专利名称：一种利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种周期脉动磁场发生装置。
背景技术：
在后基因组时代，蛋白质结构和功能的研究是必然趋势。X射线单晶衍射技术作为最重要的技术，已经解析了蛋白质结构数据库中其中88.0%以上的蛋白质结构，而生长高质量的蛋白质单晶一直是制约此技术的瓶颈问题。因此人们一直致力于研究蛋白质结晶方法学，期望通过研发多种方法来提高结晶条件筛选成功率和获得高质量的蛋白质单晶，有效解决此技术中的瓶颈问题。目前已经研究发了许多方法，积累了许多成功经验。磁场下的蛋白质结晶为解决此技术中的瓶颈问题提供了一条新的思路和方法。如磁场下溶液扩散系数增大、表观粘度增加、带电粒子分布变化、自然对流减少或抵消。再如，磁场中抗磁物质的磁化力能平衡一部分重力，达到模拟失重、甚至是微重力的状态，一定程度上减弱了对流，生长速度缓慢而提高晶体质量。但是，目前蛋白质结晶领域内涉及的磁场几乎全部是静磁场，包括均一性静磁场和大梯度强磁场。而持续变化的动态磁场对蛋白质结晶的影响尚无文献报道。因此，需要发明一种便捷的动态磁场模型——周期脉动磁场来研究对蛋白质结晶的影响。周期脉动磁场条件下，结晶液及蛋白质分子的电荷性质、电荷量，洛伦兹力、磁化力与重力的大小与方向等可能发生一系列变化；并且在竖直方向上周期脉动磁场也可能影响HEWL分子运动、小晶核与晶核沉降过程。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，通过系统地研究周期脉动磁场下蛋白质结晶的特点，建立一种基于周期脉动磁场的结晶方法，提高蛋白质的结晶成功率和晶体质量，为利用X射线单晶衍射技术解析蛋白质结构中的瓶颈问题提供新的解决途径。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:包括容器、旋转盘、电动机和样品支架台，所述容器的内部温度控制在0 60°C，该容器内部安装了两个旋转盘，所述的两个旋转盘能够通过电动机驱动，绕旋转轴同步转动，其中一个旋转盘上远离旋转轴端安装有永磁铁，样品分别通过样品支架台固定在两个旋转盘的旋转投影面内。所述的样品支架台上固连有弧形支架，每个弧形支架上均匀排布通孔，若干个弧形支架围合后，其上的通孔能够排列成一个围绕旋转轴且与旋转轴同轴的圆环，每个通孔侧壁上开缝作为注入口。所述通孔的两端用结晶胶带密封，注入口用真空脂密封，形成了无空气的、无气泡的结晶密闭体系，注入蛋白质结晶溶液后作为Batch培养皿。所述通孔的下端用结晶胶带密封，形成承载面放置杯状皿，密封后的杯状皿作为悬滴法和MicroBatch法的晶体培养皿。
本发明的有益效果是:1、由于采用了永磁铁，没有产生额外热量，发生装置温度稳定；2、由于采用了“永磁铁旋转-样品静止”的模式，实现了动态变化的磁场，也实现了样品稳定无振动的无干扰条件；3、由于实验组和对照组在同一个容器内，磁场强度和转速都稳定可调，实现了周期脉动磁场单因素影响作用。利用该装置开展实验，如蛋白质结晶实验，样品为溶菌酶蛋白质结晶溶液，发现周期脉动磁场促进气相扩散，提高结晶成功率，使晶体发生〈101〉面定向，且Batch皿上底面、下底面的晶体存在差异定向率。
图1是周期脉动磁场发生装置示意图，其中，图1 (a)为侧视图，图1 (b)为俯视图；图2是注入式弧形支架培养皿示意图，其中，图2 (a)和图2 (b)为不同通孔数量的不意图；图中，1-永磁铁；2_电动机；3_传送带；4-容器；5_弧形支架式培养皿；6_样品支架台；7-旋转轴；8_通孔；9_注入口。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。本发明涉及一种周期脉动磁场发生装置，并设计了配套的蛋白质结晶装置，应用该装置能长时间持续、稳定地影响蛋白质结晶过程。本发明首次将周期脉动磁场应用到蛋白质结晶领域。可以实现磁场周期性变化的现有技术包括:脉冲(超导)磁体、电磁体等，但在持续时间、使用成本等方面存在一定的问题。本发明技术成本低，周期调控灵活，持续时间无限制等优势。为了获得持续、稳定的周期脉动磁场，并满足“磁场运动-待磁化物质静止”的模式和周期脉动磁场单因素实验条件，克服电磁铁易产热、结构复杂、成本高等不足，本发明选用旋转运动或往复运动的永磁铁，实验了在一定位置上拥有周期脉动磁场的特殊物理环境，用于各种科学研究，如蛋白质结晶、医疗、化学、物理、材料等。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一个内部温度控制在0 60°C容器，该容器内部分别安装了含有永磁铁的旋转盘(作为实验组)和没有磁铁的旋转盘(作为对照组)，底部分别对应安装了样品支架台。2个旋转盘通过电动机带动同步旋转，在实验组样品附近形成周期脉动磁场，其中匀强磁场强度可固定也可调节，转速可固定也可调节；对照组除了没有周期脉动磁场外，其他环境与实验组相同。样品支架台提供放置样品的位置。样品为溶液、生物试剂、细胞、化学药品、新型材料等，包括蛋白质结晶溶液。针对于周期脉动磁场发生装置，设计了配套的蛋白质结晶培养皿，包括注入式的弧形支架培养皿和“杯状皿+弧形支架”培养皿。支架上均匀排布通孔，每个通孔侧壁上有一细缝作为注入口。用结晶胶带等密封用的材料密封通孔的两端，用真空脂等胶状物密封注入口，形成了无空(隙)气的、无气泡的结晶密闭体系，注入蛋白质结晶溶液后作为Batch培养皿。用结晶胶带等密封用的材料密封支架的一端，形成承载面放置杯状皿，密封后的杯状皿作为悬滴法和MicroBatch法的晶体培养皿。支架培养皿和杯状皿易清洗，可重复使用。所述的永磁铁包括天然磁石、铁氧体、钕铁硼、铝镍钴、钐钴、铜镍铁、铁钴钥、铁钴钥；、猛秘等磁铁。所述电动机包括同步电动机和异步电动机、交流电机和直流电机等。所述的蛋白质结晶溶液是指拟研究的活性蛋白质在缓冲液(即维持溶液pH值的溶液，如由二甲砷酸钠、或醋酸和醋酸钠配制的特定的pH值的溶液)的液体，或者蛋白质与沉淀剂(即可促使蛋白质结晶的各种化学试剂，如各种盐、有机小分子及其混合物等)的混合后的液体，在条件适宜时，溶液中可析出晶体，实现蛋白质结晶。本发明工作时包括以下步骤:a.设置周期脉动磁场发生装置:接通电源，选择一定转速和磁场强度，设置所需温度。b.配制样品:打开容器顶盖，将样品分别放置在实验组和对照组的样品支架台上，固定后关闭容器顶盖。c.起动装置:电动机转动，实验组即实现了周期脉动磁场，对照组没有周期脉动磁场。一定时间后，回收样品，观察实验结果。实施例1:周期脉动磁场促进气相扩散第一步:设置周期脉动磁场发生装置。设置20°C，旋转转速300rpm，调节磁场强度
0.78T。第二步:配制蛋白质结晶溶液。将Seikagaku公司的货号为E05801的鸡蛋清溶菌酶冻干粉(Hen’s Egg-White Lysozyme ),溶于 HAC-NaAC 缓冲液(0.1M, pH4.60),制得不同浓度的溶菌酶溶液，分别为40、60、80mg/ml。用该缓冲液溶解NaCl制得沉淀剂溶液，浓度为60mg/ml。不同浓度的溶菌酶溶液与同一浓度沉淀剂按体积等比例混匀，制得蛋白质结晶溶液。第三步:结晶。结晶方法为常用的悬滴法，应用“杯状皿+弧形支架”培养皿。支架的一面用结晶胶带密封，将杯状皿牢固地粘附在支架上。将真空脂涂抹在杯状皿上端。用自动或手动移液器注入60 ii I NaCl沉淀剂至杯状皿,作为池液。用电动移液器将2 Ul结晶溶液滴至硅化后的盖玻片，并将该盖玻片反扣在杯状皿上端，轻压至密封。分别逐个将支架放置在实验组和对照组的支架台上，并固定。起动周期脉动磁场发生装置。培养晶体。2天后回收杯状皿和支架，观察实验结果。结果如下:实验组的盖玻片内侧悬挂许多液化后的小液滴，2 U I结晶液滴体积显著增大，结晶液滴吸收来自池液的水蒸气后饱和度反而降低，没出长出晶体。对照组的盖玻片没有明显的小液滴，2iU结晶液滴体积减小，长出晶体。由此说明:周期脉动磁场促进了自下而上的气相扩散(注:标准的悬滴法气相扩散方向为自上而下)。实施例2:周期脉动磁场提高结晶成功率第一步:设置周期脉动磁场发生装置。设置20°C，旋转转速300rpm，调节磁场强度
0.78T。
第二步:配制蛋白质结晶溶液。将Seikagaku公司的货号为E05801的鸡蛋清溶菌酶冻干粉溶于HAC-NaAC缓冲液(0.1M，pH4.60)，制得溶菌酶溶液(20mg/ml)。用该缓冲液溶解NaCl制得沉淀剂溶液(60mg/ml)。将溶菌酶溶液与沉淀剂按体积等比例混匀，制得蛋白质结晶溶液。第三步:结晶。结晶方法为MicroBatch法，应用“杯状皿+弧形支架”培养皿。支架的一面用结晶胶带密封，将杯状皿牢固地粘附在支架上。将真空脂涂抹在杯状皿上端。用电动移液器将2iU结晶溶液滴在杯状皿底部，硅化后的盖玻片上粘附相同成分、相同质量的干燥剂，并将该盖玻片反扣在杯状皿上端，轻压至密封。分别逐个将支架放置在实验组和对照组的支架台上，并固定。起动周期脉动磁场发生装置。培养晶体。2天后回收杯状皿和支架，观察实验结果。结果如下:实验组结晶成功率为87.5%，对照组结晶成功率为37.5%。由此可知，周期脉动磁场通过促进气相扩散，提高了结晶溶液的过饱和度，进而提高了结晶成功率。实施例3:周期脉动磁场使晶体发生〈101〉面定向，且定向率有差异第一步:设置周期脉动磁场发生装置。设置4°C，旋转转速300rpm，调节磁场强度
0.85T。第二步:配制蛋白质结晶溶液。将Seikagaku公司的货号为E05801的鸡蛋清溶菌酶冻干粉溶于HAC-NaAC缓冲液(0.1M，pH4.60)，制得溶菌酶溶液(25mg/ml)。用该缓冲液溶解NaCl制得沉淀剂溶液(60mg/ml)。将溶菌酶溶液与沉淀剂按体积等比例混匀，制得蛋白质结晶溶液。第三步:结晶。结晶方法为无空气的Batch法，应用注入式的弧形支架培养皿。支架的2个面用结晶胶带密封，形成均匀排布的Batch皿。用一次性Iml注射器吸取一定量结晶溶液，然后注入到Batch皿。用真空脂密封注入口，整个Batch皿中没有气泡。分别逐个将支架放置在实验组和对照组的支架台上，并固定。起动周期脉动磁场发生装置。培养晶体。2天后回收支架，观察实验结果。结果如下=Batch皿的上底面和下底面都长出晶体，实验组和对照组的晶体数量没有显著差异，晶体形貌没有显著差异。俯视Batch皿下底面，实验组的晶体大多数沿磁场方向、呈〈101〉面向向排列，对照组晶体排列无序；俯视Batch皿上底面，实验组和对照组晶体排列无明显差异。晶体定向率从大到小依次为:实验组下底面 > 实验组上底面 对照组上底面 > 对照组下底面。
权利要求
1.一种利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，包括容器、旋转盘、电动机和样品支架台，其特征在于:所述容器的内部温度控制在O 60°C，该容器内部安装了两个旋转盘，所述的两个旋转盘能够通过电动机驱动，绕旋转轴同步转动，其中一个旋转盘上远离旋转轴端安装有永磁铁，样品分别通过样品支架台固定在两个旋转盘的旋转投影面内。
2.根据权利要求1所述的利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，其特征在于:所述的样品支架台上固连有弧形支架，每个弧形支架上均匀排布通孔，若干个弧形支架围合后，其上的通孔能够排列成一个围绕旋转轴且与旋转轴同轴的圆环，每个通孔侧壁上开缝作为注入口。
3.根据权利要求2所述的利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，其特征在于:所述通孔的两端用结晶胶带密封，注入口用真空脂密封，形成了无空气的、无气泡的结晶密闭体系，注入蛋白质结晶溶液后作为Batch培养皿。
4.根据权利要求2所述的利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，其特征在于:所述通孔的下端用结晶胶带密封，形成承载面放置杯状皿，密封后的杯状皿作为悬滴法和MicroBatch法的晶体培养皿。
全文摘要
本发明提供了一种利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置，包括容器、旋转盘、电动机和样品支架台，其特征在于所述容器的内部温度控制在0～60℃，该容器内部安装了两个旋转盘，所述的两个旋转盘能够通过电动机驱动，绕旋转轴同步转动，其中一个旋转盘上远离旋转轴端安装有永磁铁，样品分别通过样品支架台固定在两个旋转盘的旋转投影面内。本发明发生装置温度稳定，实现了动态变化的磁场，也实现了样品稳定无振动的无干扰条件，实现了周期脉动磁场单因素影响作用。
文档编号G01N27/72GK103207232SQ201310077129
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者尹大川, 解旭卓, 樊艳婷, 曹慧玲 申请人:西北工业大学