专利名称：一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法
技术领域：
本发明涉及胰蛋白酶检测技术领域，特别涉及一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法。
背景技术：
胰蛋白酶是胰液的一种成分,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶。作为一种肽链内切酶，它能够切断多肽链中赖氨酸与精氨酸残基中的羟基侧。胰蛋白酶是一种重要的蛋白质消化酶，能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶。它在医药、食品、生化研究中有着广泛的应用。另外，胰蛋白酶的含量也是胰腺类相关疾病的临床诊断的一个重要标志物。因此，胰蛋白酶的定量检测对于人体健康、生产质量控制等领域有着重要的作用。现在常见的检测胰蛋白酶的方法有荧光光度法、电化学法、石英晶体微量天平传感器等。上述方法大多需要大型、较昂贵设备的支持，检测成本较高，不适合常规的分析检测，因此需要发展一种简单、成本低又灵敏的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测胰蛋白酶的即简单又灵敏的方法，本发明所述方法对胰蛋白酶含量的检测选择性强。本发明提供一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法，包括以下步骤:步骤一，利用表面修饰剂和还原剂合成多肽修饰的银纳米颗粒；步骤二，检测多肽修饰的银纳米颗粒的紫外-可见光谱；步骤三，将胰蛋白酶与合成的银纳米颗粒进行显色反应；步骤四，显色反应终点再检测反应产物的紫外-可见光谱；步骤五，计算合成的纳米材料的吸光值峰值与反应产物的吸光值峰值的差值，根据差值与预定的标准曲线比对，得到胰蛋白酶的含量。优选的，所述多肽包含赖氨酸，且所述多肽至少一个末端为半胱氨酸，其浓度为
0.1 u M-5 u M0优选的，所述利用表面修饰剂和还原剂将多肽与银离子合成银纳米颗粒还包括以下步骤:a、将表面修饰剂于银离子可溶性盐溶液混合，进行电磁搅拌；b、将还原剂加入上述混合溶液中，反应得到表面修饰剂修饰的水溶性银纳米颗粒;C、将多肽分子与银纳米颗粒溶液混合，进行搅拌，通过半胱氨酸侧链的巯基共价连接到银纳米颗粒表面。优选的，所述的表面修饰剂可选择巯基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵、朽1檬酸三钠中的任一种。优选的，所述的银离子的可溶性盐可选择氟化银，硝酸银，高氯酸银中的任一种或混合物。优选的，所述的还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一种。本发明提供一种胰蛋白酶含量的检测方法，包括以下步骤:检测多肽修饰的银纳米颗粒的紫外-可见光谱；将胰蛋白酶与合成的银纳米颗粒进行显色反应；显色反应终点再检测反应产物的紫外-可见光谱；计算合成的纳米材料的吸光值峰值与反应产物的吸光值峰值的差值，根据差值与预定的标准曲线比对，得到胰蛋白酶的含量。本发明提供的方法以银纳米颗粒为检测手段，所述银纳米颗粒包含多肽和银离子，利用胰蛋白酶使银纳米颗粒空间分布的变化导致吸光度的变化的性质，采用显色反应和紫外-可见光谱对胰蛋白酶的含量进行检测。胰蛋白酶通过作用于附着在银纳米颗粒上的多肽使银纳米颗粒的空间分布发生变化，从而使反应产物出现颜色变化。本发明的有益效果是，本发明的银纳米颗粒对于可见光范围的光具有非常强的吸收，对胰蛋白酶具有非常灵敏的选择性相应。此外，本发明所用银纳米颗粒制备方法简单，常温下即可进行，成本低，测定简便快捷。本发明所述比色法是一种非常简便的分析方法，通过比色法中所述显色反应可以用肉眼直接判断出反应是否停止，即可准确判断反应终点，操作简单。本发明所述的比色法对胰蛋白酶具有高灵敏的选择性响应，最低检测浓度达到2ng/mL。本发明提供的检测方法无须进行复杂的化学修饰或信号标记，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对胰蛋白酶的检测，适于在临床应用，如胰腺炎等疾病的诊断。
图1是本发明制备的银纳米颗粒在不同蛋白质存在时的吸光度变化图。图2是本发明实施例中制备的银纳米颗粒在加入胰蛋白酶前后的吸收光谱图对比。图3是本发明实施例中预定的标准曲线。
具体实施例方式本发明提供一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法，包括以下步骤:步骤一，利用表面修饰剂和还原剂将合成多肽修饰的银纳米颗粒；步骤二，检测多肽修饰的银纳米颗粒的紫外-可见光谱；步骤三，将胰蛋白酶与合成的银纳米颗粒进行显色反应；步骤四，显色反应终点再检测反应产物的紫外-可见光谱；步骤五，计算合成的纳米材料的吸光值峰值与反应产物的吸光值峰值的差值，根据差值与预定的标准曲线比对，得到胰蛋白酶的含量。胰蛋白酶是胰液的一种成分，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶。作为一种肽链内切酶，它能够切断多肽链中赖氨酸与精氨酸残基中的羟基侧。胰蛋白酶是一种重要的蛋白质消化酶，能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶。它在医药、食品、生化研究中有着广泛的应用。本发明提供的方法以银纳米颗粒为检测手段，所述银纳米颗粒包含多肽和银，利用胰蛋白酶使银纳米颗粒空间分布的变化导致吸光度的变化的性质，采用显色反应和紫外-可见光谱对胰蛋白酶的含量进行检测。本发明所述利用表面修饰剂和还原剂将多肽与银离子合成银纳米颗粒还包括以下步骤:a、将表面修饰剂于银离子可溶性盐溶液混合，进行电磁搅拌；b、将还原剂加入上述混合溶液中，反应得到表面修饰剂修饰的水溶性银纳米颗粒;C、将多肽分子与银纳米颗粒溶液混合，进行搅拌，通过半胱氨酸侧链的巯基共价连接到银纳米颗粒表面。本发明所述银纳米颗粒具有独特的光学性质:摩尔吸光系数大，并且局部表面等离子光谱与银纳米颗粒间的距离相关。本发明所述，当银纳米颗粒与待测样品混合后，在待测样品中存在的胰蛋白酶的催化作用下，多肽发生断裂，残留在银纳米颗粒表面的多肽电性与银纳米颗粒表面的电性相反，起到中和作用，因此银纳米颗粒之间的静电排斥力削弱，从而银纳米颗粒出现聚集的现象，使得银纳米颗粒的局域表面等离子体共振光谱发生变化，从而可以通过该光谱分析银纳米颗粒的微观结构特性，实现对胰蛋白酶的定量分析。在本发明中，所述多肽包含氨基酸数量优选为2 50个，含氨基酸数量更优选为3 20个，多肽包含氨基酸数量决定着银纳米颗粒的空间结构的复杂程度，越短的多肽链越容易被胰蛋白酶水解，达到检测胰蛋白酶浓度的目的；所述多肽包含氨基酸种类优选为赖氨酸，且所述多肽至少一个末端为半胱氨酸，其浓度为0.1 μ Μ-5 μ Mo所述的银离子的可溶性盐优选为氟化银，硝酸银，高氯酸银中的任一种或混合物，更优选为硝酸银，因为硝酸银是实验室条件下最常见的银离子的可溶性盐；所述的表面修饰剂优选为巯基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵、柠檬酸三钠中的任一种，更优选为柠檬酸三钠，柠檬酸三钠为无机盐，较其他表面修饰剂化学性质稳定，容易存放，价格低；所述的还原剂优选为硼氢化钠、抗坏血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一种。得到混合溶液以后，本发明将所述混合溶液置于20°C 100°C的温度下并搅拌，使所述银离子与所述多肽进行初步反应，所述反应的时间优选为30分钟 480分钟，所述显色反应时间为I分钟 30分钟。本发明对所述搅拌没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可，所述步骤a中电磁搅拌的目的是使表面修饰剂可以修饰于银离子表面，步骤c中搅拌的目的是让反应更充分，也减少了反应时间。得到银纳米颗粒后，检测得到银纳米颗粒的紫外-可见光谱，本发明对所述银纳米颗粒的紫外-可见光谱检测方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的紫外-可见光谱法即可。在本发明中，优选将所述银纳米颗粒置于室温，静置后测定其吸光度值。本发明对所述银纳米颗粒水溶液的浓度没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的银纳米颗粒水溶液的浓度即可，所述测定的可见光波长优选为300nm 500nm,更优选为350nm 450nmo
得到银纳米颗粒后，本发明将胰蛋白酶与银纳米颗粒混合，得到混合溶液，进行反应得到反应产物，检测所述反应产物的紫外-可见光谱。本发明所述检测方法，所述胰蛋白酶与银纳米颗粒混合溶液中，银纳米颗粒与胰蛋白酶发生反应，具体为在胰蛋白酶的催化作用下，多肽发生断裂，残留在银纳米颗粒表面的多肽电性与银纳米颗粒表面的电性相反，起到中和作用，因此银纳米颗粒之间的静电排斥力削弱，从而使银纳米颗粒发生聚集，银纳米颗粒空间分布上的变化导致出现显色反应，得到胰蛋白酶与银纳米颗粒的反应产物后，根据显色反应终点，检测所述反应产物的紫外-可见光谱。本发明对所述反应产物紫外-可见光谱的检测方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的紫外-可见光谱的测定方法即可，在本发明中，所述反应产物的紫外-可见光谱的测定与上述技术方案中检测银纳米颗粒的紫外-可见光谱的过程相同。根据上述技术方案得到反应产物的紫外-可见光谱后，本发明计算所述银纳米颗粒的紫外-可见光谱的峰值与所述反应产物的紫外-可见光谱峰值的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。在本发明中，所述标准曲线优选按照以下方法获得:检测得到银纳米颗粒的紫外-可见光谱；将用待测样品配置的胰蛋白酶的标准溶液与银纳米颗粒反应，得到反应产物，检测所述反应产物的紫外-可见光谱；计算所述银纳米颗粒的紫外-可见光谱的峰值与所述反应产物的紫外-可见光谱的峰值的差值，根据所述差值与胰蛋白酶标准溶液的浓度，得到标准曲线。在本发明中，获得标准曲线中对银纳米颗粒紫外-可见光谱的检测方法与上述技术方案中所述检测银纳米颗粒紫外-可见光谱的过程相同。本发明将胰蛋白酶的标准溶液与银纳米颗粒反应，得到反应产物，检测所述反应产物的紫外-可见光谱。根据每次检测样品的不同要绘制不同的标准曲线，本发明对所述胰蛋白酶标准溶液的配制没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的胰蛋白酶标准溶液的配制方案即可。在本发明中，根据上述技术方案得到胰蛋白酶标准溶液与银纳米颗粒的反应产物后，本发明检测所述反应产物的紫外-可见光谱，得到银纳米颗粒与胰蛋白酶标准溶液的反应产物的紫外-可见光谱。本发明所述检测反应产物紫外-可见光谱的过程与上述技术方案中对胰蛋白酶与银纳米颗粒反应产物的紫外-可见光谱的检测过程相同。根据上述技术方案得到银纳米颗粒与所述反应产物的紫外-可见光谱后，计算得到所述银纳米颗粒的紫外-可见光谱的峰值与所述反应产物的紫外-可见光谱的的峰值的差值，根据所述胰蛋白酶标准溶液的质量浓度与其对应的差值，得到标准曲线。在本发明中，以所述胰蛋白酶标准溶液质量浓度为横坐标，以所述银纳米颗粒的紫外-可见光谱的峰值与所述反应产物的紫外-可见光谱的峰值的差值为纵坐标，绘制得到标准曲线。得到标准曲线后，根据所述标准曲线与上述技术方案得到的银纳米颗粒的紫外-可见光谱的峰值与胰蛋白酶的紫外-可见光谱的峰值的差值，得到胰蛋白酶的含量。为了进一步说明本发明，以下结合实施例和附图对本发明提供的胰蛋白酶含量的检测方法进行详细描述，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施，但不能将他们理解为对本发明保护范围的限定。如图2所示
实施例1:a、将硝酸银水溶液与柠檬酸三钠溶液混合成IOOmL溶液，终浓度均为0.25mM,并进行电磁搅拌；b、将3mLNaBH4 (IOmM)溶液加入到上述溶液中，常温下搅拌，反应30分钟，得到水溶性银纳米颗粒。c、0.2μM含3个氨基酸的多肽与银纳米颗粒混合，24小时后，将未共价吸附在银纳米颗粒表面的多肽通过离心法去除。d、将上述溶液与含有胰蛋白酶的待测溶液混合，显色反应10分钟后观察颜色，并记录吸收光谱。本实施例中显色反应混合溶液由黄色逐渐变为无色；根据图2得到的银纳米颗粒的吸光度值峰值、反应产物的吸光度值峰值分别为0.45,1.40，计算得到两者的差值是
0.95，根据图3得到待测样品胰蛋白酶含量为285ng/mL。实施例2:a、将硝酸银水溶液与柠檬酸三钠溶液混合成IOOmL溶液，终浓度均为0.25mM,并进行电磁搅拌；b、将3mLNaBH4 (IOmM)溶液加入到上述溶液中，常温下搅拌，反应30分钟，得到水溶性银纳米颗粒。(:、0.2 4]\1含3个氨基酸的多肽与银纳米颗粒混合，24小时后，将未共价吸附在银纳米颗粒表面的多肽通过离心法去除。d、将上述溶液与含有碱性磷酸酶ALP待测溶液混合，显色反应10分钟后观察颜色，并记录吸收光谱。本实施例中显色反应混合溶液颜色几乎无变化；得到的反应产物的吸光度值峰值、银纳米颗粒的吸光度值峰值和两者的差值分别为0.45，0.45，0.00，与标准曲线对比得到结果是，待测样品胰蛋白酶含量为Ong/mL。如图1所示，实施例1和实施例2进行的对比实验，证明了本检测方法对胰蛋白酶的特异性检测。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
权利要求
1.一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，利用表面修饰剂和还原剂合成多肽修饰的银纳米颗粒； 步骤二，检测多肽修饰的银纳米颗粒的紫外-可见光谱； 步骤三，将胰蛋白酶与合成银纳米颗粒进行显色反应； 步骤四，显色反应终点再检测反应产物的紫外-可见光谱； 步骤五，计算合成的银纳米颗粒的吸光值峰值与反应产物的吸光值峰值的差值，根据差值与预定的标准曲线比对，得到胰蛋白酶的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多肽所含氨基酸数量为2 50个。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述多肽所含氨基酸数量为3 20个。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多肽包含赖氨酸，且所述多肽至少一个末端为半胱氨酸，其浓度为0.1 μ Μ-5 μ Μ。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤一还包括以下步骤: a、将表面修饰剂于银离子可溶性盐溶液混合，进行电磁搅拌； b、将还原剂加入上述混合溶液中，反应得到表面修饰剂修饰的水溶性银纳米颗粒； C、将多肽分子与银纳米颗粒溶液混合，进行搅拌，通过半胱氨酸侧链的巯基共价连接到银纳米颗粒表面。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的表面修饰剂可选择巯基乙酸、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵、柠檬酸三钠中的任一种。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的银离子的可溶性盐可选择氟化银，硝酸银，高氯酸银中的任一种或其混合物。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所用的还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、水合肼、葡萄糖、甲醇、甲酸或甲醛任一种。
全文摘要
本发明公开了一种快速测定胰蛋白酶的比色分析方法。包括以下步骤检测银纳米颗粒的紫外-可见光谱；将胰蛋白酶与多肽修饰银纳米颗粒进行显色反应；显色反应终点再检测反应产物的紫外-可见光谱；计算银纳米颗粒的吸光值峰值与反应产物的吸光值峰值的差值，根据差值与预定的标准曲线比对，得到胰蛋白酶的含量。本发明提供的检测方法对胰蛋白酶具有高灵敏的选择性响应，最低检测浓度达到2ng/mL，本发明提供的检测方法无须进行复杂的化学修饰或信号标记，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对胰蛋白酶的检测，适于在临床应用，如胰腺炎等疾病的诊断。
文档编号G01N21/31GK103175800SQ20131007695
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月11日 优先权日2013年3月11日
发明者缪鹏, 韩坤, 程文播, 刘涛, 殷建 申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所