专利名称：通过肟连接基团进行连接的聚合物和蛋白质的缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及被氨基氧基官能团化的聚合物或其衍生物、或其中所说的官能团化的聚合物通过肟连接基团与蛋白质共价连接的缀合物、用于制备该官能团化的聚合物的方法、用于制备该缀合物的方法、可以用本发明的方法获得的官能团化的聚合物、可以用本发明的方法获得的缀合物、和包含至少一种本发明的缀合物的药物组合物以及所说的缀合物和组合物用于对人或动物体进行预防或治疗的应用。
将官能团化的聚合物如多糖，例如淀粉以及其衍生物和葡聚糖以及其衍生物以及聚乙二醇以及其衍生物与治疗性蛋白共价连接可以延长所述蛋白质在体内的循环期、降低其抗原性和免疫原性、并改善其对蛋白水解作用的抵抗性。这些性质具有很大的临床益处，在相对小的蛋白质的情况中尤其如此，因为确信Stoke′s半径的增加与肾清除率的降低是相关联的。
用生物相容性聚合物对蛋白质进行修饰在现有技术中是已知的。迄今为止，大多数对蛋白质进行的修饰一直是通过使用聚乙二醇或葡聚糖来进行的，并优选使用聚乙二醇(PEG)。此外，在现有技术中用其它多糖对蛋白进行修饰也是已知的。
其中，WO 02/09766公开了通过将生物学活性的蛋白质与生物相容性聚合物衍生物接合制备的生物相容性蛋白质-聚合物化合物。其所用的生物相容性聚合物是反应性很高的支链聚合物，并且所得的缀合物在聚合物衍生物和蛋白质之间包含长的连接基团。就生物相容性聚合物而言，对式(P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A的聚合物进行了描述，其中P和Q是聚合物残基并且k可以是1或0。对于P和Q而言，提及了聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯、聚三亚甲基二醇、聚乳酸以及其衍生物、聚丙烯酸以及其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚(L-赖氨酸)、聚氧化烯、聚丙烯醛酰胺和水溶性聚合物如葡聚糖或多糖。其中，就蛋白质而言，提及了α、β和γ干扰素、血液因子、细胞因子如白介素、G-CSF、GM-CSF。在WO 02/09766的实施例中，仅公开了单-、二-和三-聚乙二醇衍生物，这些衍生物仅与干扰素和表皮生长因子以及人生长激素相偶联。
WO 94/01483公开了通过用特定类型的化学键将无生物活性的聚合物或聚合物衍生物与药学纯的合成的亲水性聚合物共价结合形成的生物相容性聚合物缀合物。就天然存在的聚合物以及其衍生物而言，公开了多糖如透明质酸，蛋白聚糖如硫酸软骨素A、B和C、壳多糖、肝素、硫酸肝素、葡聚糖如环糊精、羟乙基纤维素、纤维素醚和淀粉、脂类如甘油三酯类物质和磷脂类物质。其中，就合成的聚合物而言，描述了平均分子量为约100至约100,000的聚乙烯以及其衍生物。就与聚合物或聚合物衍生物相连的蛋白质而言，对细胞因子和生长因子，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、生长因子如成骨因子提取物、表皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生的生长因子、酸性成纤维细胞生长因子等等进行了描述。在WO 94/01483的所有加工实施例中，都用聚乙二醇衍生物作为聚合物。
WO 96/11953公开了N-末端化学修饰的蛋白质化合物以及其制备方法。特定地对G-CSF组分进行了描述，该组分是通过将水溶性聚合物与G-CSF的N-末端偶联所产生的。在WO 96/11953中，还公开了N-末端与水溶性聚合物偶联的契合干扰素。虽然在WO 96/11953中列举了许多水溶性聚合物(例如乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物或聚氧乙基化多元醇)，但在WO 96/11953的加工实施例中仅描述了PEG化的G-CSF或契合的IFN组合物。
WO 97/30148涉及具有降低的变应原性的多肽缀合物，其包含具有两个或多个与其偶联的多肽分子的聚合物载体分子。这些缀合物优选是个人护理市场所用组合物的一部分。所说的缀合物是通过将聚合物载体分子活化，将两个或多个多肽分子与该被活化的聚合物载体分子反应并阻断该缀合物上残余的活性基团来进行制备的。就聚合物载体分子而言，在WO97/30148中列出了许多载体分子，包括例如天然或合成均聚物如多元醇、多胺、多羧酸和包含至少两种不同的连接基团的杂聚合物等。其中给出了一些实例，包括星形PEG、支链PEG、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚-D，L-氨基酸。其中，还公开了葡聚糖类物质如羧甲基葡聚糖、纤维素类物质如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉类物质如羟乙基淀粉或羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖、瓜尔胶、菊粉、普鲁兰、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸等等。就多肽而言，仅明确公开了一些酶。
Baldwin，J.E.等人，Tetrahedron，第27卷(1981)，第1723-1726页描述了通过对葡聚糖和羟乙基淀粉进行化学修饰而得到一些醛取代的聚合物，这些聚合物可以与血红蛋白反应从而得到一些可溶性的与聚合物结合的血红蛋白。已证实这些物质能结合氧，但是心脏灌注实验清楚地表明该与聚合物结合的血红蛋白不适于用作血液代用品。
WO 99/49897描述了一些通过将多糖如葡聚糖或羟乙基淀粉与血红蛋白的氨基进行反应而形成的血红蛋白缀合物。就该多糖的官能团而言，使用通过氧化性糖开环而产生的醛基。就所用的优选的还原剂而言，公开了硼烷二甲胺。此外，WO 99/49897仅仅限于血红蛋白。
WO 03/074087涉及一种将蛋白质与淀粉衍生的改性多糖进行偶联的方法。蛋白质与多糖——羟烷基淀粉之间的结合作用是一种在所说的羟烷基淀粉分子的末端醛基或由对其末端醛基进行化学修饰所产生的官能团和所述蛋白质的官能团之间形成的共价连接。就蛋白质的反应性基团而言，公开了氨基、巯基和羧基，但是并没有提及蛋白质的醛基。此外，虽然在许多列举形式中给出了包括不同官能团、理论上适宜的不同连接分子在内的许多不同键的可能性和不同的化学操作，但是其加工实施例仅描述了两种选择第一种，使用被氧化的羟乙基淀粉并用乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)活化将其直接与蛋白质偶联，或者使用未氧化的羟乙基淀粉并且直接将其与蛋白质偶联，从而形成一种Schiffs碱，随后将其还原成相应的胺。
Gaertner等人，Bioconjugate Chem.1996，7，38-44公开了官能团化的聚乙二醇(PEG)与蛋白质的氨基末端进行的部位特异性的连接。用连接基团-NHCO-CH2-O-N＝CH-将PEG和蛋白质连接起来。
本发明的目的是提供一些与蛋白质共价连接以改善所用蛋白质的体内循环期和降低蛋白的抗原性和免疫原性的官能团化的聚合物的缀合物。
通过使用式I的官能团化的聚合物而实现了这一目的″聚合物″-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(I)其中的符号具有下面的含义“聚合物”为可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物，选自亚烷基二醇均聚物，优选乙二醇均聚物(PEG)、丙二醇均聚物；亚烷基二醇共聚物，优选氧化丙烯/氧化乙烯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯吡咯烷酮；聚-1，3-二氧戊环；聚-1，3，6-三氧杂环己烷；乙烯/马来酸酐共聚物；聚氨基酸；和多糖，优选选自淀粉、纤维素、葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、菊粉、印度胶(ghatti gum)、果胶、瓜尔胶、黄蓍胶、琼脂、藻胶、刺梧桐树胶、角叉菜胶、小核菌葡聚糖、红藻胶(fucellaran)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalacton)和槐豆胶；R1、R2、R3、R4、R5为氢、烷基、芳基，更优选地是氢；m为2至4，其中在m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20，优选地是0至10，更优选地是1至5，最优选地是2；
o为0至20，优选地是0至10，更优选地是0或2，其中在n＝0的情况中，o不是0，在一个优选的实施方案中，o是2至20，优选地是2至10，更优选地是2，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；r为0或1，优选地是1；X为-(CR8R9)pO-、-(CR8R9)pS-、-(CR8R9)pNR6-、-(CR8R9)pOC(O)-、-(CR8R9)pC(O)O-、-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-、-(CR8R9)pN(R11)O-、 优选 -(CR8R9)pC(G)N(R10)O-，-(CR8R9)pN(R11)O-，更优选 -(CR8R9)pN(R11)O-，首选 和-(CR8R9)pN(R11)O-，其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)，优选地是O、C(G)；G为S、O、NR14，优选地是O；
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基，优选地是氢，p为0至20，优选地是0至10，更优选地是0至5，最优选地是0至4，在多糖以及其衍生物的情况中更优选地是0，并且在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中更优选1至4，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；其中基团-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5与“聚合物”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连。
关于上述基团X，优选在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中，两个基团(CR8R9)可以被两个基团W所替换，优选以两个基团W一起形成基团-N(R12)C(G)-的方式被两个基团W所替换。在这种情况中，X更优选是 -N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-C(G)N(R10)O-，或-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-N(R11)O-，其中p是2、3或4，优选地是3或4并且最优选地是4，同时R7、R8、R9、R10、R11、R12是氢、烷基、芳基，优选地是氢，在另一个优选的实施方案中，X是-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-3-G-C(G)N(R10)O-，其中p是5，同时R7、R8、R9、R10、R11、R12是氢、烷基、芳基，优选地是氢。
关于上述基团X，优选在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中，还优选如下结构-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5，其中r＝1且X＝-(CR8R9)pO-、-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-S-或-(CR8R9)pS-，其中在-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-S-的情况中，p是2至20，优选地是2至10，更优选地是2至5，最优选地是2至4。在这些情况中，还更优选地是n＝0且o＝2至10，优选地是2至8并且更优选地是2至6如2或4或6。
本发明的官能团化的聚合物可用作制备聚合物-连接子-蛋白质缀合物的前体。
在本发明的上下文中，术语烷基和芳基具有下面的含义“烷基”是直链、支链或环状的被取代或未被取代的C1至C20，优选C1至C9，更优选C1至C4烷基。该烷基可以未被取代或者被芳基、卤素、硝基、醚、烷氧基、氨基或羧基所取代。该烷基优选地是未被取代的。此外，该烷基的一个或两个不相邻的碳原子可以被选自O、S和N的杂原子所代替。所说的杂原子可以根据其化合价任选地被氢、上述的烷基或芳基所取代。优选的烷基是甲基、乙基、异-丙基、正-丙基、异-丁基、正-丁基、仲-丁基和叔丁基。
“芳基”优选地是C6-芳基。该芳基可以未被取代或者被上述直链、支链或环状的烷基所取代。该芳基在环中还可以包含一个或多个杂原子，所说的杂原子优选地选自N、O和S。该芳基优选是苯基或甲苯酰基。“聚合物”适宜的“聚合物”是多糖，优选选自淀粉、纤维素、葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、菊粉、印度胶、果胶、瓜尔胶、黄蓍胶、琼脂、藻胶、刺梧桐树胶、角叉菜胶、小核菌葡聚糖、红藻胶、阿拉伯半乳聚糖和槐豆胶。在本发明的上下文中，“多糖”指的是上述多糖以及其衍生物。上述多糖的衍生物及其制备以及上述多糖都是本领域技术人员众所周知的。优选的多糖选自淀粉，优选地是羟烷基淀粉(HAS)和葡聚糖。
在本发明的上下文中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)指的是已经被至少一个羟基烷基取代的淀粉衍生物。本发明优选的羟烷基淀粉具有式(VI)的组成
其中淀粉分子的还原性末端以未氧化的形式示出并且末端糖单元以半缩醛的形式示出，根据例如所用的溶剂，该半缩醛形式可以与醛形式之间存在平衡。在本发明的上下文中所用的缩写HAS′指的是在HAS分子的还原性末端上没有末端糖单元的HAS分子。
本发明中所用的术语羟烷基淀粉并不仅限于为了简洁起见而用式(VI)表示的其中在末端碳水化合物部分包含羟基烷基R、R′和/或R″的化合物，而且还指其中在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子的剩余部分HAS′中存在至少一个羟基烷基R、R′或R″的化合物。包含两个或多个不同羟基烷基的羟烷基淀粉也是适用的。
在HAS中所包含的至少一个羟基烷基可以包含两个或多个羟基。根据一个优选的实施方案，HAS所包含的至少一个羟基烷基包含一个羟基。
“羟烷基淀粉”的表述还包括其中烷基被单-或多取代的衍生物。在本文中，该烷基优选地被卤素，尤其是氟或者被芳基所取代。此外，该羟基烷基的羟基可以被酯化或醚化。
此外，还可以用直链或支链的被取代或未被取代的烯烃基来代替烷基。
羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除所说的醚衍生物外，在本发明的上下文中还可以使用其它淀粉衍生物。例如，可使用包含被酯化的羟基的衍生物。这些衍生物可以是例如未被取代的具有2-12个碳原子的单-或二羧酸或其被取代的衍生物的衍生物。尤其有用的是未被取代的具有2-6个碳原子的单羧酸的衍生物，尤其是醋酸的衍生物。在本文中，优选乙酰基淀粉、丁基淀粉和丙基淀粉。
此外，还优选具有2-6个碳原子的未被取代的二羧酸的衍生物。
在二羧酸的衍生物的情况中，还可以对该二羧酸的第二个羧基进行酯化。此外，在本发明的上下文中，二羧酸单烷基酯的衍生物也是适用的。
对于取代的单-或二羧酸而言，所述取代基优选是与上面关于取代的烷基残基所提到的取代基相同的取代基。
对淀粉进行酯化的技术在现有技术中是已知的(参见例如Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry，第2卷，1998，Whiley-VCH，Weinheim，纽约，尤其是第4.4章，纤维素的酯化(Esterification of Cellulose)(ISBN 3-527-29489-9)。
根据本发明优选的实施方案，使用上述式(VI)的羟烷基淀粉。在式(VI)中，明确进行了描述的糖环和被表示为HAS′的残基一起表示该优选的羟烷基淀粉分子。包含于HAS′中的其它糖环结构可以与该明确进行了描述的糖环相同或不同。
对式(VI)中的残基R、R′和R″没有特定的限制。根据一个优选的实施方案，R、R′和R″独立地是氢或在各自的烷基残基中具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基。优选氢和具有2至10个碳原子的羟基烷基。该羟基烷基更优选地具有2至6个碳原子，更优选地具有2至4个碳原子并且更优选地具有2个碳原子。因此，“羟烷基淀粉”优选地包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中特别优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，并且最优选羟乙基淀粉。
所说的烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或支链的并且可以被适当地取代。
因此，R、R′和R″可优选地是羟基己基、羟基戊基、羟基丁基、羟基丙基如2-羟基丙基、3-羟基丙基、2-羟基异丙基、羟基乙基如2-羟基乙基、氢并且尤其优选2-羟基乙基。
对于涉及淀粉的本发明所有实施方案而言，最优选羟乙基淀粉(HES)。
羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的衍生物，并且可以被体内的α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物，所述支链淀粉以高达95％重量的浓度存在于玉米淀粉中。HES表现出有利的生物学性质，并且可用作血容量替代剂和用于临床的血液稀释疗法(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支链淀粉由葡萄糖所组成，其中在主链中存在α-1，4-糖苷键并且在分支部分可以发现α-1，6-糖苷键。这种分子的物理-化学性质主要是由糖苷键的类型决定的。由于该带切口的(nicked)α-1，4-糖苷键，产生了每圈具有约六个葡萄糖单体的螺旋状结构。可以通过取代来改变该聚合物的物理-化学以及生物化学性质。可以通过碱性羟乙基化作用来引入羟基乙基。对于羟乙基化而言，通过改变反应条件，可以利用未被取代的葡萄糖单体中各羟基不同的反应性。由于这一事实，普通技术人员能以有限的程度影响取代模式。
HES的特征主要为分子量分布和取代度。在对取代度进行描述时有两种可能1.可以用相对于所有葡萄糖部分而言，被取代的葡萄糖单体所占的比例来对取代度进行描述。
2.可以用摩尔取代度形式来对取代度进行描述，其中对每个葡萄糖部分的羟乙基数目进行描述。
在本发明的上下文中，被表示为DS的取代度指的是上面所描述的摩尔取代度。
HES溶液是以多相分散组合物的形式存在的，其中各分子在聚合度、分支部位的数目和模式、以及取代模式方面彼此不同。因此，HES是具有不同分子量的化合物的混合物。所以，特定的HES溶液是由借助统计学方法获得的平均分子量确定的。在本文中，Mn被计算为取决于分子数量的算术平均值的形式。作为一种供代替的选择，Mw(或MW)——重均分子量表示一种取决于HES的质量的单位。
在本发明的上下文中，羟乙基淀粉优选地具有1至300kD的平均分子量(重均)。就羟基乙基而言，羟乙基淀粉还可以表现出0.1至0.8的优选的摩尔取代度和2至20的C2∶C6取代比例。
在本发明的上下文中所用的术语“平均分子量”指的是根据Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzniem.-Forschung/Drug Res.，41，494-498所确定的重量。
根据本发明一个优选的实施方案，所用羟乙基淀粉的平均分子量为1至300kD，更优选为2至200kD，更优选为4至130kD，更优选为4至70kD。
具有约130kD的平均分子量的HES的实例是得自Fresenius的Voluven。Voluven是一种被用于例如治疗和预防低血容量症的治疗适应征中所用的容量代替的人造胶体。Voluven的特征为平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代度为0.4，C2∶C6比为约9∶1。
因此，本发明还涉及一种如上所述的方法和缀合物，其中所说的羟烷基淀粉是平均分子量为4至70kD的羟乙基淀粉。
优选的平均分子量范围为例如4至70kD或10至70kD或12至70kD或18至70kD或50至70kD或4至50kD或10至50kD或12至50kD或18至50kD或4至18kD或10至18kD或12至18kD或4至12kD或10至12kD或4至10kD。
根据本发明特别优选的实施方案，所用羟乙基淀粉的平均分子量在高于4kD并低于70kD的范围内，如约10kD，或者为9至10kD或10至11kD或9至11kD；或者约12kD，或者为11至12kD或者12至13kD或者11至13kD；或约18kD，或者为17至18kD或18至19kD或17至19kD；或约50kD，或者为49至50kD或50至51kD或49至51kD。
就所涉及的取代度(DS)而言，DS优选至少为0.1，更优选为至少0.2，更优选为至少0.4并且更优选为至少0.7。DS的优选范围为0.1至0.8，更优选为0.2至0.8，更优选为0.3至0.8并且更优选为0.4至0.8，还更优选为0.1至0.7，更优选为0.2至0.7，更优选为0.3至0.7并且更优选为0.4至0.7。特别优选的DS值为例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，还更优选0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，并且例如特别优选0.4和0.7。
羟烷基淀粉、优选羟乙基淀粉的分子量以及其取代度DS特别优选的组合是例如10kD和0.4或10kD和0.7或12kD和0.4或12kD和0.7或18kD和0.4或18kD和0.7或50kD和0.4或50kD和0.7。
在另一个优选的实施方案中，羟烷基淀粉、优选羟乙基淀粉的分子量以及其取代度DS的组合是30kD和0.7或30kD和0.4。
羟烷基淀粉、优选羟乙基淀粉的分子量以及其取代度DS的另一种优选的组合是10kD和0.8、12kD和0.8、18kD和0.8、30kD和0.8、以及50kD和0.8。
就C2∶C6取代的比例而言，所说的取代优选为2至20，更优选为2至15并且更优选为3至12。
根据本发明另一个实施方案，还可以使用具有不同的平均分子量和/或不同的取代度和/或不同的C2∶C6取代比例的羟乙基淀粉的混合物。因此，可以使用具有不同的平均分子量和不同的取代度以及不同的C2∶C6取代比例、或者具有不同的平均分子量和不同的取代度以及相同或大约相同的C2∶C6取代比例、或者具有不同的平均分子量和相同或大约相同的取代度以及不同的C2∶C6取代比例、或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同的取代度以及不同的C2∶C6取代比例、或者具有不同的平均分子量和相同或大约相同的取代度以及相同或大约相同的C2∶C6取代比例、或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同的取代度以及相同或大约相同的C2∶C6取代比例、或者具有相同或者大约相同的平均分子量和相同或大约相同的取代度以及不同的C2∶C6取代比例、或者具有大约相同的平均分子量和大约相同的取代度以及大约相同的C2∶C6取代比例的羟乙基淀粉混合物。
在本发明不同的官能团化的聚合物和/或缀合物方法中，可以使用不同的羟烷基淀粉，优选不同的羟乙基淀粉和/或不同的羟烷基淀粉混合物，优选使用不同的羟乙基淀粉混合物。
式(VII)所示的包含主要通过α-D(1，6)键与另外的1，3分支点相连的D-葡萄糖单元主链的葡聚糖主要是通过细菌或合成制得的。
该葡聚糖的分子量优选为4kD至300kD，更优选为5kD至100kD并且最优选为6kD至40kD。其分子量是用使用适宜的可以通过商业途径获得的分子量标准品的GPC进行测定的。
其它适宜的聚合物是选自亚烷基二醇均聚物，优选乙二醇均聚物(PEG)和丙二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物，优选氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物和聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)的可溶性直链或支链聚合物以及其衍生物。在本发明的上下文中，可以使用上述聚合物以及其衍生物。上述聚合物及其制备以及其衍生物都是本领域技术人员公知的。
优选的聚合物是亚烷基二醇均聚物，优选乙二醇均聚物(PEG)和丙二醇均聚物。更优选乙二醇均聚物(PEG)。
PEG是通式结构(VIII)的聚醚二醇HO-(CH2CH2O)t-CH2CH2-OH (VIII)，其中t是-(CH2CH2O)-基团的数目。其可以以各种分子量和低分散度(Mw/Mn≤1.1，其中Mw是重均分子量且Mn是数均分子量)的形式通过商业途径获得。虽然该聚醚主链在化学上是十分惰性的，但是其伯羟基可进行衍生化。用于制备生物学缀合物的PEG的分子量可以在1000至20000Da之间进行变化，但是在一些情况中，也可以使用具有高于或低于该范围的分子量的聚合物。该分子量是用使用适宜的可通过商业途径获得的分子量标准品的GPC来进行测定的。优选使用的是PEG的单烷基醚，其中所说的烷基选自C1至C4烷基。更优选使用PEG的单甲基醚(mPEG)。在mPEG或PEG的其它单烷基醚上存在的唯一的可衍生化的末端基团将交联的可能性降到了最低程度并改善了所制备的缀合物的同质性。
除PEG的单烷基醚、优选mPEG外，在本发明中还可以使用其它官能团化的PEG衍生物。适宜的实例有PEG的卤代衍生物、PEG的磺酸酯、氨基-PEG、肼基-PEG、巯基-PEG、羧基-PEG以及其活性酯、醛-PEG、三聚氰酰氯-PEG和环氧化物-PEG。在S.Zalipsky，Bioconj ugate Chem.1995，6，150-165中公开了上述衍生物的制备以及另外的衍生物及其制备。此外，一些PEG衍生物可以通过商业途径获得。
PEG的官能团衍生物一般是通过如下方式制备的(i)将羟基直接转化成新的目标官能团，和(ii)将该聚合物与双官能团分子进行反应，从而使得一个官能团形成与该聚合物的连接，而另一个仍然可以进一步进行化学转化。
在本发明中更优选使用PEG的单烷基醚，优选mPEG。
式I的官能团化的聚合物中的基团X是一种连接基团，其选自-(CR8R9)pO-、-(CR8R9)pS-、-(CR8R9)pNR6-、-(CR8R9)pOC(O)-、-(CR8R9)pC(O)O-、-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-、-(CR8R9)pN(R11)O-和 其中一个或多个-(CR8R9)-基团可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团。
W是O、NR12、C(G)，优选O、C(G)，且G是S、O、NR14，优选O。
式I的官能团化的聚合物中的R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14独立地是氢、烷基、芳基，优选地是氢。
p是0至20，优选地是0至10，更优选地是0至5，最优选地是0至4，在多糖以及其衍生物的情况中更优选地是0，并且在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中更优选1至4，其中p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同。
X优选地是 -(CR8R9)pC(G)N(R10)O-，和-(CR8R9)pN(R11)O-，更优选地是 -(CR8R9)pN(R11)O-，仍更优选地是 和-(CR8R9)pN(R11)O-.。
当所说的聚合物是聚亚烷基二醇或其衍生物时，连接基团X的优选结构是 v＝1至10，优选1至4，更优选2或3。
最优选地是 其中v是1至10，优选1至4，更优选2至3。
就上述基团X而言，在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中，还优选具有下面结构的连接基团X -N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-C(G)N(R10)O-或-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-N(R11)O-，其中p是2、3或4，优选3或4并且最优选是4，同时R7、R8、R9、R10、R11、R12是氢、烷基、芳基，优选地是氢，在另一个优选的实施方案中，X是-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-3-G-C(G)N(R10)O-，其中p是5，同时R7、R8、R9、R10、R11、R12是氢、烷基、芳基，优选是氢。
更优选下面的结构 v＝1至10，优选1至4，更优选2或3。
最优选的是 其中v是1至10，优选1至4，更优选2至3。
就上述基团X而言，在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中，还优选基团
-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5，其中r＝1且X＝-(CR8R9)pO-或-(CR8R9)pS-，其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种在化学上合理的基团，W是O、NR12、C(G)，优选地是O、C(G)且G是S、O、NR14，优选地是O；R8、R9和R12独立地是氢、烷基、芳基，优选地是氢；且p是2、3或4。
在这些情况中，尤其优选下述结构的连接基团X 和-N(R12)C(G)-(CR8R9)p-2-S-，其中G、R8、R9、R12且p是3或4，优选地是4。
当聚合物是多糖，优选选自上述葡聚糖或其衍生物或淀粉或其衍生物时，X最优选是 或-N(H)O-。
在式I的基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-中，R1、R2、R3和R4独立地是氢、上述的烷基或芳基，优选地是甲基或氢，更优选地是氢。m是2至4，优选地是2，其中m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同。-(CR1R2)m-优选地是-CH2CH2-或-CH(CH3)CH2-或-CH2CH(CH3)-，-(CR1R2)m-更优选地是-CH2CH2-。
n是0至20，优选地是0至10，更优选地是1至5，最优选地是1或2并且更优选地是1。
o是0至20，优选地是0至10，更优选地是0或2，其中在n＝0的情况中，o不是0，在一个优选的实施方案中，o是2至20，优选地是2至10，更优选地是2，其中o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同。
在本发明一个最优选的实施方案中，-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2OCH2CH2-。
在本发明另一个优选的实施方案中，-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2CH(CH3)CH2CH2-。
式I中的R5是氢、上面所定义的烷基、芳基，优选地是氢。
因此，在本发明一个最优选的实施方案中，式I中的基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5是-CH2CH2OCH2CH2-ONH2。
因此，在本发明另一个最优选的实施方案中，式I中的基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5是-CH2CH2CH(CH3)CH2-ONH2。
基团-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5与所述“聚合物”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连。
一般而言，根据所用的聚合物，该共价连接可以使用该聚合物中任何适宜的基团。最优选通过该聚合物中包含氧的基团将基团-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5与所用的聚合物进行连接，所说的聚合物优选选自淀粉、葡聚糖和聚亚烷基二醇或其衍生物，更优选地是羟烷基淀粉，其中优选羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖和聚乙二醇的单甲基醚(mPEG)。所说的包含氧的基团可以是羰基，优选地是酮基、半缩醛基或醛基，更优选地是半缩醛基或醛基。在聚亚烷基二醇的情况中，该包含氧的基团还可以是基团OR″，例如羧酸酯或碳酸酯，其是由聚亚烷基二醇或其衍生物与醇的反应产生的，其中优选的醇选自N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺、被适宜取代的苯酚如对-硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑系化合物如羟基苯并三唑。尤其优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。但是，还可以通过除上述包含氧的基团之外的其它基团来实现与基团X的连接。将在下文中对-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5与该聚合物的连接进行详细讨论。
式I的官能团化的聚合物适于制备与蛋白质的稳定的缀合物。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及式II的缀合物， 其中符号“聚合物”、R1、R2、R3、R4、m、n、o、r、X和p具有与前述定含义相同的含义，且R13是氢、烷基、芳基，优选地是氢或甲基，“蛋白质”是通过将至少两个氨基酸进行反应所制备的氨基酸序列，其中在式II的缀合物中，基团 与“聚合物”和“蛋白质”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价连接，优选与“蛋白质”的被氧化的N-末端氨基酸或被氧化的碳水化合物侧链共价连接。
“蛋白质”本发明的上下文中所用的术语“蛋白质”涉及具有至少2个，优选至少5个，更优选至少10个，更优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个，更优选至少30个，更优选至少35个，更优选至少40个，更优选至少45个和更优选至少50个氨基酸的任何氨基酸序列。
所述蛋白质可以是用化学合成操作制得的或者可以来源于任何人或其它哺乳动物并且可以通过由天然来源进行纯化来获得。
根据本发明，所述蛋白质可以是生长因子、细胞因子、活化剂、抑制剂、酶、抗体、抗原、转运蛋白、生物粘附蛋白、激素、受体、抑制因子、或其功能衍生物或片断。在本发明的上下文中所用的术语“功能衍生物或片断”指的是可以完全或部分保持起始分子所需的生物学性质或活性的衍生物或片断，例如其可保持起始分子所需生物学性质或活性的至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％并且尤其优选至少90％。该类片断特别优选的实例是例如抗体片断。
蛋白质的实例有红细胞生成素(EPO)如重组的人EPO(rhEPO)、集落刺激因子(CSF)，如G-CSF例如重组的人G-CSF(rhG-CSF)、α-干扰素(IFNα)、β-干扰素(IFNβ)或γ-干扰素(IFNγ)，如IFNα和IFNβ例如重组的人IFNα或IFNβ(rhIFNα或rhIFNβ)、白介素，例如IL-1至IL-18如IL-2或IL-3例如重组的人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII例如第VIII因子、第VII因子、第IX因子、α-抗胰蛋白酶(A1AT)、激活的蛋白C(APC)、纤溶酶原激活物如组织型纤溶酶原激活物(tPA)，如人组织纤溶酶原激活物(hTPA)、AT III如重组的人AT III(rhATIII)、肌红蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子，如表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、脑衍生的生长因子(BDGF)、神经生长因子(NGF)、B-细胞生长因子(BCGF)、脑衍生的神经营养生长因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因子如TGFα或TGFβ、BMP(骨形态形成性蛋白)、生长激素如人生长激素、肿瘤坏死因子如TNFα或TNF β、生长抑素、促生长素、促生长因子、血红蛋白、激素或激素原如胰岛素、促性腺激素、促黑素细胞激素(α-MSH)、曲普瑞林、下丘脑激素如抗利尿激素(ADH和催产素以及释放激素和释放抑制激素、甲状旁腺激素、甲状腺激素如甲状腺素、促甲状腺素、促甲状腺素释放素、催乳激素、降钙素、高血糖素、高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2等等)、exendines如exendin-4、瘦素、后叶加压素、胃泌素、胰泌素、整联蛋白、糖蛋白激素(例如LH、FSH等等)、促melanoside激素、脂蛋白和载脂蛋白如apo-B、apo-E、apo-La、免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD以及其片断、水蛭素、组织途径抑制剂、植物蛋白如植物凝集素或蓖麻毒素、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、E抗原、α-蛋白酶抑制剂、豚草变应原、黑色素(melanin)、低聚赖氨酸蛋白、RGD蛋白或这些蛋白之一的任选的相应受体；或任何这些蛋白或受体的功能衍生物或片断。
优选的酶有例如碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶、氧化酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、激酶和连接酶。具体的非限制性实例有天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、谷酰胺酶、谷酰胺酶-天冬酰胺酶、苯丙氨酸、色氨酸酶、酪氨酸酶、过氧化物歧化酶(SOD)、内毒素酶(endotoxinase)、触酶、过氧化物酶、调血管激素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、glucodase、葡萄糖酸盐氧化酶、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苷酯酶、葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶、组织因子、链激酶、尿激酶、MAP-激酶、DNA酶、RNA酶、乳铁蛋白以及其功能衍生物和片断。
根据本发明一个优选的实施方案，所述蛋白质选自EPO、G-CSF、第VII因子、第IX因子、IFNβ、AT III、A1AT、第VIII因子、APC。
与接合前的蛋白质相比，本发明的缀合物可改善所用蛋白的体内循环期和降低所述蛋白质的抗原性和免疫原性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备官能团化的聚合物的方法，其包括将式III的聚合物“聚合物”-(CR8R9)p-Y (III)与式IV的化合物进行反应，Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)，其中符号“聚合物”、R1、R2、R3、R4、R5、m、n、o具有与前面提及的含义相同的含义，且Y和Q是彼此进行反应从而给出如下连接基团之一的官能团-O-、-S-、-NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-C(G)N(R10)O-、-N(R11)O-、
优选 -N(R11)O-，-C(G)N(R10)O-，更优选 -N(R11)O-， 其中在 的情况中，基团-(CR8R9)-是 首选 或-N(R11)O-，在另一个优选的实施方案中，Y和Q是彼此进行反应从而给出连接基团-O-或-S-的官能团；其中在式III的聚合物中，一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W是O、NR12、C(G)，优选地是O、C(G)；G是S、O、NR14，优选地是O；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14独立地是氢、烷基、芳基，优选地是氢，p是0至20，优选地是0至10，更优选地是0至5，最优选地是0至4，在多糖以及其衍生物的情况中更优选地是0，在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中更优选1至4，其中p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；
其中基团-(CR8R9)pY与“聚合物”的末端基团或位于中间的基团共价连接。
其中，适宜的基团Y是下面的官能团-C-C-双键或C-C-三键或芳族C-C-键；-巯基或羟基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二醇(dioles)；-1，2-氨基-硫醇；-叠氮化物；-1，2-氨基醇；-氨基-NH2或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羟基氨基-O-NH2或包含结构单元-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其均包含结构单元-NH-O-；-具有羰基的残基-Q′-C(＝G)-M，其中G是O或S，M是例如，---OH或-SH；--烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；--烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或烷芳硫基；--烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基或烷芳基羰氧基；--活性酯如具有亚胺结构的羟胺如N-羟基琥珀酰亚胺或具有结构单元O-N(其中N是杂芳基化合物的一部分)的羟胺的酯或者，在G＝O且Q′不存在时，如具有被取代的芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q′不存在或者是NH或杂原子如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；
--NO2；-腈基(nitril)；-羰基如醛基或酮基，或者可以被转化成醛基或酮基的基团，例如缩醛或半缩醛基或缩酮或半缩酮基；-羧基或酯基；--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；-卤化乙烯基如碘乙烯或溴乙烯基或三氟甲磺酸酯；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基-基团-(C＝O)-CH2-Hal，其中Hal是Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含-S-S-结构的二硫化物基团；-基团 -基团 另一种适宜的基团Y是马来酰亚胺基团。
优选的基团Y是包含羰基的官能团，优选地是包含醛基、酮基、羧基、酯基、卤素基团，优选Br或I或Otf(＝O-SO2CF3)，或可以被转化成醛基或酮基，例如缩醛或半缩醛基或缩酮或半缩酮基的基团。
还优选的基团Y是具有羰基的残基-C(＝G)-M，其中G是O，M是活性酯如具有亚胺结构的羟基胺如N-羟基琥珀酰亚胺的酯。
在聚合物是多糖、优选选自淀粉以及其衍生物和葡聚糖以及其衍生物的情况中，Y优选是醛基或缩醛或半缩醛基。在这种情况中，p优选地是0。
在聚合物是聚亚烷基二醇如聚乙二醇的情况中，Y优选地是醛基或酯基，优选地是反应性酯基，如具有亚胺结构的羟基胺如N-羟基琥珀酰亚胺的酯、羟基(-OH)或巯基(-SH)。更优选地，在Y是羟基或巯基的情况中，Q是卤素基团，优选地是Br或I，或者是OTf基。在本发明的其中X＝-(CR8R9)pO-或-(CR8R9)pS-的实施方案中，所用的与式(III)的聚合物进行反应的式(IV)的化合物可以具有被保护形式的官能团-ONHR5，在(III)与(IV)进行反应后可以将其去保护。就保护基团而言，可提及的有邻苯二甲酰亚胺保护基，其可以通过将(III)和(IV)的反应产物与肼进行反应而被除去，从而得到末端官能团-ONHR5。但是，在去保护后可产生-ONHR5的各种适宜的保护均可以使用。
式III的聚合物“聚合物”-(CR8R9)p-Y (III)可用本领域技术人员已知的方法制得。
如果使用聚亚烷基二醇、优选聚乙二醇(PEG)或PEG的单甲基醚(mPEG)，则制备式III聚合物的适宜方法可参见S.Zalipsky，BioconjugateChem.1995，6，150-165。
如果使用多糖、优选淀粉或葡聚糖或其衍生物，则式HI的聚合物是多糖，基团Y优选地是醛基或半缩醛基或二者的平衡的形式。
多糖中的醛基Y优选是其处于醛和半缩醛形式的平衡中的还原性端基。如果聚合物是多糖，则在式III的聚合物中的p最优选地是0。式IV的化合物和其中的聚合物是多糖或其衍生物的式III的聚合物之间的连接如流程图2中所示。
式IV的化合物和其中的聚合物是聚亚烷基二醇或其衍生物的式III的聚合物之间的连接如流程
图1中所示。
为了制备用于与式IV的化合物进行反应的多糖(式III的“聚合物”-(CR8R9)p-Y)，可将多糖氧化，从而在其上产生多个醛基。该氧化可以用多种氧化过程来完成，优选的一种过程是与高碘酸盐(钠或钾盐)进行反应。该反应可以在水溶液中在低温例如0至5℃下，使用根据所需氧化程度所选择的适宜量的高碘酸钠来进行。
该反应可以在约10分钟至4小时内完成。可以用超滤或渗析来除去不想要的低分子量的盐和多糖组分，从而提供了一种控制与式IV的化合物进行反应的被氧化多糖的分子量范围的方法。可以直接使用该被氧化的多糖或者适当地对其进行回收，例如通过冷冻干燥对其进行回收，然后将其重新溶解以用于与式IV的化合物进行反应。
总之，优选使用多糖或其衍生物，而优选的多糖是没有通过氧化进行处理的上述多糖。本发明的发明人发现当使用式IV的化合物，尤其是上述优选的式IV的化合物时，不必预先对多糖进行处理。
适宜的基团Q也可以是上述的官能团，其中官能团Y和Q是以可以获得下述基团之一的方式进行选择的-O-、-S-、-NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-C(G)N(R10)O-、-N(R11)O-、 Q优选地是H2N-O-。
因此，式III聚合物的基团Y优选地是可以与基团-ONH2反应的基团。因此，优选的基团Y是醛基、酮基、羧基、碳酸酯基和活化的羧基，例如酯基、内酯基和酰胺基。其它的适宜的基团是卤化物和拟卤化物基团等等，例如Cl、Br、I和OTf。Y最优选地是醛基(在多糖的情况中是处于与半缩醛形式的平衡中)。在另一个优选的实施方案中，Y是活性酯基如具有亚胺结构的羟基胺如N-羟基琥珀酰亚胺的酯。
如果Q是H2N-O-，则式IV的化合物Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)最优选地是 根据本发明的另一个实施方案，如果Q是H2N-O-，则还优选具有结构 的式(IV)的化合物。
作为具有两个-O-NH2基的化合物的实例，可提及的化合物还有 如果Q是卤素基团，优选地是Br或I或者OTf基团，最优选地是Br或I，则式IV的化合物Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)最优选地是 其中o＝2至10，更优选地是2至8并且尤其优选地是2至6如2、4或6，并且其中-O-NH2可以以其被保护的形式如被邻苯二甲酰亚胺保护基团保护的形式存在，从而使得式(IV)的化合物可以是 其中o是2-6且Q是Br的如上所述的结构式(IV)的化合物的制备如Bauer等人，J.Org.Chem.1963，28，第1604页中所述。可以用相似的方法制备具有如上所示的结构的其它式(IV)的化合物。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种如上所述的方法，其中式IV的化合物是 因此，还是在另一个实施方案中，本发明涉及一种如上所述的方法，其中式IV的化合物是
因此，还是在另一个实施方案中，本发明涉及一种如上所述的方法，其中式IV的化合物是 其中o＝2至10，更优选地是2至8并且尤其优选地是2至6如2、4或6，并且其中-O-NH2可以以其被保护的形式存在。
式IV的化合物可用本领域技术人员已知的方法进行制备。
例如，D.Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)5485-5492公开了 的制备。可以用类似的方法获得其它式IV的化合物。
例如，就化合物 的合成而言，可以参考下文的实施例。
在本发明制备官能团化的聚合物的方法的一个优选实施方案中，将式III的聚合物溶解于有机溶剂例如二氯甲烷、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺中，或者溶解于水性系统例如醋酸钠缓冲的pH为4.5至9，优选5至8的水性系统中。向该聚合物的溶液中加入式IV的化合物。该加入通常是在0至80℃，优选0至60℃，更优选20至40℃的温度下进行的。当该反应在有机溶剂中进行时，通常在所说的温度下将该混合物搅拌或振摇1至48小时，优选2至24小时，更优选2至16小时，并且当该反应在水性系统中进行时，通常将其搅拌或振摇1至48小时，优选2至24小时，更优选2至16小时。通过加入产物在其中不溶或者具有低的溶解度的溶剂或溶剂混合物使产物沉淀。用于使产物沉淀的适宜溶剂取决于产物的性质。在一个实施方案中，通过加入醇，优选2-丙醇或乙醇来使所说的产物沉淀，并通常将其在-60至20℃，优选-20至20℃下进行保温。在另一个实施方案中，通过加入醇和低沸点极性有机溶剂，例如丙酮的混合物来使所说的产物沉淀。一种适宜的溶剂混合物是乙醇和丙酮，例如乙醇和丙酮1∶1(表明所说溶剂的体积相等)的混合物并通常将其在-60至20℃，优选-20至20℃下进行保温。收集沉淀出来的产物，例如通过在低温(通常为0至20℃，优选0℃)下离心来进行收集，将其重新混悬，优选用溶剂或溶剂混合物进行混悬，在一个实施方案中用用于进行沉淀的醇在通常为-60至20℃，优选-20至20℃的温度下来进行混悬，并通常将其在相同的温度下保温0.5至20小时，优选1至3小时。通常通过离心、将产物溶解于水中、在水中透析12至72小时，优选15至48小时，更优选15至25小时并将其冷冻干燥来进一步对所得的产物进行后处理。
在下面的流程图中，给出了通过将式III的聚合物与式IV的化合物、优选 进行反应来制备官能团化的聚合物的方法的实例(流程图1a和2)。
在流程图1b中，给出了通过将式III的聚合物和式IV的化合物，优选 进行反应来制备官能团化的聚合物的方法的实例。
流程图1a聚亚烷基二醇(PAG)-衍生物
流程图1b聚亚烷基二醇(PAG)-衍生物
其中OR、OR″″和OR″得自醇H-OR、H-OR″″和H-OR″，所说的醇优选选自N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺；适宜取代的苯酚如对-硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚；或羟基唑系化合物如羟基苯并三唑。尤其优选地是N-羟基琥珀酰亚胺类，尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，v是1至10，优选1至5，更优选2或3；T是Cl、Br、I或OTf，PEG是聚乙二醇或其衍生物，优选mPEG。PAG是聚亚烷基二醇或其衍生物，优选PEG，更优选mPEG。w是1至10，优选1至5，更优选地是4。
流程图2多糖的还原性末端基团的反应 其中Re是2H或O，Ra是OH，Rb、Rc、Rd、Rf独立地是H、OH、O-烷基、羟基烷基、OC(O)R，其中R是烷基，优选地是O-乙酰基、OPO3H2、OSO3H、ONO2或O-多糖；例如对于葡聚糖以及其衍生物而言，Rf是O-多糖，对于淀粉以及其衍生物而言，Rd是O-多糖。
本发明的另一个实施方案涉及可以用上述方法获得的聚合物。在前面对所说方法和所用起始材料的优选实施方案进行了描述。
可用上述方法获得的官能团化的聚合物优选地是式I的官能团化的聚合物。
本发明官能团化的聚合物适宜用作制备官能团化的聚合物和蛋白质的缀合物的起始材料。在所说的缀合物中，用式(IV)的连接基团Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)，优选用下式的连接基团
将选自可溶性的直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物的聚合物与蛋白质共价连接，其中所说的可溶性的直链或支链均聚物或无规共聚物以及其衍生物选自亚烷基二醇均聚物，优选乙二醇均聚物(PEG)、丙二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物，优选氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖，优选选自淀粉、纤维素、葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、菊粉、印度胶、果胶、瓜尔胶、黄蓍胶、琼脂、藻胶、刺梧桐树胶、角叉菜胶、小核菌葡聚糖、红藻胶、阿拉伯半乳聚糖和槐豆胶。
在另一个优选的实施方案中，所说的连接基团具有式(IV)的结构 在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备缀合物的方法，其包括将本发明的官能团化的聚合物与式V的官能团化的蛋白质进行反应，“蛋白质”-Z(V)其中Z是包含羰基的基团或者适于形成羰基的基团或者另一种能与所说的官能团化的聚合物反应的基团，其中Z与“蛋白质”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连，优选与所说“蛋白质”的被氧化的N-末端氨基酸或被氧化的碳水化合物侧链共价相连。优选的官能团化的聚合物和蛋白质如前所述。
根据本发明的一个实施方案，所述蛋白质的官能团Z是可以与被具有可进行反应的末端基团-O-NHR5的连接基团官能团化的聚合物(优选式I的官能团化的聚合物)反应的基团，其中R5是氢、烷基或芳基，优选是氢。因此，优选的基团Z是醛基、酮基、羧基和活化的羧基，例如酯基和内酯基。另外一些适宜的基团Z是卤化物或拟卤化物基团等等，例如Cl、Br、I或OTf。Z优选地是醛基或酮基。因此，本发明涉及一种如上所述的方法和缀合物，其中所述蛋白质的官能团Z是醛基或酮基。
虽然对基团Z的位置没有总的限制，但优选位于所述蛋白质中的醛基或酮基，根据本发明一个优选的实施方案，该醛基或酮基位于所述蛋白质的碳水化合物侧链中。因此，在本实施方案中，使用被糖基化的蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“碳水化合物侧链”指的是与蛋白质的氨基酸共价连接并且由至少两个“碳水化合物部分”的低聚糖所组成。在本发明的上下文中，术语“碳水化合物部分”指的是羟基醛或羟基酮以及其化学变型(见Rompp Chemielexikon，Thieme Verlag Stuttgart，德国，第9版，1990，第9卷，第2281-2285页以及其中所引用的文献)。此外，其还涉及天然存在的碳水化合物部分如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等等的衍生物。
在一个更优选的实施方案中，该醛基或酮基是碳水化合物侧链的半乳糖残基，优选地是碳水化合物侧链的末端半乳糖残基。
可以用化学或酶学方法来进行末端碳水化合物部分的氧化。
对多肽的碳水化合物部分进行化学氧化的方法在现有技术中是众所周知的并且包括用高碘酸盐对其进行处理(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
在理论上，化学氧化可能对位于末端位置上或者不在末端位置上的任何碳水化合物部分进行氧化。但是，通过选择温和的反应条件，其可优先氧化碳水化合物侧链的末端唾液酸，从而得到醛基或酮基。
根据本发明另一个优选的实施方案，所说的温和的反应条件涉及将所述蛋白质与适宜的高碘酸盐水溶液(高碘酸盐的浓度优选为1至50mM，更优选为1至25mM并且尤其优选为1至10mM如约1mM)进行反应并且优选在0至40℃、尤其优选0至21℃如约0℃的反应温度下进行反应，优选的反应时间为5分钟至5小时，更优选为10分钟至2小时并且尤其优选地为10分钟至1小时如约1小时。高碘酸盐蛋白质的优选摩尔比为1∶200至1∶1，并且更优选为1∶50至1∶5，如约1∶15。
如果例如对EPO进行化学氧化，则优选地将EPO在水性介质，优选水中与高碘酸盐溶液以约15∶1的高碘酸盐EPO摩尔比在约0℃的反应温度下反应优选1小时，使用浓度为约1mM的高碘酸盐水溶液。
因此，本发明还涉及一种如上所述的方法和缀合物，其中，在将蛋白质和聚合物或聚合物衍生物进行反应之前，将糖基化的蛋白质与高碘酸盐溶液进行反应，从而得到具有位于被氧化的碳水化合物侧链中的醛基或酮基的蛋白质，所说的反应优选地是在温和的氧化反应中进行的。与苛刻的条件如10mM高碘酸盐溶液和20至25℃的反应温度相反，在本文中所用的术语“温和的反应条件”指的是例如1mM高碘酸盐溶液和0℃的反应温度。
或者，可以对该碳水化合物侧链进行酶氧化。用于对各碳水化合物侧链进行氧化的酶在现有技术中是已知的，例如在半乳糖的情况中，该酶是半乳糖氧化酶。如果多肽是在能将唾液酸连接到碳水化合物链的细胞例如哺乳动物细胞或者进行了遗传学修饰从而能将唾液酸连接到碳水化合物链上的细胞中产生的，如果希望对末端半乳糖部分进行氧化，则需要除去(部分或完全除去)末端唾液酸。用于除去唾液酸的化学或酶方法在现有技术中是已知的(Chaplin和Kennedy(编辑)，1996，碳水化合物分析实用方法(Carbohydrate Analysisa practical approach)，尤其是其第5章Montreuill，糖蛋白(Glycoproteins)，第175-177页；IRL Press实用方法系列(Praeticalapproach series)(ISBN 0-947946-44-3))。
根据本发明另一个优选的实施方案，醛基或酮基可以位于蛋白质的N末端上并且可以对其进行适当的氧化。尤其当包含羟基的氨基酸如苏氨酸或丝氨酸在1-位上位于蛋白质的N末端时，进行所说N末端氨基酸的氧化可产生所说的酮基或醛基，优选地是醛基。例如，苏氨酸优选位于蛋白质的N末端上，所述蛋白质是例如在真核细胞如哺乳动物，尤其是人、昆虫或酵母细胞中产生的表达产物并且被哺乳动物或其它真核生物碳水化合物糖基化。就对适宜N末端氨基酸进行化学氧化的方法而言，可以使用任何想得到的方法，优选用高碘酸盐进行氧化，尤其优选温和的氧化条件。
根据本发明另一个优选的实施方案，就N末端氢基酸而言，所说的温和的反应条件涉及将所述蛋白质与适宜的高碘酸盐水溶液(优选的高碘酸盐浓度为1至50mM，更优选为1至25mM并且尤其优选地为1至10mM如约1mM)在0至40℃，尤其优选0至21℃如约0℃的反应温度下进行反应，反应时间优选为5分钟至5小时，更优选为10分钟至2小时并且尤其优选为10分钟至1小时如约1小时。高碘酸盐蛋白质的优选摩尔比为1∶200至1∶1并且更优选为1∶50至1∶5如约15∶1。
因此，本发明还涉及一种如上所述的方法和缀合物，其中所说的醛基或酮基位于所说蛋白质的碳水化合物侧链中和/或位于所说蛋白质的N-末端基团上。
在制备官能团化的聚合物和式V的官能团化的蛋白质的缀合物的方法的优选实施方案中，向官能团化的蛋白质的水溶液，优选位于pH为5.0至5.5的醋酸钠缓冲液中的溶液中加入官能团化的聚合物的水溶液，优选位于pH为5.0至5.5的醋酸钠缓冲液中的溶液，加入温度通常为0至40℃，优选地为0至25℃，更优选为15至25℃。然后，将该溶液在前面所述的温度下进行保温。该保温通常进行3至7小时，优选8至48小时，更优选进行15至25小时。进行后处理的步骤和对缀合物进行分离的步骤都是本领域技术人员已知的。可进一步对该缀合物进行处理如后处理，例如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤法和/或冷冻干燥。
当通过加入醇，优选2-丙醇或乙醇来对式III的官能团化的聚合物进行沉淀时，式III的官能团化的聚合物和式V的官能团化的蛋白质摩尔比通常为1-50∶1，优选为1-30∶1，更优选为1-20∶1，更优选为1-15∶1，并且最优选为1-5∶1。
当通过加入乙醇和丙酮的溶剂混合物来对式III的官能团化的聚合物进行沉淀时，式III的官能团化的聚合物和式V的官能团化的蛋白质的摩尔比通常为1-200∶1，优选为1-100∶1，更优选为1-50∶1。
还可以用两步法由式III的官能团化的聚合物开始来制备本发明的缀合物。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备缀合物的方法，其包括的步骤有a)将式III的聚合物“聚合物”-(CR8R9)p-Y (III)
与IV的化合物进行反应，Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)其中的符号具有下面的含义“聚合物”为可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物，选自亚烷基二醇均聚物，优选乙二醇均聚物(PEG)、丙二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物，优选氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖，优选选自淀粉、纤维素、葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、菊粉、印度胶、果胶、瓜尔胶、黄蓍胶、琼脂、藻胶、刺梧桐树胶、角叉菜胶、小核菌葡聚糖、红藻胶、阿拉伯半乳聚糖和槐豆胶；R1、R2、R3、R4、R5为氢、烷基、芳基，优选地是氢；m为2至4，其中在m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20，优选地是0至10，更优选地是1至5，最优选地是1或2，并且更优选地是1；o为0至20，优选地是0至10，更优选地是0或2，其中在n＝0的情况中，o不是0，在一个优选的实施方案中，o是2至20，优选地是2至10，更优选地是2，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；Y和Q为适于彼此进行反应从而给出如下连接基团之一的官能团-O-、-S-、-NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-C(G)N(R10)O-、-N(R11)O-、
优选 -N(R11)O-，-C(G)N(R10)O-，其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)，优选地是O、C(G)；G为S、O、NR14，优选地是O；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基，优选地是氢；p为0至20，优选地是0至10，更优选地是0至5，最优选地是0至4，在多糖以及其衍生物的情况中更优选地是0，并且在聚亚烷基二醇以及其衍生物的情况中更优选1至4，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；其中基团-(CR8R9)p-Y与“聚合物”的至少一个末端基团和/或至少一个位于中间的基团共价相连，由此得到一种官能团化的聚合物，和b)将步骤a)中所获得的官能团化的聚合物与式V的官能团化的蛋白质进行反应，“蛋白质”-Z (V)其中Z是包含羰基的基团或者适于形成羰基的基团或者可以与官能团化的聚合物进行反应的另外的基团，其中Z与“蛋白质”的至少一个末端基团和/或至少一个位于中间的基团共价相连，优选与所述“蛋白质”的被氧化的N-末端氨基酸或被氧化的碳水化合物侧链共价相连。优选的式III的聚合物、式IV的化合物和式V的官能团化的蛋白质如前所述。
步骤a)和b)的反应条件与所述的制备官能团化的聚合物，优选式I的聚合物(步骤a))和用于由官能团化的聚合物开始制备所说缀合物(步骤b))所述的反应条件相同。该两步法的优点是可以省略对在步骤a)中所获得的官能团化的聚合物进行分离的步骤。
本发明的缀合物本身或包含该缀合物的药物组合物可用于对人或动物体进行治疗。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于对人或动物体进行治疗的方法中的本发明的缀合物或可用本发明的方法获得的缀合物。
药物组合物包含治疗有效量的本发明的缀合物以及可药用的稀释剂、助剂或载体。该药物组合物还任选地包含另外的治疗成分或盖仑制剂成分及助剂。适宜的助剂有例如稀释剂、缓冲系统、粘合剂、表面活性组分、增稠剂、润滑剂和抗分解剂(包括抗氧剂)。
治疗有效量是在为了改善、治愈或预防疾病而进行的治疗的范围内的单次或重复治疗中足以获得积极作用的量。
可药用的稀释剂是与本发明的缀合物和人或动物体都可相容的稀释剂。
药物组合物的形式取决于所需的或适宜的应用方法。优选的应用是胃肠外应用。适宜的胃肠外应用方法在现有技术中是已知的。其它可能的应用有鼻内应用、intrachealic应用或局部应用。药物组合物可以以剂量单位的形式存在并且可以用现有技术中已知的方法来进行制备。
药物组合物包含治疗有效量的本发明的缀合物或可用本发明的方法获得的缀合物。
所述药物组合物还优选包含至少一种可药用的稀释剂、助剂或载体。适宜的稀释剂、助剂或载体以及其它适宜的成分都是本领域技术人员已知的。
用下面的实施例进一步对本发明进行描述。
实施例A)羟基氨基-PEG-衍生物的合成Aa)在水溶液中进行的羟基氨基-PEG20的合成将200mg mPEG-丁醛(mPEG-ButyrALD，MW20,000，Nektar，Huntsville，AL，USA)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入1mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺(根据D.Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)5485-92，5489-90页合成)。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物在-20℃下加入到45mL 2-丙醇中并将其在-20℃下保温4小时。通过在0℃下进行离心收集沉淀出来的产物，用15mL 2-丙醇在-20℃下进行洗涤并将其在-20℃下保温1小时。在离心后，将该产物溶解于15mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
Ab)在有机溶剂中进行的羟基氨基-PEG20的合成将200mg mPEG-丁醛(mPEG-ButyrALD，MW20,000，Nektar，Huntsville，AL，USA)溶解于2mL二氯甲烷中并向其中加入1mmolO-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺(根据D.Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)5485-92，5489-90页合成)。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物在-20℃下加入到45mL 2-丙醇中并将其在-20℃下保温4小时。通过在0℃下进行离心来收集沉淀出来的产物，用15mL 2-丙醇在-20℃下进行洗涤并将其在-20℃下保温1小时。在离心后，将该产物溶解于15mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
B)羟基氨基-葡聚糖-衍生物的合成在水溶液中进行的羟基氨基-葡聚糖17的合成将500mg葡聚糖(得自Leuconostoc ssp.，Mr～15000-20000D，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入1mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺(根据D.Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)5485-92，5489-90页合成)。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物在-20℃下加入到45mL2-丙醇中并将其在-20℃下保温4小时。通过在0℃下进行离心来收集沉淀出来的产物，用15mL 2-丙醇在-20℃下进行洗涤并将其在-20℃下保温1小时。在离心后，将该产物溶解于15mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
C)EPO缀合物的合成C1)通过对EPO进行温和的高碘酸盐处理对N-乙酰神经氨酸残基进行高碘酸盐氧化向保持在0℃下的总共20mL 2.0mg/ml的EPO溶液(重组制备的具有人EPO的氨基酸序列的EPO并且其与可商业获得的产品(EpoietinαErypo，ORTHO BIOTECH，Jansen-Cilag或EpoietinβNeoRecormon，Roche；参见EP 0 148 605，EP 0 205 564，EP 0 411 678)的特性相似或基本相同)中加入2.2mL冰冷的10mM偏高碘酸钠溶液，从而产生了1mM偏高碘酸钠的终浓度。将该混合物在冰浴上在0℃下在黑暗中保温1小时，通过加入40μl甘油来终止反应并将其再保温5分钟。
C2)用于随后用羟基氨基官能团化的羟乙基淀粉衍生物进行衍生化的高碘酸盐氧化的EPO的缓冲液交换缓冲液交换是用使用聚醚砜(PES)膜的20mL Vivaspin 20浓缩器(Vivaspin AG，Hannover，德国)来进行的。通过加入5mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)来对该浓缩器部件进行洗涤并将该浓缩器部件在4000rpm下在6℃下在Megafuge 1.0R(Kendro Laboratory Equipment，Osterode，德国)中进行离心。随后，向该浓缩器部件中加入20mL实施例1的高碘酸盐氧化的EPO溶液并将其在4000rpm下离心25分钟直至得到一种5-倍浓缩物。向该浓缩物中加入15mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)并将其如上所述那样进行离心。将该离心循环重复3次，在用醋酸钠缓冲液(pH5.5)对该浓缩器部件洗涤2次(每次使用1mL)后，取出最后的浓缩物并将其转移到50mL无菌的塑料管中；用醋酸钠缓冲液(pH5.5)将该EPO的体积调至26.7mL并通过按照欧洲药典(红细胞生成素浓溶液，第4版，2002，第1123-1128页)中的描述测定280nm下的吸光度(比吸光系数值为7.43)来确定该氧化的EPO终溶液的蛋白质浓度。测得该高碘酸盐氧化的EPO终溶液的值为1.378mg/ml(36.8mg EPO，相当于≈90％的最终收率)。C3)mPEG醛-反应性聚合物和葡聚糖醛-反应性聚合物的EPO-缀合物的合成向13.3μL被氧化的EPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(根据实施例C1进行氧化)中加入6.67μL醛-反应性聚合物在0.1M醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中的溶液并将该溶液在22℃下保温22小时。采用下面的浓度对于根据实施例Aa)和Ab)制得的醛-反应性聚合物而言为100mg/mL对于根据实施例B)制得的葡聚糖醛-反应性聚合物而言为87.5mg/mL在实施例C1)至C3)中，图2的SDS page分析中蛋白质谱带向更高的分子量迁移表明了成功的接合。谱带宽度的增加是由于所用葡聚糖和PEG-衍生物的分子量分布以及与所述蛋白质相连的HES衍生物的数目造成的。与羟基氨基-葡聚糖衍生物相反，相应的PEG衍生物也移动到凝胶中并且也被染色，因此使得蛋白质谱带的显像复杂化。
C4)羟基乙基淀粉和EPO缀合物的合成C4.1)羟基氨基官能团化的HES衍生物的合成O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺按照Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)第5485-5492页所述的方法分两步由可以通过商业途径获得的材料合成的。
C4.1)(a)羟基氨基-HES 10/0.4的合成将2g HES 10/0.4(MW＝10000 D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于17mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入20mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入到100mL冰冷的1∶1的丙酮和乙醇(v/v)的混合物中。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其重新溶解于50mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.51kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
C4.1)(b)羟基氨基-HES 10/0.7的合成将2g HES10/0.7(MW＝10000 D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入20mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入到100mL冰冷的1∶1的丙酮和乙醇(v/v)的混合物中。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其重新溶解于50mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
C4.1)(c)羟基氨基-HES 50/0.4的合成将2g HES50/0.4(MW＝50000 D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入4mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入到100mL冰冷的1∶1的丙酮和乙醇(v/v)的混合物中。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其重新溶解于50mL水中，用水透析21小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
C4.1)(d)羟基氨基-HES 50/0.7的合成将2g HES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH 5.2)中并向其中加入4mmol O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。将其在22℃下振摇17.5小时后，将反应混合物加入到70mL冰冷的1∶1的丙酮和乙醇(v/v)的混合物中。通过在0℃下离心来收集所沉淀出来的产物，用30mL冰冷的1∶1的丙酮和乙醇(v/v)的混合物对其进行洗涤，将其重新溶解于50mL水中，用水透析19.5小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。
C4.2)HES-EPO缀合物的合成在实施例C4.2)(a)至C4.2)(d)中，图1的SDS page分析中蛋白质谱带向更高的分子量迁移表明了成功的接合。谱带宽度的增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与所述蛋白质相连的HES衍生物的数目造成的。
C4.2)(a)用实施C4.1)(a)的羟基氨基-HES 10/0.4进行的合成向3.63mL被氧化的EPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(根据实施例C2制得的；1.378mg/ml)中加入83mg根据实施例C4.1)(a)制得的羟基氨基HES10/0.4并将该溶液在22℃下振摇16.5小时。
C4.2)(b)用实施例C4.1)(b)的羟基氨基-HES 10/0.7进行的合成向3.63mL被氧化的EPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(根据实施例C2)制得的；1.378mg/ml)中加入83mg根据实施例C4.1)(b)制得的羟基氨基HES10/0.7并将该溶液在22℃下振摇16.5小时。
C4.2)(c)使用实施例C4.1)(c)的羟基氨基-HES 50/0.4进行的合成向3.63mL被氧化的EPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(根据实施例C2)制得的；1.378mg/ml)中加入416mg根据实施例C4.1)(c)制得的羟基氨基HES 50/0.4并将该溶液在22℃下振摇16.5小时。
C4.2)(d)使用实施例C4.1)(d)的羟基氨基-HES 50/0.7进行的合成向3.63mL被氧化的EPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(根据实施例C2)制得的；1.378mg/ml)中加入416mg根据实施例C4.1)(d)制得的羟基氨基HES 50/0.7并将该溶液在22℃下振摇16.5小时。
D)HES-修饰的EPO的纯化以及未进行反应的HES-衍生物与HES-修饰的EPO的分离在进行了实施例C4.2)(a)至C4.2)(d)的HES-偶联操作后，在室温下用配有泵P-903、具有0.6mL室的混合器M-925、Monitor pH/C-900、泵P-950(样品泵)的KTA Explorer 10系统和3.21版的Software Unicorn来对所有的样品进行纯化。在280、260和220nm下用具有10mm流动池的Monitor UV-900来进行检测。
将保温的混合物用10倍体积的缓冲液A(20mM用NaOH将pH调至8.0的N-吗啉代丙磺酸)进行稀释并将其以0.8mL/分钟的流速上样到包含4mL Q-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)的柱子上；之前已经用7个柱体积(CV)的缓冲液A对该柱进行了平衡。然后，将柱子用6CV的缓冲液A以1.0mL/分钟的流速进行洗涤并用2.5CV的缓冲液B(0.5M位于20mM磷酸钠中的NaCl，pH6.5)以0.6mL/分钟的流速进行洗脱。然后，用2.5CV的缓冲液C(1.5M位于20mM磷酸钠中的NaCl，pH6.5)以0.6mL/分钟的流速对该柱进行洗涤，并通过使7CV的缓冲液A以1.0mL/分钟的流速通过该柱来重新对其进行平衡。
与(活性)羟基氨基HES衍生物一起保温所获得的样品在220nm下都产生了明显的吸收。与羟基氨基HES 10/0.4和10/0.7一起保温的样品在280nm下没有可检测到的吸收，而与羟基氨基HES 50/0.7和50/0.4一起保温的样品分别产生了800mAU×mL和950mAU×mL的吸收。在洗脱液1中回收了几乎所有的结合的蛋白质，体积为6.5-8.0mL，洗脱液2包含的峰面积小于在280nm下探测的总洗脱峰的峰面积的2％。所有EPO样品的蛋白质回收率相当(约85％)。
通过如前所述的那样使用5mL Vivaspin浓缩器(10,000MW截留值)并在4000rpm下在6℃下进行离心来对HES-修饰的EPO和由适宜的对照保温获得的EPO进行缓冲液交换。将这些样品(1-3mg EPO蛋白)浓缩至0.5-0.7mL并用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(pH7.1)将其稀释至5mL并通过离心将其浓缩10倍。将各样品进行三次浓缩-稀释循环。最后，将这些样品取出并用2×0.5mL PBS对浓缩器部件进行洗涤。将这些样品以约1.2mg/ml的蛋白质浓度在液氮中冷冻。
E)交联化合物的合成E1)O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺(1)的合成 如上文实施例Aa)中描述的那样，化合物(1)是根据D.Boturyn等人，Tetrahedron 53(1997)5485-92，5489-90页的描述进行合成的。E2)1，6-二-氨基氧基-3-甲基戊烷(4)的合成 将20g(82.0mmol)1，5-二溴-4-甲基戊烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)在室温下滴加到36.72g(204.9mmol)内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main，D)和36.7g碳酸钾(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)在140mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中的混悬液中，并将反应混合物搅拌90小时。通过离心除去细小的沉淀，收集澄清的DMF上清液并将其真空浓缩。将粗产物彻底真空干燥，溶解于140mL乙醇(DAB品质，Sonnenberg，Braunschweig，D)中并将其在氮气下与16.2mL(333.3mmol)水合肼(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)一起回流2小时。在真空下除去溶剂和剩余的水合肼，将粗产物混悬于150mL叔丁基甲基醚(MTBE)(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并将其在室温下搅拌1小时。将沉淀滤出，用MTBE进行洗涤并将其弃去。将所收集的滤液真空浓缩并用柱色谱对该产物进行纯化(3％甲醇的二氯甲烷溶液，二者都来自Acros Organics BVBA，Geel，B)，得到38％无色油状物形式的(4)。δH(300；CDCl3)0.89(3H，d，J 6.5)，1.37-1.44(2H，m)，1.55-1.66(3H，m)，3.64-3.71(4H，m)，5.30(4H，s)；δC(75.5MHz；CDCl3)19.7，27.2，35.4，74.3。
E3)2-(2-溴乙氧基)-3a，7a-二氢-异吲哚-1，3-二酮(5)的合成 化合物(5)按照Bauer，L.和Suresh，K.S.，J.Org.Chem.1963，28，1604页的描述由16.3g(100mmol)N-羟基邻苯二甲酰亚胺(Acros OrganicsBVBA，Geel，B)、17.0mL(196.9mmol)1，2-二溴乙烷(Lancaster SynthesisGmbH，Frankfurt/Main，D)和28mL(197.6mmol)三乙胺(Acros OrganicsBVBA，Geel，B)在120mL DMF(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中合成。在通过过滤除去所形成的沉淀后，用800mL水使粗产物沉淀，通过过滤进行收集并用柱色谱对其进行纯化(25％叔丁基甲基醚的石油醚溶液，二者都来自Acros Organics BVBA，Geel，B)，得到7.58g(29％)米白色固体状的(5)。δH(400MHz；CDCl3)3.63(3H，t，J 6.9)，4.46(3H，t，J 6.9)，7.75(2H，dd，J 3.1和5.5)，7.83(2H，dd，J 3.1和5.5)。
E4)2-(6-溴-己氧基)-3a，7a-二氢-异吲哚-1，3-二酮(6)的合成
化合物(6)按照Bauer，L.和Suresh，K.S.，J.Org.Chem.1963，28，1604页的描述由16.3g(100mmol)N-羟基邻苯二甲酰亚胺(Acros OrganicsBVBA，Geel，B)、30.8mL(200mmol)1，6-二溴己烷(Aldrich，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)和28mL(197.6mmol)三乙胺(AcrosOrganics BVBA，Geel，B)在120mL DMF(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中合成。用柱色谱进行纯化(10％叔丁基甲基醚的石油醚溶液，二者都来自Acros Organics BVBA，Geel，B)，得到12.28g(38％)米白色固体状的(6)。δH(400MHz；CDCl3)1.48-1.60(4H，m)，1.77-1.84(2H，m)，1.87-1.93(2H，m)，3.42(2H，t，J 6.8)，4.20(2H，t，J 6.5)，7.71-7.76(2H，m)，7.81-7.85(2H，m)；δC(100.6MHz；CDCl3)24.9，27.9，28.0，32.7，33.7，78.4，123.5，129.1，134.5，163.7。
F)羟基胺交联剂的反应性聚合物-衍生物的制备F1)由交联剂(4)和葡聚糖15-20kD进行的羟基氨基-葡聚糖17.5(A)的合成。
将204mg葡聚糖15-20kD(MW＝15000-20000D，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie，Taufkirchen，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入0.57mmol(4)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并再次通过过滤对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，将其用水透析43.5小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为82％。
F2)由交联剂(4)和HES 10/0.4进行的羟基氨基-HES10/0.4(B)的合成将403mg HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于4mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入4mmol(4)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并再次通过过滤对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，用水透析46小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为52％。
F3)由交联剂(1)和mPEG-NHS酯10kD进行的羟基氨基-PEG10(C)的合成。
将607mgα-甲氧基-PEG-ω-琥珀酰亚胺基酯(MW＝10000D，RappPolymere，Tübingen，D)溶解于6mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入3.2mmol1。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并再次通过过滤对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，用水透析43.5小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为82％。
将200mg该产物溶解于2mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入0.2mmol吗啉(Acros Organics BVBA，Geel，B)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚(AcrosOrganics BVBA，Geel，B)中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中并再次通过过滤对其进行收集。将粗产物溶解于10mL水中，用水透析45小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为79％。
F4)由交联剂(4)和mPEG-NHS酯10kD进行的羟基氨基-PEG10(D)的合成。
将206mg α-甲氧基-PEG-ω-琥珀酰亚胺基酯(MW＝10000D，RappPolymere，Tübingen，D)溶解于6mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入1mmol(4)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并再次通过过滤对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，用水透析43.5小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为86％。
将100mg该产物溶解于2mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入0.2mmol吗啉(Acros Organics BVBA，Geel，B)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚(AcrosOrganics BVBA，Geel，B)中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于10mL水中，用水透析45小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为61％。
F5)由交联剂(4)和被氧化的HES10/0.4进行的羟基氨基HES10/0.4(E)的合成将400mg被氧化的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃下真空加热17小时并将其溶解于4mL无水DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中。向该溶液中加入4mmol(4)。将其在65℃下保温5天后，将反应混合物加入到35mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下离心9小时来收集沉淀出来的细小的产物，将其重新溶解于10mL水中，用水透析47小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。F6)由交联剂(1)和mPEG-醛10kD进行的羟基氨基-PEG10(F)的合成。
将604mg α-甲氧基-PEG-ω-醛(MW＝10000D，Rapp Polymere，Tübingen，D)溶解于6mL 4mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入2.2mmol(1)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物在真空下浓缩，将其重新溶解于6mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)并加入到40mL冰冷的2-丙醇中，将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，用水透析42小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为87％。
F7)由交联剂(4)和mPEG-醛10kD进行的羟基氨基-PEG10(G)的合成。
将200mg α-甲氧基-PEG-ω-醛(MW＝10000D，Rapp Polymere，Tübingen，D)溶解于6mL 4mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.2)中并向其中加入1mmol(4)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL 2-丙醇中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于15mL水中，用水透析43.5小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为60％。
F8)由交联剂(6)和mPEG-硫醇10kD进行的羟基氨基-PEG10(H)的合成。
将300mgα-甲氧基-PEG-ω-硫醇(MW＝10000D，Rapp Polymere，Tbingen，D)溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中并用氮气流除去氧。将该溶液在氮气下加入到0.4mmol (6)和0.44mmol碳酸铯(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中。将其在22℃下搅拌2.5小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中，再次通过离心对其进行收集并将其真空干燥。没有测定所分离出来的产物的收率。
将150mg该粗产物溶解于1.5mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入0.15mmol水合肼(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于10mL水中，用水透析41小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为63％。
F9)由交联剂(5)和mPEG-硫醇10kD进行的羟基氨基-PEG10(I)的合成。
将300mg α-甲氧基-PEG-ω-硫醇(MW＝10000D，Rapp Polymere，Tübingen，D)溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中并用氮气流除去氧。将这种溶液在氮气下加入到0.4mmol(5)和0.44mmol碳酸铯(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中。将其在22℃下搅拌2.5小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中，再次通过离心对其进行收集并将其真空干燥。没有测定所分离出来的产物的收率。
将150mg该粗产物溶解于1.5mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入0.15mmol水合肼(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于10mL水中，用水透析41小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为70％。
F10)由交联剂(1)和被氧化的HES18/0.5进行的羟基氨基HES18/0.5(J)的合成将200mg被氧化的HES18/0.5(MW＝18000D，DS＝0.5)在80℃下真空加热17小时并将其溶解于2mL无水DMSO(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)中。向该溶液中加入2mmol(1)。将其在65℃下保温5天后，将反应混合物加入到20mL冰冷的2-丙醇中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，用42mL冰冷的2-丙醇对其进行洗涤，将其重新溶解于10mL水中，用水透析27小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为72％。
F11)由交联剂(1)和HES10/0.4进行的羟基氨基HES10/0.4(K)的合成将0.8g HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于8mL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中并向其中加入8mmol(1)。将其在22℃下振摇19小时后，将反应混合物在-20℃下加入到40mL 2-丙醇中。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其重新溶解于50mL水中，用水透析45小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为73％。
F12)由交联剂(6)和mPEG-醇5kD进行的羟基氨基-PEG10(L)的合成将1g α-甲氧基-PEG-醇(MW＝5000D，Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)和257mg粉状氢氧化钾(Riedel-de Han，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)在氮气下混悬于10mL无水二甲基亚砜(DMSO)(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中并将反应混合物加热至70℃。向其中加入978mg固体形式的(6)并将该混合物在70℃下搅拌2小时。将所得的溶液加入到200mL叔丁基甲基醚(Acros Organics BVBA，Geel，B)中。将所沉淀出来的树胶状产物用100mL叔丁基甲基醚萃取两次，将其溶解于40mL水中，用水透析47小时(SnakeSldn透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并将其冷冻干燥。所分离出来的产物的收率为98％。
将482mg该粗产物溶解于5mL二氯甲烷(Acros Organics BVBA，Geel，B)中并向其中加入1mmol水合肼(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。将其在22℃下振摇17小时后，将反应混合物加入到40mL叔丁基甲基醚中并将其在-20℃下保温1小时。通过在4℃下进行离心来收集所沉淀出来的产物，将其混悬于15mL叔丁基甲基醚中并通过离心再次对其进行收集。将粗产物溶解于10mL水中并用水透析41小时(SnakeSkin透析管，3.5kD截留值，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)。将其离心17小时，从而除去在透析期间所形成的细小的沉淀。将澄清的上清液冷冻干燥，分离出来的产物的收率为67％。
G)反应性聚合物-衍生物与被氧化的hEPO的接合G1)被氧化的hEPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液是用C1)和C2)中所述的方法获得的。该被氧化的hEPO的终浓度被调至2mg/mL。
G2)用实施例F1)至F12)制得的聚合物进行的EPO缀合物的合成向20μL被氧化的hEPO在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液(如实施例G1那样获得的)中加入20μL醛-反应性聚合物在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)中的溶液并将该溶液在22℃下保温22小时。所用醛-反应性聚合物的浓度如下面表1所示
表1
图3-6的SDS page分析中蛋白质谱带向更高的分子量迁移表明了成功的接合。谱带宽度的增加是由于所用HES-、葡聚糖-和PEG-衍生物的分子量分布和与所述蛋白质相连的聚合物衍生物的数目造成的。与羟基氨基-葡聚糖或羟基氨基-HES衍生物相反，相应的PEG衍生物向凝胶内迁移并且也被染色，因此使得蛋白质谱带的显像复杂化。
附图简要说明图1图1表示根据实施例C4.2)制得的HES-EPO缀合物的SDS page分析。对凝胶电泳而言，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。根据制造商的说明在还原条件下使用10％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(二者都来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
泳道A蛋白标记SeeBluePlus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD泳道B实施例C4.2)(a)的粗反应产物泳道C实施例C4.2)(b)的粗反应产物泳道E实施例C4.2)(d)的粗反应产物泳道F实施例C4.2)(c)的粗反应产物泳道G实施例C2)的被氧化的EPO。
图2图2表示根据实施例C3)制得的HES-EPO缀合物的SDS page分析。对于凝胶电泳而言，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。根据制造商的说明在还原条件下使用10％ Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(二者都来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
泳道A蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道B被氧化的hEPO与如实施例Aa)所述那样制得的聚合物衍生物接合后的粗产物。
泳道C被氧化的hEPO与如实施例Ab)所述那样制得的聚合物衍生物接合后的粗产物。
泳道D被氧化的hEPO与如实施例B)所述那样制得的聚合物衍生物接合后的粗产物。
泳道E反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
泳道F如实施例Aa)所述那样制得的聚合物衍生物。
泳道G如实施例Ab)所述那样制得的聚合物衍生物。
图3-6图3-6各自表示按照实施例G制得的HES-EPO缀合物的SDS page分析。对于凝胶电泳而言，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。根据制造商的说明在还原条件下使用10％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(二者都来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
图3泳道A蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道B被氧化的hEPO与聚合物衍生物A接合后的粗产物。
泳道C聚合物衍生物A。
泳道D被氧化的hEPO与聚合物衍生物B接合后的粗产物。
泳道E聚合物衍生物B。
泳道F被氧化的hEPO与聚合物衍生物C接合后的粗产物。
泳道G聚合物衍生物C。
泳道H被氧化的hEPO与聚合物衍生物D接合后的粗产物。
泳道I聚合物衍生物D。
泳道K反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
图4泳道A蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道B被氧化的hEPO与聚合物衍生物H接合后的粗产物。
泳道C聚合物衍生物H。
泳道D被氧化的hEPO与聚合物衍生物I接合后的粗产物。
泳道E聚合物衍生物I。
泳道F被氧化的hEPO与聚合物衍生物E接合后的粗产物。
泳道G聚合物衍生物E。
泳道K反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
图5泳道A蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道B被氧化的hEPO与聚合物衍生物F接合后的粗产物。
泳道C聚合物衍生物F。
泳道D反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
泳道E聚合物蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道F被氧化的hEPO与聚合物衍生物G接合后的粗产物。
泳道G聚合物衍生物G。
泳道K反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
图6泳道A蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道B被氧化的hEPO与聚合物衍生物M接合后的粗产物。
泳道C聚合物衍生物M。
泳道D被氧化的hEPO与聚合物衍生物J接合后的粗产物。
泳道E聚合物衍生物J。
泳道F被氧化的hEPO与聚合物衍生物K接合后的粗产物。
泳道G聚合物衍生物K。
泳道H反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
泳道I蛋白标记Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)从顶部到底部的分子量标记200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。
泳道J被氧化的hEPO与聚合物衍生物L接合后的粗产物。
泳道K聚合物衍生物L。
泳道L反应对照没有聚合物衍生物的hEPO。
权利要求
1.式I的官能团化的聚合物，“聚合物”-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(I)其中的符号具有下面的含义“聚合物”为选自亚烷基二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖的可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物；R1、R2、R3、R4、R5为氢、烷基、芳基；m为2至4，其中在m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20；o为0至20，其中在n＝0的情况中，o不是0，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；r为0或1；X为-(CR8R9)pO-、-(CR8R9)pS-、-(CR8R9)pNR6-、-(CR8R9)pOC(O)-、-(CR8R9)pC(O)O-、-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-、-(CR8R9)pN(R11)O-、 其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)；G为S、O、NR14；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基，p为0至20，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；其中基团-(X)r-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5与“聚合物”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连。
2.如权利要求1所述的官能团化的聚合物，其中X是 -(CR8R9)pN(R11)O-或-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-。
3.如权利要求1或2所述的官能团化的聚合物，其中所说的聚合物是羟烷基淀粉、葡聚糖或乙二醇均聚物。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的官能团化的聚合物，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2OCH2CH2-。
5.式II的缀合物 其中的符号具有下面的含义“聚合物”为选自亚烷基二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖的可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物；R1、R2、R3、R4为氢、烷基、芳基；m为2至4，其中在m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20；o为0至20，其中在n＝0的情况中，o不是0，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；r为0或1；X为-(CR8R9)pO-、-(CR8R9)pS-、-(CR8R9)pNR6-、-(CR8R9)pOC(O)-、-(CR8R9)pC(O)O-、-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-、-(CR8R9)pN(R11)O-、 其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)；G为S、O、NR14；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基，优选氢，p为0至20，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；R13为氢、烷基、芳基；“蛋白质”为通过至少2个氨基酸的反应制得的氨基酸序列其中基团 与“聚合物”和“蛋白质”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中X是 -(CR8R9)pN(R11)O-或-(CR8R9)pC(G)N(R10)O-。
7.如权利要求5或6所述的缀合物，其中所说的聚合物是羟烷基淀粉、葡聚糖或乙二醇均聚物。
8.如权利要求5至7中任意一项所述的缀合物，其中所说的“蛋白质”选自EPO、G-CSF、第VII因子、第IX因子、IFNβ、AT III、A1AT、第VIII因子和APC。
9.如权利要求5至8中任意一项所述的缀合物，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2OCH2CH2-。
10.一种制备官能团化的聚合物的方法，其包括将式III的聚合物“聚合物”-(CR8R9)p-Y(III)与式IV的化合物进行反应的步骤，Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)，其中的符号具有下面的含义“聚合物”为选自亚烷基二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖的可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物；R1、R2、R3、R4、R5为氢、烷基、芳基；m为2至4，其中m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20；o为0至20，其中在n＝0的情况中，o不是0，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；Y和Q为适于彼此进行反应从而给出如下连接基团之一的官能团-O-、-S-、-NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-C(G)N(R10)O-、-N(R11)O-、 其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)；G为S、O、NR14；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基；p为0至20，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；其中基团-(CR8R9)p-Y与“聚合物”的末端基团或位于中间的基团共价相连。
11.如权利要求10所述的方法，其中Y和Q是适于彼此进行反应从而给出如下连接基团的官能团 -N(R11)O-或-C(G)N(R10)O-。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所说的聚合物是羟烷基淀粉、葡聚糖或乙二醇均聚物。
13.如权利要求10至12中任意一项所述的方法，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2OCH2CH2-。
14.可以用权利要求10至13中任意一项所述的方法获得的官能团化的聚合物。
15.制备缀合物的方法，其包括将如权利要求1至4或14中任意一项所述的官能团化的聚合物与式V的官能团化的蛋白质进行反应的步骤，“蛋白质”-Z(V)其中Z是包含羰基的基团或者适于形成羰基的基团或者可以与官能团化的聚合物反应的另外的基团，其中Z与“蛋白质”的至少一个末端基团或至少一个位于中间的基团共价相连。
16.如权利要求15所述的方法，其中使用如权利要求2至4中任意一项所述的官能团化的聚合物。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中的“蛋白质”选自EPO、G-CSF、第VII因子、第IX因子、IFNβ、AT III、A1AT、第VIII因子和APC。
18.制备缀合物的方法，其包括的步骤有a)将式III的聚合物“聚合物”-(CR8R9)p-Y(III)与式IV的化合物进行反应，Q-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-ONHR5(IV)其中的符号具有下面的含义“聚合物”为选自亚烷基二醇均聚物、亚烷基二醇共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸和多糖的可溶性直链或支链的均聚物或无规共聚物以及其衍生物；R1、R2、R3、R4、R5为氢、烷基、芳基；m为2至4，其中m个基团CR1R2中的残基R1和R2可以相同或不同；n为0至20；o为0至20，其中在n＝0的情况中，o不是0，其中在o个基团CR3R4中的残基R3和R4可以相同或不同；Y和Q为适于彼此进行反应从而给出如下连接基团之一的官能团-O-、-S-、-NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-C(G)N(R10)O-、-N(R11)O-、 其中一个或多个基团-(CR8R9)-可以被W替换，从而形成一种化学上合理的基团；W为O、NR12、C(G)；G为S、O、NR14；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R14为氢、烷基、芳基；p为0至20，其中在p个基团CR8R9中的残基R8和R9可以相同或不同；其中基团-(CR8R9)p-Y与“聚合物”的至少一个末端基团和/或至少一个位于中间的基团共价相连，由此得到一种官能团化的聚合物，和b)将步骤a)中获得的官能团化的聚合物与式V的官能团化的蛋白质进行反应，“蛋白质”-Z(V)其中Z是包含羰基的基团或者适于形成羰基的基团或者可以与官能团化的聚合物反应的另外的基团，其中Z与“蛋白质”的至少一个末端基团和/或至少一个位于中间的基团共价相连。
19.可以用权利要求15至18中任意一项所述的方法获得的缀合物。
20.用于人或动物体的治疗方法中的如权利要求5至9或19中任意一项所述的缀合物。
21.包含治疗有效量的如权利要求5至9或19中任意一项所述的缀合物的药物组合物。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其还包含至少一种可药用的稀释剂、助剂或载体。
23.如权利要求1至3中任意一项所述的官能团化的聚合物，其中o为2至20。
24.如权利要求1至3中任意一项所述的官能团化的聚合物，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2(CH3)CH2CH2-。
25.如权利要求5至8中任意一项所述的缀合物，其中o为2至20。
26.如权利要求5至8中任意一项所述的缀合物，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2(CH3)CH2CH2-。
27.如权利要求10至12中任意一项所述的方法，其中o为2至20。
28.如权利要求10至12中任意一项所述的方法，其中基团-[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-是-CH2CH2(CH3)CH2CH2-。
29.可以用如权利要求27或28所述的方法获得的官能团化的聚合物。
30.如权利要求15或17所述的方法，其中将如权利要求23、24或29中任意一项所述的官能团化的聚合物与式V的官能团化的蛋白质进行反应。
31.如权利要求18所述的方法，其中o为2至20。
32.可以用如权利要求30所述的方法获得的缀合物。
33.用于人或动物体的治疗方法中的如权利要求25、26或32中任意一项所述的缀合物。
34.包含治疗有效量的如权利要求25、26或32中任意一项所述的缀合物的药物组合物。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其还包含至少一种可药用的稀释剂、助剂或载体。
全文摘要
本发明涉及被氨基氧基官能团化的聚合物或其衍生物、其中所说的官能团化的聚合物与蛋白质通过肟连接基团共价相连的缀合物、制备所说官能团化的聚合物的方法、制备所说缀合物的方法、可以用本发明的方法获得的官能团化的聚合物、可以用本发明的方法获得的缀合物和包含至少一种本发明的缀合物的药物组合物以及所说的缀合物和组合物用于对人或动物体进行治疗的应用。
文档编号C07K14/505GK1863549SQ200480029522
公开日2006年11月15日 申请日期2004年8月6日 优先权日2003年8月8日
发明者K·佐默迈尔, R·弗兰克, N·桑德尔 申请人:费森尤斯卡比德国有限公司