专利名称：蛋白质结晶装置、蛋白质结晶方法、蛋白质结晶剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于进行蛋白质结晶或结晶条件筛选的装置和方法，以及用于使蛋白质结晶从含蛋白质的样品析出的蛋白质结晶剂及其制备方法。
背景技术：
近年来，正在进行称之为结构基因组学的研究，该研究试图通过阐明蛋白质的空间结构与蛋白质的功能的关系，说明编码该蛋白质的基因的功能。
蛋白质的空间结构的解析通常首先要对要解析的蛋白质的结晶条件进行筛选。然后，在最适的结晶条件实施结晶。通过将得到的结晶进行X射线结构解析，进行蛋白质空间结构的解析。其中在对蛋白质的结晶条件进行筛选的过程中，直至决定得到用于进行空间结构解析的充分良好的结晶条件之前，要花费很多时间和很多蛋白质样品。由于这个原因，决定结晶条件成为空间结构解析中的瓶颈。另外，也想出以蒸气扩散法为首的各种各样的结晶方法。然而，实验操作烦杂等问题依然很多。所以进行了取代这些已有方法的新的结晶方法和装置的开发、蛋白质结晶条件的筛选、或为了使结晶更迅速、而且用更微量的样品进行，提出了各种蛋白质结晶装置、结晶方法、结晶条件筛选方法的方案。例如在特开平6-321700号公报中提出了使凝胶中含有沉淀剂和蛋白质，通过将它们层叠来抑制溶液中看到的对流，使结晶在凝胶中生长的方法。除此之外，为了使结晶方法简化，进行了利用凝胶状物的尝试。另外，在进行结晶条件的探索时，提出了各种各样的沉淀剂。
然而，在利用凝胶状物时，由于凝胶状物和沉淀剂的组合，存在着凝胶白浊，或不能进行凝胶化反应的问题。凝胶如果白浊，存在着不能通过显微镜观察有无结晶状态的问题。
另外，本发明者中的一部分人以迅速、用微量样品经济地进行蛋白质结晶条件的筛选为目的，提出了在微阵列的芯片上进行结晶实验那样的结晶装置(例如，WO03/053998号小册子)。
在WO03/053998号小册子所述的发明中使用了微阵列。该微阵列在通过贯通孔形成的各区内保持有凝胶状物。并且在各个凝胶状物中含有很多种类和浓度的蛋白质结晶剂。通过使该微阵列与含蛋白质的样品接触，可以一次对多个结晶条件进行筛选。进而可以用微量的蛋白质样品实施，效率非常高。
但是，在上述的蛋白质结晶装置中，在微阵列的区之间会发生含蛋白质的样品和/或结晶剂的移动、混合(污染)。因此，存在结晶析出的条件与预先区内的凝胶状物中含有的结晶剂的浓度和种类不一致的可能性。
另外，使用这样的装置需要通过手工作业向结晶剂保持部供给含蛋白质的样品，操作变得烦杂。而自动供给含蛋白质的样品的自动装置价高。
本发明正是为了解决上述课题而作出的发明。本发明的目的在于提供不发生凝胶白浊化地使凝胶化反应进行的蛋白质结晶剂及其制备方法，以及能够迅速而且经济地高可靠性地实施蛋白质的结晶实验或结晶条件筛选的蛋白质结晶装置。
发明内容
本发明提供以下内容。
·一种蛋白质结晶装置，其特征是具有蛋白质结晶用微阵列，其具有2个或其以上保持蛋白质结晶剂的结晶剂保持部；和与上述蛋白质结晶用微阵列层叠的板，上述板具有对应于上述结晶剂保持部的可填充含蛋白质样品的结晶区，和设置在该结晶区之间的凹部。
·一种蛋白质结晶用凝胶，其在凝胶状物中保持有氯化钠，所述凝胶状物包含选自丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰基二甲基氨基乙基甲基氯化物盐中的至少一种单体。
·一种蛋白质结晶用凝胶，其在凝胶状物中保持有MPD，所述凝胶状物包含二甲基丙烯酰胺。
·一种蛋白质结晶剂，其在凝胶状物中保持有磷酸Na/K，所述凝胶状物包含2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸。
·一种蛋白质结晶用凝胶，其在凝胶状物中保持有硫酸铵，所述凝胶状物包含甲基丙烯酰基二甲基氨基乙基甲基氯化物盐。
·一种蛋白质结晶用凝胶，其在凝胶状物中保持有丙二酸钠，所述凝胶状物包含丙烯酰胺。
·一种蛋白质结晶用凝胶，其在凝胶状物中保持有PEG6k，所述凝胶状物包含聚氧乙烯单丙烯酸酯。
图1是表示本发明的蛋白质结晶装置的使用状态的模式图。
图2表示本发明中使用的蛋白质结晶用的微阵列的例子。
图3是表示本发明的蛋白质结晶装置的一个例子的模式图。
图4是本发明中使用的板的一部分的剖面图。
图5是本发明中使用的板的平面图。
图6是表示本发明中的板和样品填充辅助工具的使用状态的平面图。
图7是本发明中使用的支持体的平面图。
图8是表示本发明的蛋白质结晶装置的使用状态的平面图。
符号说明12中空纤维；16结晶剂保持部；18蛋白质结晶用微阵列；20支持体；24板；32结晶区；34凹部具体实施方式
以下参照附图对本发明的实施方式进行说明。
图1是表示本发明的蛋白质结晶装置的一个例子的模式图。
该例蛋白质结晶装置就像图1所表示的那样，备有支持体20、硅橡胶制的衬垫22、蛋白质结晶用微阵列18、板24。
衬垫22具有与蛋白质结晶用微阵列18同样形状和面积的中空部23。在支持体20中设置有与该衬垫22的外周同样形状和大小的微阵列支持部26。在微阵列支持部26中做了一个与衬垫22同一形状的标记28。
衬垫22，与标记28位置对准地设置在微阵列支持部26上。并且蛋白质结晶用微阵列18在微阵列支持部26上被容纳设置在衬垫22的中空部23中。这里，为了使设置在板24的结晶区32与蛋白质结晶用微阵列18上的结晶剂保持部16正确接触，优选使蛋白质结晶用微阵列18的上面与支持体20的上面成为同样的高度。
图3是板24的中央部被放大的剖面图。在图4中给出了支持体20、蛋白质结晶用微阵列18、板24被组装的状态的一部分剖面图。
板24就像图3、4所示那样，具有与蛋白质结晶用微阵列18的各个结晶剂保持部16对应排列的结晶区32和设置在该结晶区32之间的凹部34。另外，各个结晶区32分别被结晶区支持部31的前端支持，所述结晶区支持部是在板24中相对于凹部34为凸的部位。
该板24被层叠在由支持体20支持的蛋白质结晶用微阵列18的上面。即，如图4所示那样，结晶区32被结晶剂保持部16密封。进而，各个凹部34处于由结晶区支持部31支持的结晶区32与同样由结晶区支持部31支持的结晶区32之间的位置。
以下，将支持体20中支持蛋白质结晶用微阵列18的面称为微阵列支持面100，将在板24中与蛋白质结晶用微阵列18接触的面称为反应面102，而将与此面相反的面称为外侧面104。
另外，在板24中，排列结晶区32的区域的外边缘成凹部。因此在板24中形成了成凹状的一定面积的区域。以下，将在板24的反应面中排列结晶区32的凹部的区域称为密封部30。
在该例中，蛋白质结晶用微阵列18被设置在支持体20的微阵列支持部26上。而蛋白质结晶用微阵列18只要被设置为结晶剂保持部16对应结晶区32，将该结晶区32密封那样即可。即蛋白质结晶用微阵列18可以粘接在支持体20上，也可以使微阵列支持部26形成凹状，不粘接在该微阵列支持部的底部而层叠在该底部上。
支持体20的材料和形状只要是可固定蛋白质结晶用微阵列18的材料和形状，就没有特别限定。作为支持体20的材料，通过使用透光性材料，结晶装置本身就能够迅速而且简便地用显微镜确认生成的结晶、随时观察结晶的生长过程，因此优选。作为透光性材料，可列举例如，丙烯酸树脂、聚碳酸酯树脂、聚苯乙烯树脂、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃等。
对于支持体20实施用于决定蛋白质结晶用微阵列18的固定位置的标记。标记方法只要是能够将蛋白质结晶用微阵列18正确固定的方法，则没有特别限定。可列举例如，具有与蛋白质结晶用微阵列18同样的形状和面积的印痕，在支持体20上对应于蛋白质结晶用微阵列18的所定位置的位置喷涂点等。
在这个例子中，就像图7所示那样，在支持体20上进一步设置有板定位孔44，该孔使板24与支持体20进行层叠时使结晶区32与结晶剂保持部16对应。
蛋白质结晶用微阵列18具有2个或其以上保持蛋白质结晶剂的结晶剂保持部16。
作为结晶剂保持部16，可以使用在凝胶等能够保持蛋白质结晶剂的多孔质体(以下称为保持相)中保持了蛋白质结晶剂的保持部。保持相就像图4所示那样，只要是当填充到结晶区32的含蛋白质的样品与结晶剂保持部16接触时，蛋白质结晶剂可以由该保持相向结晶区32移动的就可以。
作为上述保持相，优选使用凝胶。通过使用凝胶，蛋白质结晶剂由结晶剂保持部16向填充到结晶区32的含蛋白质的样品的移动可以被控制在适度缓慢的速度。因此可以实现稳定的结晶化。
凝胶的材料没有特别限制，但可以使用例如丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰氨基乙氧基乙醇、N-丙烯酰氨基丙醇、N-羟甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙基酯、(甲基)丙烯酸、烯丙基糊精等单体的1种或2种或其以上与甲叉双(甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等多官能性单体在例如水性介质中共聚合得到的凝胶。此外作为凝胶也可以使用琼脂糖、海藻酸、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇等的凝胶、或将它们交联获得的凝胶。
为了使上述那样的凝胶保持在蛋白质结晶用微阵列18中，例如可以将含有作为凝胶构成成分的丙烯酰胺等单体、多官能性单体和引发剂的溶液注入该容器，使它们聚合、凝胶化即可。作为使其凝胶化的方法，除了在多官能性单体存在下使它们共聚合的方法之外，也可以是在没有多官能性单体存在下使它们共聚合后使用交联剂的方法。另外，作为凝胶材料使用琼脂糖时，可以通过降低温度进行凝胶化。
当使蛋白质结晶剂保持在凝胶中时，对该方法没有特别的限制。例如，可以预先将蛋白质结晶剂与上述的聚合性单体混合后先导入到适当的容器中，然后进行聚合反应使其形成凝胶。由此可以使蛋白质结晶剂保持在凝胶中。这里，可以使蛋白质结晶剂含浸在多孔性粒子等中，使该粒子包括在凝胶中。
作为蛋白质结晶用微阵列18的材料、形状等，只要是反应用物质多数整列配置，不妨碍观察结晶析出，就没有特别的限定。
作为蛋白质结晶用微阵列18的材料，可列举例如玻璃、树脂、金属等。另外也可以使用将这些材料组合后制作的复合体。但是为了容易确认蛋白质结晶有无析出，优选使用透光性高的材料。
作为蛋白质结晶用微阵列18的形状，可列举例如圆形、正方形、长方形等形状。另外，其厚度考虑到结晶效率的提高、以及结晶析出观察的容易化和迅速化可以任意选择。例如可以做成0.1～5mm、优选0.2～2mm。
图2作为在本发明的蛋白质结晶装置中使用的蛋白质结晶用微阵列的适合的例子，展示了多个中空管状体排列构成的微阵列。就像图2所表示的那样，作为中空管状体，至少2根的中空纤维12被按区排列固定在基板10上。这些中空纤维12具有中空部14。在这些中空部14中填充保持有蛋白质结晶剂的凝胶，构成结晶剂保持部16。即，在基板10上至少2个结晶剂保持部16按区排列构成蛋白质结晶用微阵列18。
中空纤维12，可列举例如由甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯等甲基丙烯酸酯系单体、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯等丙烯酸酯系单体的均聚物或它们的共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、降冰片烯/乙烯共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、玻璃等形成的中空纤维。
中空纤维12的内壁表面可以在无处理的状态下使用。也可以根据需要，实施等离子体处理或γ射线、电子射线等放射线处理。进而，中空纤维12，根据需要也可以导入反应性官能团。
中空纤维12的外径，为了能够将每单位面积的结晶剂保持部16的数目做多，优选在2mm或其以下。更优选0.7mm或其以下。而中空纤维的内径可在上述外径的范围内适当选择。
作为在基板10上对2个或其以上的中空纤维12进行按区排列、固定的方法，可以使用以下的方法。即，首先使中空纤维按照规定的间隔平行排列。将这些中空纤维12收束后粘接，可以形成纤维排列体(三维排列体)。使用超薄切片机等制作切片的装置将得到的三维排列体按照与纤维轴交差的方向，优选相对于纤维轴垂直的方向切断。由此，可以得到由具有中空纤维排列体断面的薄片(图2)构成的微阵列。薄片的厚度通常可以做成100～5000μm使用。优选200～2000μm。
此时，通过将中空纤维有规则排列，用树脂粘接剂等粘接，可以得到例如在纵横方向中空纤维12整然有规则排列的中空纤维排列体。中空纤维排列体的形状没有特别限定。通常通过将纤维有规则排列，可形成正方形、长方形、圆形等。
所谓「有规则」指的是能够使一定大小的框架中含有的纤维的根数一定那样有序排列。例如在使直径1mm的纤维成束后排列为断面成纵为10mm、横为10mm的正方形那样时，在该正方形的框内(1cm2)的1边含有的纤维数为10根。然后将该10根纤维捆成1列，做成1层片。然后将该片成10层那样重叠。结果可以排列成纵10根、横10根，合计100根的纤维。但是，使纤维有规则排列的手法并不限定于上述那样将片层叠的方法。
作为蛋白质结晶用微阵列18，通过使用象上述那样将多个中空管状体排列构成的微阵列，可以制造能很好控制蛋白质结晶用微阵列18的厚度、结晶剂保持部16的体积、被保持的蛋白质结晶剂的种类以及浓度等，而且可高效率地制造蛋白质结晶装置。
另外，蛋白质结晶用微阵列18优选是通过用可防止与外面空气接触的密闭性好的容器或通过密封等密闭保存。作为密闭性好的容器，可列举例如气体或水透过率小的高分子材料或玻璃、金属等。而这样的微阵列优选在低温下保存，特别在长期保存时也可以冷冻保存。
另外，各个结晶剂保持部16优选由被制造为不同的蛋白质结晶条件的凝胶构成。这样一来，当进行结晶条件的筛选时，在一枚微阵列上可迅速进行筛选。
这里的所谓蛋白质结晶条件指的是蛋白质结晶剂的种类和浓度、使蛋白质结晶剂保持的保持相、例如使蛋白质结晶剂保持、固化后的凝胶的pH、凝胶的组成、交联度、结晶剂保持部16和结晶区32的温度、时间、冷却分布图等。
作为蛋白质结晶剂的种类，可列举例如沉淀剂、pH缓冲剂、它们的任意组合等。
作为沉淀剂，可列举例如氯化钠、聚乙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、硫酸铵等。作为pH缓冲剂，可列举例如醋酸钠三水合物、磷酸钾、咪唑、柠檬酸钠、二甲胂酸钠等。这些试剂可以单独使用，也可以使用2种或其以上的组合。另外，作为蛋白质结晶剂，可以使用市售品EmeraldBioStructures公司生产的「WIZARD II」、HamptonResearch公司生产的「Crystal screen」、「Grid Screen」等。
作为蛋白质结晶剂的浓度，因使用的蛋白质结晶剂的种类不同而不同，例如，在包含聚乙二醇的沉淀剂的情况下为5～50体积％、优选10～35体积％。另一方面，在pH缓冲剂的情况下为0.05～0.5mol/L、优选0.1～0.2mol/L。
象上述那样，通过将各个结晶剂保持部16制备成各个不同的蛋白质结晶条件，可以迅速进行对象蛋白质的结晶条件的筛选。这里，优选例如将蛋白质结晶剂的浓度设定为多阶段。具体来说，在使用包含氯化钠的沉淀剂时，在0.5～4.0mol/L的范围内，做成5阶段、10阶段、20阶段那样的稀释系列。然后可以将各个浓度的蛋白质结晶剂填充到结晶剂保持部16中。
为了在更多的结晶条件下一块进行结晶，优选蛋白质结晶用微阵列18具有10～1000个结晶剂保持部16。例如，在通常的蛋白质结晶条件筛选中，需要对800左右的结晶条件进行研究。因此，结晶剂保持部的数目优选在10个或其以上。另一方面，如果蛋白质结晶用微阵列18如果具有超过1000的结晶剂保持部16，则结晶剂保持部16之间的间隔变得非常窄，处理的效率差。
蛋白质结晶用微阵列18为了容易进行蛋白质析出的确认，优选是由透光性高的材料构成。
在这个例子中，衬垫22为硅橡胶制品。衬垫的材料只要是适合与蛋白质结晶装置中的其它构成要素(例如，蛋白质结晶用微阵列18、板24、支持体20)组合使用的材料就可以。
板24具有对应于结晶剂保持部16的可填充含蛋白质的样品的结晶区32、和设置在这些结晶区32之间的凹部34。即，在板24上设置有与结晶剂保持部16同样数目的结晶区32。
在板24中，作为与后述的样品填充辅助工具位置吻合的定位部，优选例如，形成样品填充辅助工具定位孔50。
在该例中，在支持体20上进一步设置有板定位构件44，该板定位构件44在对板24和支持体20进行层叠时使得结晶区32与结晶剂保持部16对应。在板24上形成有与设置在支持体20上的板定位构件44相对应的板定位孔46。
在该例中，就像图1、5所示那样，进一步穿设有从板24的外侧面104贯通到反应面102的密封剂注入口48。就像图5所示那样，在该例中，两个密封剂注入口48借助于密封部30贯穿两个相对的两侧。由此，当从一方的密封剂注入口48向密封部30注入密封剂时，由于开始存在于密封部30内的空气由另一方的密封剂注入口48排出，所以在密封部30中位于凹部34之间的结晶区32被更确实地密封。
板24的材料和形状只要是可以与蛋白质结晶用微阵列18叠合的，就没有特别的限定，考虑蛋白质结晶用微阵列18的形状，可以使用任意的材料和形状。作为板的材料，例如列举玻璃、树脂、金属等。可以从这些材料中选择任意的材料、单独一种，或将两种组合后使用。另外为了观察结晶区32中的蛋白质的结晶状态，优选与蛋白质结晶用微阵列18叠合时，与各个结晶剂保持部16对应重叠的部分具有透光性。因此，作为板24的材料，优选透光性材料，例如透明的树脂、玻璃等。
板24优选进一步具有回收结晶区32中析出的结晶的结晶回收机构。使用这样的结晶回收机构，可以回收结晶区32析出的结晶，用作种晶。然后通过继续进行结晶生长过程，可以迅速得到经得住X射线结构解析的结晶。当然，如果析出的结晶本身为经得住X射线结构解析的结晶，则将其回收后在解析中使用。
作为这样的结晶回收机构，可列举例如如下的机构等，其中密封部30由与板24独立的构件构成，与板24通过铰链连接，根据需要可以将密封部30向外侧面104打开。
结晶区32的形状只要是能够填充含蛋白质的样品，与结晶剂保持部16接触时被密封的形状，就没有特别的限定。
结晶区32的容量，当以对于对象蛋白质进行结晶条件的筛选为目的时，为了将结晶条件筛选所需要的蛋白质量减少，优选不足0.5μl。另一方面，如果以将这里析出的结晶继续供X射线结构解析，或用于制作供结构解析的结晶的种晶为目的时，结晶区32的容量优选是在0.5μl或其以上。此时，作为为了得到能够进行X射线结构解析的0.1mm或其以上的大的结晶，结晶剂保持部16和结晶区32的面积的关系只要满足如下条件即可，即结晶剂保持部16和结晶区32进行接触的面的面积可以使得保持在结晶剂保持部16的结晶剂向结晶区32移动，并能够与填充在该结晶区32的含蛋白质的样品反应。与结晶剂保持部16相比，结晶区32可以更大。但结晶区32优选不与构成蛋白质结晶用微阵列18的基板12接触。
在该例中，如图4所示那样，在设置在结晶区32之间的所有凹部34都填充有密封剂35。
作为密封剂35，只要是与含蛋白质的样品不互相溶解，不侵蚀板24、衬垫22、构成蛋白质结晶用微阵列18的基板12等构件的都可以。例如可以使用石蜡油、硅油等。
即使不使用密封剂35，由于具有凹部34，也可以防止含蛋白质的样品向邻接的区侵入。然而如果使用密封剂35，在可更确实地防止含蛋白质的样品之间的混合和向邻接的结晶区32侵入的同时，还可以防止含蛋白质的样品的蒸发。
在该例中，还显示了对支持体20支持的蛋白质结晶用微阵列18与板24进行压接的机构。具体如图1所示那样，设置有贯通支持体20的第一螺纹孔40以及对应于第一螺纹孔贯通板24的第二螺纹孔42。就像图1所示的那样，将螺丝41拧入第一螺纹孔40、第二螺纹孔42。通过使用这样的机构，可以使结晶区32更稳定地保持在密闭状态。
在该例蛋白质结晶装置中，还可以设置监测结晶区32中的蛋白质的结晶化的检测机构。
作为上述检测机构，可列举例如，包括设置在板24的外侧面104的显微镜和搭载在显微镜上的CCD照相机的检测机构。在这样的检测机构中，通过搭载在显微镜上的CCD照相机可以对结晶析出的举动进行摄影纪录，通过对纪录的图像资料进行处理，可以迅速判断结晶是否成功。因此可以迅速决定蛋白质结晶条件。
这里，列举该例蛋白质结晶装置的合适的使用方法。
在该例中，使用样品填充辅助工具，可以向结晶区32中填充含蛋白质的样品。
(结晶区)当使用本发明以蛋白质的结晶为目的时，优选将结晶区32的容量做成0.5μl或其以上。当以更迅速地筛选蛋白质结晶条件为目的时，优选将结晶区32的容量做成不足0.5μl。
(含蛋白质的样品)在本发明中，所谓的含蛋白质的样品是含有要进行结晶的，或含有要对结晶条件特定的蛋白质(以下称为对象蛋白质)的样品。作为蛋白质，可列举天然或合成的肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合物。这些物质优选是从天然或合成材料提取、分离、或通过基因工程手法或化学合成手法等生成后，通过组合运用通常的纯化法，例如溶剂提取、柱层析、液相层析等，对对象蛋白质预先进行纯化得到的物质。
含蛋白质的样品中的蛋白质浓度和纯度也是蛋白质结晶条件的一个要因。因此，可以制备多个阶段的浓度和纯度的含蛋白质的样品，使其与蛋白质结晶剂反应。例如，优选蛋白质浓度在1～50mg/ml范围内变更多个阶段。另外，与蛋白质结晶剂反应的含蛋白质的样品的量，可以根据使用的结晶区32的容量和数目等适当变更。另外，含蛋白质的样品的粘度，只要是将保持有含该蛋白质的样品的结晶区32朝下而保持板24时，含蛋白质的样品不从结晶区32漏出，就没有特别的限定。
含蛋白质的样品，除了对象蛋白质之外，也可以含有有助于蛋白质溶解的蛋白可溶化剂、还原剂等稳定化剂等。作为蛋白质可溶化剂，可列举例如，可使膜蛋白溶解的表面活性剂等。如果使用表面活性剂，在含蛋白质的样品中，例如可以使膜蛋白等水溶性低的蛋白质很好地分散。因此，运用该例蛋白质结晶装置，可以更有效地进行蛋白质的结晶化。
首先，如图1所示那样，将板24象图5所示那样使反应面102朝上静置。在穿过板24的样品填充辅助工具定位孔50和板定位孔46中，各插入一根与该样品填充辅助工具定位孔50以及板定位孔46同一直径的圆柱形的定位销52。
接下来，在该反应面102的上面，如图6所示那样，设置薄板状样品填充辅助工具54。该辅助工具具有对应于板24上的结晶区32排列的穿孔56，以及作为使该穿孔56对应于板24上结晶区32的位置配合机构的2个位置配合孔58。此时，使穿过样品填充辅助工具54的位置配合孔58对准后插入分别固定于板24的样品填充辅助工具定位孔50和板定位孔46的定位销52。然后，将样品填充辅助工具54设置在板24上。通过这样操作，可使板24的结晶区32和样品填充辅助工具54的穿孔56对应地设置样品填充辅助工具54。
然后，在设置在板24上的样品填充辅助工具54的上面，装载含蛋白质的样品，其分量为可遍及样品填充辅助工具54中配置了穿孔56的整个区域。
进而，使用刮板等擦过样品填充辅助工具54的表面，向对应于穿孔56的结晶区32中填充含蛋白质的样品。
然后，将定位销从板24的反应面102侧向外侧面104押出，将样品填充辅助工具从板24上卸下。这样一来，在整个结晶区32都填充了含蛋白质的样品。
就像以上说明的那样，通过将样品填充辅助工具54设置在板24的反应面102上，从其上面添加含蛋白质的样品，可以将含蛋白质的样品正确地填充到结晶区32中。
另外，样品填充辅助工具54，从成形的容易程度、强度、耐盐性等观点出发，优选用不锈钢制造的。另外，优选在样品填充辅助工具54上设置通过镊子进行操作的部位以便将含蛋白质的样品填充到结晶区32后容易将样品填充辅助工具54卸下。例如，优选一端设计成向上侧折弯的折弯部59。
此处，将定位销52分别固定在样品填充辅助工具定位孔50和板定位孔46。但在板24中，样品填充辅助工具54定位孔50也可以独立于与板定位孔46形成多个。
作为将含蛋白质的样品填充到结晶区32的方法，只要是可以按照同一分量将含蛋白质的样品填充到所有的结晶区32中，防止向结晶区32以外的构成要件附着的方法都可以。例如，可以不使用样品填充辅助工具54，使用吸液管等向各个结晶区32中填充含蛋白质的样品。另外也可以使用样品添加用自动仪器。
但是，为了迅速而且经济地进行含蛋白质的样品的填充，优选使用上述的样品填充辅助工具54。
另外，当在含蛋白质样品的填充中使用吸液管时，优选不使用使吸引到吸液管并保持的含蛋白质的样品吐出的机构，而是使附着在吸液管的前端的微量液滴接触结晶区32附近。
就像图1所示那样，与支持体20上的标记28配合设置衬垫22。然后将蛋白质结晶用微阵列18按照被收藏在该衬垫22的中空部23那样设置在支持体20上。
将在结晶区32中填充了含蛋白质的样品的板24反应面102朝下保持而且层叠在被支持体20支持的蛋白质结晶用微阵列18的上面。
此时，使设置在支持体20上的板定位构件44设置为贯通穿过板24的板定位孔46。
另外，在该例中，板24反应面102朝下层叠在被支持体20支持的蛋白质结晶用微阵列18的上面。但是也可以将在结晶区32填充了含蛋白质的样品的板24反应面102朝上静置，使支持了蛋白质结晶用微阵列18的支持体20按照微阵列支持面朝下而层叠在该板24的上面。如果将板24的外侧面104朝上设置，由于容易进行自密封剂注入口48的密封剂的注入、或观察在结晶区32析出的结晶，因而优选。
将板24压在支持体20上并保持、将螺丝41拧入保持着原来状态的第一螺纹孔40、第二螺纹孔42，将板24和支持在支持体20的蛋白质结晶用微阵列18进行压接。
然后使用显微镜确认含蛋白质的样品的填充状态。
当确认含蛋白质的样品被填充到各个结晶区32后，就像图5、8所示那样，用吸液管从穿过板24的密封剂注入口48将密封剂填充到密封部30和凹部34。这样一来，漏出到蛋白质结晶用微阵列18中结晶剂保持部16以外的位置的含蛋白质的样品可以被密封剂置换。而且可以进一步确实防止由于含蛋白质的样品在邻接的结晶区32之间移动引起的污染和条件变化。还可以防止含蛋白质的样品蒸发。另外，密封剂的注入量优选为密封剂遍及密封部30的整个区域的凹部34，而且就像图5、8所示那样，从一方的密封剂注入口48注入密封剂时，从另一方不漏出密封剂的最大量。
使用组装的蛋白质结晶装置，进行蛋白质结晶条件的筛选，可以获得目的蛋白质中的最适结晶条件。另外使用析出的结晶也可以制作适于结构解析的晶体。
在蛋白质结晶装置中，使蛋白质结晶剂与含蛋白质的样品反应后，将蛋白质结晶装置在蛋白质析出所需要的充分时间内、某一温度条件下静置于密闭状态或大气中。
所谓蛋白质析出需要的充分时间，因特定蛋白质、浓度、结晶条件等不同而不同，约1小时～10天，在大约经过30天或其以上结晶没有析出的情况，可看作该结晶条件不合适。另外，由于温度条件是蛋白质结晶条件的一个要因，因此也可以变更温度条件进行结晶。温度条件优选按照例如4℃、15℃、18℃、22℃等那样设定多个阶段。
在蛋白质析出经过充分时间后，对蛋白质的结晶析出状况进行观察。此时优选从板24的外侧面104，例如通过光学显微镜进行观察。
经这样操作可以决定对象蛋白质的最适结晶条件。
以蛋白质的结晶作为目的，将结晶区32的容量做成0.5μl或其以上时，在所有的结晶区32的析出了结晶的结晶区32中继续使结晶生长、或从结晶区32回收析出的结晶用作种晶，通过众所周知的蛋白质结晶方法，在与回收种晶的结晶区32同样的结晶条件下，可以制作结构解析用的结晶。作为众所周知的蛋白质结晶的方法，可列举例如悬滴法、坐滴法、透析法、批量法等。
当以更迅速筛选蛋白质结晶条件为目的，将结晶区32的容量做成不足0.5μl时，在要求的最适结晶条件下进行目的蛋白质的结晶化，可以得到结构解析用的结晶。此时，作为获得结构解析用的结晶的方法，可以使用众所周知的方法，例如蒸气扩散法、悬滴法等。
通过对得到的结构解析用的结晶进行回收，用众所周知的方法将回收的结晶进行X射线结构解析，可以决定对象蛋白质的空间结构。
在该例蛋白质结晶装置中，将含蛋白质的样品填充到结晶区32中后，通过将板24和蛋白质结晶用微阵列18进行层叠，结晶剂保持部16和填充了含蛋白质的样品的结晶区32对应重合。这样一来，保持在结晶剂保持部16的结晶剂向结晶区32内移动，与蛋白质反应。当各个结晶剂保持部16被设定为不同的结晶条件时，在为了对对象蛋白质进行结晶设定为适当结晶条件的结晶区32内结晶析出。
就像以上说明的那样，在该例蛋白质结晶装置中，含蛋白质的样品被保持在结晶区32内，被结晶剂保持部16密闭。另外各个结晶区32被凹部34隔离。因此，可以防止含蛋白质的样品在结晶区32之间的移动和/或蛋白质结晶剂在结晶剂保持部16之间的混合。进而，可以防止来自含蛋白质的样品的溶液的蒸发，也可以稳定保持nl水平的微量的含蛋白质的样品。因此，可以高可靠性地进行蛋白质的结晶。另外可以可靠性更高地判定结晶条件合适与否。
另外，如果将密封剂填充到凹部34，可以更有效地防止含蛋白质样品之间的混合以及向邻接的结晶区32的侵入。另外也可以防止含蛋白质样品的蒸发。因此，含蛋白质样品即使微量，也可以很好控制结晶条件。
另外，如果将支持蛋白质结晶用微阵列18的支持体20和板24进行压接，可以稳定并密闭结晶区32。因此可以更高可靠性地进行结晶。
通过适当选择结晶区32的容量，可以更迅速而且正确地进行蛋白质结晶条件的筛选和制作结构解析用的结晶。
进而，如果再使用样品填充辅助工具，可以简便而且迅速地进行蛋白质结晶条件的筛选。
本发明的蛋白质结晶装置很适合在例如医药领域等中的研究、开发中的蛋白质结晶条件的筛选和蛋白质结构解析用结晶的制作中使用。
本发明的蛋白质结晶用凝胶的特征是，通过对含有蛋白质结晶剂、不饱和单体的溶液进行凝胶化，使该蛋白质结晶剂被均一分散、溶解在凝胶中。
作为蛋白质结晶剂，只要是使蛋白质溶液的蛋白质溶解度下降的试剂，就没有特别的限定。例如，作为盐类可列举硫酸铵、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、氯化锂、丙二酸钠、柠檬酸钠、硫酸镁、硫酸锂、硝酸钠、硫酸镉、硫酸钠等。作为有机溶剂可列举2-甲基-2，4-戊二醇(以下称为MPD)、乙醇、异丙醇、二烷、甲醇、叔丁醇、正丙醇等。作为水溶性高分子化合物，可列举聚乙二醇(以下称为PEG)、聚乙二醇单烷基醚、聚乙烯亚胺等。
这些沉淀剂可以单独或组合两种或其以上使用。其中硫酸铵、氯化钠、磷酸钾/钠、氯化锂、丙二酸钠、MPD、PEG特别合适。
作为市售品，可以使用Emerald BioStructures公司生产的「WIZARDII」、Hampton Research公司生产的「Crystal screen」、「Grid Screen」等。沉淀剂使用的浓度，如果是盐类，优选0.1～5.0mol/L、如果是有机溶剂，优选1～80体积％、如果是水溶性高分子化合物，优选1～50重量％。
蛋白质的结晶最好是在特定的pH范围进行，为了维持pH可以使用缓冲液。对使用的缓冲液没有特别限定，可列举例如含有柠檬酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸、三(羟甲基)氨基甲烷、N，N-二(羟乙基)甘氨酸等缓冲液，可将单独或两种或其以上的混合物根据需要用酸或碱等进行中和，调整到规定的pH。pH优选3.0～10.0的范围，更优选4.0～9.0的范围。
在本发明中，作为凝胶化剂可以使用不饱和单体。不饱和单体只要是通过在水性介质中进行聚合可形成凝胶的，就没有特别的限定，优选(甲基)丙烯酰胺系单体、(甲基)丙烯酸系单体。
作为(甲基)丙烯酰胺系单体，适合使用(甲基)丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺等N，N-二烷基氨基(甲基)丙烯酰胺；(甲基)丙烯酰胺甲磺酸、(甲基)丙烯酰胺乙磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸等(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸；二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二乙基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基乙基(甲基)丙烯酰胺等二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺；二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺甲基氯化物盐、二乙基氨基丙基(甲基)丙烯酰氨基甲基乙基氯化物盐、二甲基氨基乙基(甲基)丙烯酰胺甲基氯化物盐等二烷基氨基(甲基)丙烯酰胺季铵盐。
另外，作为(甲基)丙烯酸系单体，适合使用(甲基)丙烯酸2-羟乙基酯、(甲基)丙烯酸4-羟丁基酯、(甲基)丙烯酸4-羟己基酯、二甘醇单(甲基)丙烯酸酯、三甘醇单(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯等含有羟基的(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙基酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙基酯等(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯、(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙基酯甲基氯化物盐、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙基酯的乙基氯化物盐等(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯的季铵盐。
单体浓度相对于蛋白质结晶剂溶液100质量％，优选1～50质量％，更优选1～10质量％。
另外，在本发明中作为根据需要使用的可与上述单体共聚合的交联性单体，如果是具有2个官能团或其以上的自由基聚合性的单体，就没有特别的限定，可列举例如N，N’-甲叉双(甲基)丙烯酰胺、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷环氧乙烷改性三(甲基)丙烯酸酯等，但是N，N’-甲叉双(甲基)丙烯酰胺、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯特别合适。交联性单体的添加量对于(A)组或(B)组的单体为0.01～10质量份，优选为0.1～5质量份。
本发明的蛋白质结晶剂，通过将特定的沉淀剂与特定的不饱和单体组合，可以得到透明凝胶。如果凝胶透明，观察生成的蛋白质结晶变得很容易。因此利用光学检测系统的自动化也变得容易。
作为可得到透明凝胶的不饱和单体与蛋白质结晶剂的组合，有(1)从丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐中选出来的至少1种单体与氯化钠、(2)二甲基丙烯酰胺与MPD、(3)2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与磷酸Na/K、(4)甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐与硫酸铵、(5)丙烯酰胺与丙二酸钠、(6)聚环氧乙烷单丙烯酸酯与PEG6k。
本发明的蛋白质结晶剂使至少含有沉淀剂、缓冲液、不饱和单体构成的水溶液热聚合进行制备。或者可以通过在热和/或光自由基聚合引发剂存在下使其聚合、凝胶化，使沉淀剂均一地保持在凝胶中而制备。在自由基聚合引发剂存在下进行聚合是合适的。作为在水溶液中适合使用的自由基聚合引发剂，可列举例如叔丁基过氧化氢、过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾等过氧化物；2，2-偶氮双(2-脒基丙烷)2盐酸盐、2，2-偶氮双(2-脒基丁烷)2盐酸盐、2，2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]2盐酸盐等偶氮系聚合引发剂。这些自由基聚合引发剂可以单独或作为两种或其以上的混合物使用。另外也可以使用在上述过氧化物中组合了三级胺、亚硫酸盐、亚铁盐等还原剂的氧化还原系聚合引发剂，进而，也可使用将氧化还原系聚合引发剂和偶氮系聚合引发剂组合并用的聚合引发剂。
另外在给出特定波长的光源下，使用光自由基聚合引发剂，也可以进行聚合。此时，只要是所使用的光自由基聚合引发剂通过特定波长范围的光照射进行分解，产生自由基的引发剂，就没有特别的限定。作为适合利用的引发剂，可列举例如酰基膦氧化物、苯偶姻、苯偶姻烷基醚、苯偶酰、二苯甲酮、蒽醌等通常光聚合中使用的引发剂，其它如2，2’-偶氮双(2-甲基丙脒)盐酸盐、4，4’-偶氮双(氰基吉草酸)钠盐、2，2-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]等偶氮系聚合引发剂。可以根据利用的波长从这些引发剂中选择一种或其以上任意的引发剂使用。另外，上述的所谓特定波长，如果考虑反应液中含有的单体本身引起的光吸收、自由基生成中利用的光量子能量这两点，希望使用波长200～650nm区域的光。作为可用于波长200～650nm区域的光照射的光源的代表例，可列举高压水银灯、低压水银灯、金属卤化物灯、荧光化学灯、荧光蓝色灯等。
实施例(中空纤维排列体的制作)作为支持结晶剂保持部的构成要件，制作中空纤维排列体。
将2块多孔板重叠，所述多孔板排列了具有直径为0.32mm的孔，孔的中心距离为0.42mm，纵横各10列合计100个孔，厚度为0.1mm。将聚乙烯制中空纤维(三菱丽阳公司生产的、外径约500μm，内径约300μm，长约100μm)100根通过这些多孔板的各个孔。然后在使中空纤维在拉紧的状态在从中空纤维一方的端部开始的10cm的位置和40cm的位置两个地方进行固定，将2块多孔板的间隔做成30mm。
然后，将2块多孔板间的空间的3方向用硅制的板状物围起来。从开放的一方，作为树脂原料，将由聚氨酯树脂粘合剂构成的树脂和相对于树脂原料的总质量为2.5质量％的炭黑的混合物流入到2块多孔板之间。接下来于室温下静置1周，使树脂硬化。然后除去设置在多孔板和多孔板之间的板状物，得到中空纤维排列体。
(高分子凝胶向中空纤维排列体的导入固定化)制备由以下组成构成的混合溶液。
丙烯酰胺3.7质量份甲叉双丙烯酰胺0.3质量份2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐0.1质量份将上述混合溶液和上述得到的中空纤维排列体放入干燥器中，在将各个中空纤维的自由端部中长的一方的端部浸渍到该混合液中的状态下，通过将干燥器做成减压状态，向中空纤维的中空部中导入上述混合液。然后将该中空纤维排列体移到内部被水蒸气饱和的密闭玻璃容器中，于80℃下进行4小时聚合反应。由此得到丙烯酰胺凝胶被固定在中空纤维的中空部的中空纤维排列体。
(填充凝胶中空纤维排列体薄片的制作)将上述得到的含有丙烯酰胺凝胶的中空纤维排列体在与中空纤维纵向垂直的方向用薄片切片机切成约2mm的厚度，得到中空纤维的中空部填充有凝胶的纵横各10个、共计100个的中空纤维有规则排列为正方的排列体薄片。图2表示通过上述工序得到的含凝胶的中空纤维排列体薄片。就像图2所示那样，在中空纤维12的中空部14中填充有上述制作的丙烯酰胺凝胶。
(蛋白质结晶用微阵列的制作)在上述制作的含凝胶的中空纤维排列体薄片中，在填充到中空纤维12的中空部14的丙烯酰胺凝胶中，通过将由下述的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J的水溶液构成的蛋白质结晶剂1μl分别添加到保持在中空部的凝胶中，使蛋白质结晶剂保持在丙烯酰胺凝胶中，制作蛋白质结晶用微阵列18。
A2.0mol/L氯化钠水溶液B0.5mol/L氯化钠水溶液C10体积％聚乙二醇(分子量400)水溶液D20体积％聚乙二醇(分子量400)水溶液E10体积％聚乙二醇(分子量6000)水溶液F20体积％聚乙二醇(分子量6000)水溶液G20体积％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液H20％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液I0.5mol/L硫酸铵水溶液J1.5mol/L硫酸铵水溶液以下，将保持了上述A～J的蛋白质结晶剂的结晶剂保持部16分别称之为点A～J。
蛋白质结晶条件的筛选使用图1所示的蛋白质结晶装置，进行溶菌酶(Sigma Aldrich公司生产)的结晶条件的筛选。作为蛋白质结晶用微阵列使用上述制作的蛋白质结晶用微阵列18，作为支持体20、板24的材料使用丙烯酸树脂。
(含蛋白质的样品的添加)使用图6所示的样品填充辅助工具54，向结晶区32填充含蛋白质的样品。样品填充辅助工具54使用具有对应于上述得到的蛋白质结晶用微阵列18的结晶剂保持部16排列的穿孔56的辅助工具。
结晶区32是直径0.7mm、高0.15mm的一端闭合的圆筒状，结晶区32的容量为105nl。
作为含蛋白质的样品，使用含溶菌酶的水溶液(80mg/ml)。
首先将样品填充辅助工具54按照图6所那样设置在板24上，在它的上面用20μl自动吸液管将含蛋白质的样品1.5～2μl按照样品遍及穿孔56的整个上面那样添加。然后由样品填充辅助工具54的上面用刮板通过将含蛋白质的样品按在板24上，将含蛋白质的样品填充到板24上所有的结晶区32中。
(蛋白质结晶装置的组装、蛋白质结晶条件的筛选)然后将结晶区32填充了含蛋白质的样品的板24反应面102朝下保持，层叠在被支持体20支持的蛋白质结晶用微阵列18的上面。确认在结晶区32中填充了含蛋白质的样品后，向穿过板24的一方的密封剂注入口48中从板24的外侧面104，用吸液管注入作为密封剂的石蜡油(以下称为油)。油的注入量使用油遍及密封部30的整个区域，而从另一方的密封剂注入口48油刚好要溢出的量。
然后，将蛋白质结晶装置于20℃下静置3小时。接下来通过光学显微镜观察结晶区32内，结果在使作为蛋白质结晶剂保持了聚乙二醇水溶液的点B没有看到溶菌酶的结晶，而在保持了2.0mol/L氯化钠水溶液的点A看到最适于X射线结构解析的柱状结晶。
(结构解析用结晶的制作)进而，根据上述的结果，使用2.0mol/L氯化钠水溶液作为蛋白质结晶剂，从含溶菌酶的样品溶液通过悬滴法制作溶菌酶结晶。此时，得到的溶菌酶结晶的大小为0.3×0.3×0.5mm。
由以上结果对溶菌酶结晶条件中蛋白质结晶剂的种类和浓度进行研究，结果表明2.0mol/L氯化钠水溶液是最造的结晶条件，而且使用筛选出的最适结晶条件可以得到适于X射线结构解析的结晶。
即，可以通过微量的含蛋白质的样品迅速而且经济、高可靠性地实施蛋白质结晶条件的筛选。
本发明的蛋白质结晶用凝胶中的缓冲液使用以下的缓冲液，通过常规方法进行制备。
0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)、0.1M-柠檬酸缓冲液(pH5.0)、0.1M-MES(pH6.0)、0.1M-HEPES(pH7.0)、0.1M-Tris(pH8.0)、0.1M-Bicine(pH9.0)。
<实施例1>秤量作为沉淀剂的氯化钠0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备1.2M-NaCl水溶液(将该溶液定为a液)。另外，向50％丙烯酰胺水溶液(三菱丽阳公司生产)90g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)5g，去离子水5g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。进而，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
向按照上述步骤形成的水凝胶的样品管中加40mg/ml的溶菌酶水溶液1ml，于20℃下温育24小时，在溶菌酶水溶液中析出溶菌酶结晶。而且结晶生成通过肉眼和实体显微镜都可确认。
<实施例2>除了将实施例1中a液的浓度变更为2.4M以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(2.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例3>除了将实施例1中a液的浓度变更为3.6M以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(3.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例4>除了将实施例1中a液的浓度变更为4.8M以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(4.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例5～8>除了将实施例1～4中缓冲液变更为0.1M-柠檬酸缓冲液(pH5.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例9～12>除了将实施例1～4中缓冲液变更为0.1M-MES缓冲液(pH6.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例13～16>除了将实施例1～4中缓冲液变更为0.1M-HEPES缓冲液(pH7.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例17～20>除了将实施例1～4中缓冲液变更为0.1M-Tris缓冲液(pH8.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例21～24>除了将实施例1～4中缓冲液变更为0.1M-Bicine缓冲液(pH9.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例25>秤量作为沉淀剂的聚乙二醇(和光纯药工业制造、PEG6000、重均分子量6000)0.55g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备5.5％-PEG水溶液(将该溶液定为d液)。另外，制备在聚乙二醇单丙烯酸酯(日本油脂制ブレンマ一AE90)95g中溶解了聚乙二醇二丙烯酸酯(新中村化学制NKESTERA-200)的单体溶液(将该溶液定为e液)。进而，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2，-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液920μl、b液80μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(5％-PEG、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。以下用与实施例1同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例26>除了将实施例25中d液的浓度变更为11％以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(10％-PEG、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例27>除了将在实施例25中d液的浓度变更为22％以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(20％-PEG、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例28>除了将实施例25中d液的浓度变更为33％以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液(30％-PEG、pH4.0、单体浓度8％)，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例29～32>除了将实施例25～28中缓冲液变更为0.1M-柠檬酸缓冲液(pH5.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例33～36>除了将实施例25～28中缓冲液变更为0.1M-MES缓冲液(pH6.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例37～40>除了将实施例25～28中缓冲液变更为0.1M-HEPES缓冲液(pH7.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例41～44>除了将实施例25～28中缓冲液变更为0.1M-Tris缓冲液(pH8.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
<实施例45～48>除了将实施例25～28中缓冲液变更为0.1M-Bicine缓冲液(pH9.0)以外，其它都按照同样步骤制备结晶剂水溶液，再按照同样步骤获得透明的水凝胶。另外用同样的方法确认溶菌酶结晶的生成。结果如表-1所示。
表-1
<实施例49>秤量作为沉淀剂的氯化钠0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备1.2M-NaCl水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸47.5g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)2.5g，去离子水50g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。进而，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
<实施例50>秤量作为沉淀剂的氯化钠0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备1.2M-NaCl水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向80％甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐水溶液62.5g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)2.5g，去离子水35g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。另外，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
<实施例51>秤量作为沉淀剂的2-甲基-2，4-戊二醇2g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备20％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向二甲基丙烯酰胺47.5g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)2.5g，去离子水50g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。另外，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
<实施例52>秤量作为沉淀剂的磷酸钠盐1.176g、磷酸钾盐0.035g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备1.0M-磷酸钠/钾水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸47.5g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)2.5g，去离子水50g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。再制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
<实施例53>秤量作为沉淀剂的硫酸铵3.17g放到10ml容量瓶中，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备2.4M-硫酸铵水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向80％甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐水溶液62.5g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)2.5g，去离子水35g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。另外，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
<实施例54>秤量作为沉淀剂的丙二酸1.04g放到10ml容量瓶中，加20％-氢氧化钠水溶液4g进行中和后，用0.1M-柠檬酸缓冲液(pH4.0)定容，制备1.0M-丙二酸钠水溶液(将该溶液定为a液)。
另外，向50％丙烯酰胺水溶液(三菱丽阳公司制)90g中加N，N’-甲叉双丙烯酰胺(以下缩写为MBAAm)5g，去离子水5g，进行溶解，制备50％单体溶液(将该溶液定为b液)。另外，制备作为水溶性聚合引发剂的2，2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业制造、VA-044)的10％水溶液(将该溶液定为c液)。向2ml的样品管中注入a液840μl、b液160μl后进行混合，制备蛋白质结晶剂水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、单体浓度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃温浴下进行3小时聚合，得到透明的水凝胶。
产业上的利用性通过本发明的蛋白质结晶装置，可以迅速而且经济、高可靠性地实施蛋白质的结晶实验或结晶条件的筛选。另外通过本发明的蛋白质结晶用凝胶在蛋白质结晶中可以完成凝胶反应、以及形成不产生白浊的凝胶状物，可以提供保持了蛋白质结晶剂的透明的凝胶状物。
权利要求
1.一种蛋白质结晶装置，其特征是具有蛋白质结晶用微阵列，该微阵列具有保持蛋白质结晶剂的2个或2个以上的结晶剂保持部；和与上述蛋白质结晶用微阵列层叠的板，上述板具有对应于上述结晶剂保持部的可填充含蛋白质的样品的结晶区和设置在该结晶区之间的凹部。
2.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述结晶剂保持部由制备成各种不同蛋白质结晶条件的凝胶构成。
3.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述蛋白质结晶用微阵列是多个中空管状体排列构成的微阵列。
4.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是还具有对上述蛋白质结晶用微阵列和上述板进行压接的机构。
5.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是在上述凹部填充有密封剂。
6.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述结晶区的容量不足0.5μl。
7.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述结晶区的容量在0.5μl或以上。
8.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述蛋白质结晶用微阵列具有10～1000个结晶剂保持部。
9.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是上述板还具有对上述结晶区析出的结晶进行回收的结晶回收机构。
10.权利要求1所述的蛋白质结晶装置，其特征是还具有对上述结晶区中的蛋白质的结晶进行监测的检测机构。
11.一种样品填充辅助工具，是用于向权利要求1至10任一项中所述的蛋白质结晶装置的上述结晶区中填充含蛋白质的样品的样品填充辅助工具，其特征是具有对应于上述结晶区排列的穿孔和使该穿孔在上述板上与上述结晶区对应的对位机构。
12.权利要求1至10任一项所述的蛋白质结晶装置，其特征是在上述板上形成有使该板与权利要求11所述的样品填充辅助工具对位的定位部。
13.一种蛋白质结晶条件的筛选法，是使用权利要求12所述的蛋白质结晶装置和权利要求11所述的样品填充辅助工具的蛋白质结晶条件筛选法，其特征是将权利要求11所述的样品填充辅助工具按照该样品填充辅助工具的上述穿孔对应于上述结晶区那样设置在上述板上，从该样品填充辅助工具的上面向上述穿孔中添加含蛋白质的样品，填充到上述结晶区中后卸下上述样品填充辅助工具，按照使上述结晶区和上述结晶剂保持部对应、接触那样将上述板与上述蛋白质结晶用微阵列层叠。
14.一种蛋白质结晶用凝胶，在含有选自丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐中的至少一种单体的凝胶状物中保持有氯化钠。
15.一种蛋白质结晶用凝胶，在含有二甲基丙烯酰胺的凝胶状物中保持有2-甲基-2，4-戊二醇。
16.一种蛋白质结晶剂，在含有2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸的凝胶状物中保持有磷酸钠/钾盐。
17.一种蛋白质结晶用凝胶，在含有甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物盐的凝胶状物中保持有硫酸铵。
18.一种蛋白质结晶用凝胶，在含有丙烯酰胺的凝胶状物中保持有丙二酸钠。
19.一种蛋白质结晶用凝胶，在含有聚氧乙烯单丙烯酸酯的凝胶状物中保持有聚乙二醇6000。
全文摘要
本发明提供能够迅速、而且经济、高可靠性地实施蛋白质的结晶实验或结晶条件的筛选的蛋白质结晶装置、以及用简便的方法可进行蛋白质的结晶操作的蛋白质结晶剂。本发明的蛋白质结晶装置的特征在于，具有蛋白质结晶用微阵列(18)，该微阵列(18)具有保持蛋白质结晶剂的2个或2个以上的结晶剂保持部(16)；和与上述蛋白质结晶用微阵列(18)层叠的板(24)，上述板(24)具有对应于上述结晶剂保持部(16)的可填充含蛋白质的样品的结晶区(32)和设置在该结晶区之间的凹部(34)。本发明的蛋白质结晶剂的特征是通过使含有蛋白质沉淀剂、不饱和单体构成的溶液凝胶化，将该结晶剂均一地保持在凝胶中。
文档编号C07K1/30GK1863946SQ200480029518
公开日2006年11月15日 申请日期2004年8月10日 优先权日2003年8月11日
发明者田中熏, 渡边信久, 竹内浩史, 井关隆幸, 涩谷望, 西岛千晴 申请人:三菱丽阳株式会社