合物的例子是1)按照本发明的含硫盐和硫酸盐的混合物；2)按照本发明的含硫盐和乙酸盐的混合物；3)按照本发明的含硫盐和碳酸盐的混合物；4)按照本发明的含硫盐和亚硫酸氢盐的混合物；5)含硫盐，亚硫酸氢盐和乙酸盐的混合物；或者6)含硫盐，亚硫酸氢盐和碳酸盐的混合物。
包含卤素(如氯)的盐也可以包括在上文公开的盐混合物中。
在本发明的一个特定的实施方案中，将按照本发明的盐以每升0.02-1.2摩尔的浓度，优选的是以每升0.04-1.0摩尔的浓度，更优选的是以每升0.04-0.7摩尔的浓度，最优选的是以每升0.04-0.5摩尔的浓度添加到蛋白质溶液中。
可以将按照本发明的盐以一步进行添加，或者以不止一步进行添加；通常情况下，当以一步添加盐时，将会令人满意地完成结晶作用。
在结晶过程中，在添加所说的盐后减少振荡和任何其它调节以确保所形成的晶体免受断裂，有时这可能是有益的，这将有利于随后的晶体的收获。pH的调节为了发现最适pH，可以调节已添加按照本发明的盐的蛋白质溶液的pH，在最适pH时，结晶作用增加到最大限度同时蛋白质是稳定的。发现最适pH的方法在于进行试验，典型地从pH10开始，然后在pH9、pH8、pH7等等，直到pH3时为止，并且如果发现，例如，最适pH在pH4和pH5之间，然后在所发现的最适pH范围内进行一次试验；最适pH通常在pH4-pH9之间的范围内。
在某些情况下，通过使pH有梯度来完成结晶也可能是有益的；也就是说，在各种pH下完成结晶。
为了调节pH，实际上可以利用任何酸或者碱。所说的酸可以是无机酸或者有机酸。一些例子是盐酸、硫酸、亚硫酸、亚硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸以及甲酸。优选的酸是磷酸、甲酸、柠檬酸以及乙酸。优选的碱是氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，特别是氢氧化钠。结晶通过利用本发明的方法，在没有添加任何晶种开始结晶的情况下，进行少于48小时结晶时间的结晶作用是可能的，特别是进行少于36小时结晶时间的结晶作用，优选的是进行少于24小时结晶时间的结晶作用，更优选的是进行少于12小时结晶时间的结晶作用，最优选的是进行少于6小F时结晶时间的结晶作用。
结晶的蛋白质溶液的温度优选的是从5℃-40℃，特别是10℃-30℃；优选的是如实施例1所显示的逐步提高温度，即，例如，所说的梯度可以从10℃开始，然后在1小时内提高到20℃，然后1小时内到23℃，然后1小时内到25℃，并且在最终形成的温度28℃下可以保持大约24小时。结晶后的回收本发明的方法促使蛋白质，特别是酶结晶。通过常规方法，例如通过离心和/或者过滤并且选择性地进行干燥可以实现晶体蛋白质的回收。与其它盐诸如KAc的利用相比较，通过利用本发明的方法可以改进晶体的收获性能(参见实施例1)；因为晶体较大，该特征使结晶后的离心和/或者过滤更加容易。
如果需要高纯度的结晶产物，可以重复本发明的方法，即重新溶解本发明的方法的结晶终产物，并且进行一次或多次附加的结晶过程。
终产物可以是一种结晶产物或者为了产生例如一种液态蛋白质产物，可以将该晶体重新溶解。
本发明的另一个优点是终产物包含一种可氧化的含硫盐，这意味着蛋白质，例如酶，对氧化作用是稳定的。
下列实施例进一步说明本发明，该实施例不以任何方式限制所要求的本发明的范围。实施例1利用亚硫酸盐结晶蛋白酶将包含迟缓芽孢杆菌蛋白酶的200kg培养肉汤(例如，如US3,723,250所描述的方法发酵的)分成两个组分，每一组分100kg，命名为组分A和组分B。
如下列表1所描述的将每一组分进行预处理

．肉汤组分A和组分B的预处理和絮凝Al-化合物明显地减少了每活性单位OD440nm的量，因此组分A比组分B更纯。
从每个组分来看，通过离心除去生产菌株得到两种上清液，此后利用Seitz K900垫将该上清液进行过滤。将形成的滤液在Asahi(6kD)膜上进行浓缩。将组分A用2体积的水进一步渗滤。
按这种方法，浓缩液B与浓缩液A相比具有比较多的低分子发酵化合物(碳水化合物、盐类、核酸、其它蛋白质，等等)。通过测量如下列表2所显示的(OD280nm/克活性蛋白酶)比，(OD440nm/克活性酶)以及(克活性蛋白酶/克Mettler干物质)来说明这一点

表2．浓缩液A和浓缩液B的纯度将浓缩液经各种量的Na2SO3或者KAc处理，并且利用20％(W/W)的磷酸调节pH=4.9。用非连续的温度梯度来控制初级成核速率。如图1所显示的，该梯度从10℃开始，然后在1小时内提高到20℃，然后1小时内到23℃，然后1小时内到25℃，并且在28℃时停止升温，在该温度下保持24小时。
将结晶悬浮液进行离心，并且利用5.5％CaCl2(pH=4.9)溶液进行洗涤。通过离心获得晶体，并且溶解在10倍100％MPG中，对形成的产物进行OD440nm和蛋白酶活性分析。
表3和表4分别显示结晶作用最终产物A和B的产率和纯度。

表3．利用提高Na2SO3和KAc的量所结晶的浓缩液A。
我们发现利用Na2SO3代替KAc提高产率和纯度。另外，我们发现增加所产生的晶体厚度(以棍形代替针形)。当利用过滤设备收获时，这一点是重要的以避免较细的针晶穿过过滤板。

表4．利用提高Na2SO3和KAc的量所结晶的浓缩液B。
对于这种更不纯的浓缩液，我们发现利用Na2SO3代替KAc确实提高了产率和纯度。为了结晶，我们需要高达10％的KAc，但是Na2SO3仅仅需要4％。我们也发现晶体的厚度增加了。
关于每kg原材料的价格，利用Na2SO3或者KAc的成本区别是可以忽略的，然而，由于就Na2SO3来说，比KAc需要更少的盐，因而更优选的是Na2SO3。实施例2利用硫代硫酸盐结晶淀粉酶将包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)淀粉酶的100kg培养肉汤(例如，如GB1,296,839所描述的方法发酵的)进行下列处理

表5．地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)肉汤的预处理通过转鼓式滤器将生产菌株除去以得到滤液，利用Seitz EK1滤垫将该滤液连续地进行细菌过滤。利用蒸发将形成的滤液浓缩成为干物质含量为15％(测量折光指数)。
通过(OD440nm/克活性淀粉酶)比和活性酶/干物质(克酶/克干物质)比来说明形成的浓缩液的纯度.

表6．结晶开始前浓缩液的纯度。
将浓缩液进一步用各种量的乙酸钾、硫代硫酸钠和硫酸钠处理，并且利用13％(W/W)的NaOH溶液调节pH=7.3，并且在28℃时放置24小时的结晶时间。
通过离心获得结晶悬浮液。将结晶块在10倍(重量)的50％MPG溶液中溶解并且配制。分析形成的配制产物的OD440nm和淀粉酶活性。
淀粉酶活性分析基于α-淀粉酶对对硝基苯基-α-D-麦芽糖庚糖苷(pNP-G7)的消化。该底物(pNP-G7)通过淀粉酶降解成pNP-G3和pNP-G4。pNP-G3进一步由过量的α-葡糖苷酶降解成葡萄糖和黄色的对硝基苯酚。靠进行原位反应可以计算出每时间单位吸光度的变化。这个计算数字是反应速率和酶活性的量度。为了避免蛋白酶的干扰，将PMSF(苯甲基磺酰氟)添加至试液中。
表7中显示最终产物的产率和纯度。<

>表7．用三种增量的不同盐处理并且在pH=7.3以及28℃结晶的浓缩液显示的产率和纯度。
我们惊人地发现，利用硫代硫酸钠(Na2S2O3)作为结晶剂产率增加了。换句话说，我们利用硫代硫酸盐可以大幅度地增加产率和甚至提高纯度。
关于每kg原材料的价格，利用KAc或者Na2S2O3的成本区别是可以忽视的，然而，就Na2S2O3来说，比KAc利用更少的盐，因而对于淀粉酶的结晶来说，更优选的是Na2S2O3。实施例3利用硫代硫酸钠结晶蛋白酶将100kg包含迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)蛋白酶的培养肉汤(例如，如US3,723,250所描述的方法发酵的)进行下列处理

通过转鼓式滤器将生产菌株除去以得到滤液，利用Seitz K900滤板将该滤液进行进一步过滤并且利用Seitz EK1滤垫将该滤液连续地进行细菌过滤。在Asahi(6kD)滤膜上浓缩形成的滤液。
下表8中通过(OD440nm/克活性蛋白酶)比和(OD280nm/克活性蛋白酶)比来说明形成的浓缩液的纯度。

表8．结晶开始前浓缩液的纯度。
将浓缩液进一步利用各种量的乙酸钾和硫代硫酸钠进行处理，用20％(W/W)的HCOOH溶液调节pH=4.9，并且在28℃下放置24小时的结晶时间。
通过离心获得晶体悬浮液。利用1倍(重量)的5.5％CaCl2溶液洗涤结晶块。将形成的结晶块在10倍(重量)的70％MPG溶液中溶解并且配制。
分析形成的配制产物的蛋白酶活性。利用动力学二甲基酪蛋白测定测量蛋白酶活性。
表9显示最终产物的产率。

表9．经过增量的两种不同盐处理并且在28℃,pH=4.9时结晶的浓缩液的产率和形态。
我们惊奇地发现，通过利用硫代硫酸钠(Na2S2O3)作为结晶剂在低盐浓度下产率明显地增加。此外，从表9可以看出，我们获得形态改善的晶体。
权利要求
1．一种从蛋白质溶液中结晶蛋白质的方法，该方法包括(a)用包含硫原子的盐处理所说的蛋白质溶液，所说的硫原子具有低于6的氧化态；(b)以结晶形式回收所说的蛋白质。
2．按照权利要求1的方法，其中所说的硫原子具有从2到4的氧化态。
3．按照权利要求1的方法，其中所说的盐是亚硫酸盐或者硫代硫酸盐。
4．按照权利要求1的方法，其中所说的盐选自下组Na2S2O3、Na2SO3、NaHSO3、Na2S2O4、Na2S2O6×2H2O、Na2S3O6、Na2S4O6、Na2S2O5、HSCH2COONa、K2S2O3×1/3H2O、K2SO3×2H2O、KHSO2、K2S2O6、K2S3O6、K2S4O6、K2S2O4、Li2SO3×H2O、Li2S2O6×2H2O、(NH4)2SO3、LiHSO3、KHSO3以及(NH4)HSO3。
5．按照权利要求1的方法，其中所说的蛋白质溶液包含一种以上的蛋白质。
6．按照权利要求1的方法，其中所说的蛋白质溶液从发酵肉汤获得。
7．按照权利要求6的方法，其中在所说的盐处理之前通过离心、过滤、微量过滤、超滤、渗滤、电透析、沉淀、蒸发、或者它们的组合纯化发酵肉汤。
8．按照权利要求6的方法，其中在所说的盐处理之前将一种或多种絮凝剂添加至发酵肉汤中。
9．按照权利要求1的方法，其中将所说的盐以每升蛋白质溶液0.02-1.2摩尔的浓度添加至蛋白质溶液中。
10．按照权利要求1的方法，其中将所说的蛋白质溶液浓缩成蛋白质含量为0.1至25％(W/W)。
11．按照权利要求1的方法，其中所说的蛋白质是酶。
12．按照权利要求11的方法，其中所说的酶是蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶或者氧化还原酶。
13．按照权利要求1的方法，其中所说的蛋白质溶液的pH在4至9之间。
14．一种可由按照权利要求1的方法获得的蛋白质产物。
全文摘要
本发明涉及一种从蛋白质溶液结晶蛋白质的方法,该方法包括:(a)用包含硫原子的盐处理蛋白质溶液,所说的硫原子具有低于6的氧化态;(b)以结晶形式回收蛋白质。
文档编号C12N9/00GK1213375SQ9719285
公开日1999年4月7日 申请日期1997年3月3日 优先权日1996年3月8日
发明者S·尼尔逊, M·A·拉斯特森 申请人:诺沃挪第克公司