使用酶电极的电化学感应的制作方法

专利名称：使用酶电极的电化学感应的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于电化学分析的电极，例如用于确定待测药品是否由氧化性药物代谢酶(DME)代谢，并且涉及电极在这种分析中的应用。
概述制药工业中人们感兴趣的一个关键领域是判断药物在体内如何代谢。一种主要的药物代谢过程，I期氧化，是由细胞色素P450(CYP)或黄素单加氧酶(FMO)酶家族介导的。由这些酶催化的反应可以电化学驱动，并且使用简单的电极系统可以监控反应进程。这使得CYP和相关功能的FMO成为电化学感应的理想待测物。
背景技术：
选择哪些研究过程中已鉴定的前导化合物进入开发流水线是药物设计过程的最重要的一个决定。由于各种原因(参见

图1)，大约90％的待开发选择物不能变成市售药物。开发过程的费用极高(每个分子通常￡50M)，因此如果不能正确选择待开发物就会造成很大的经济损失。由于这个原因，在制药工业中热切地希望找到“早期淘汰药物”的有效途径，即在大量投资发生前识别那些不太可能进入市场的化合物。
在开发过程中淘汰药物待选物的最大单一原因是其在导入活体动物或人体时显示了不可接受的特性。这些特性的共同点是ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排出和毒性)，包括一种分子如何进入体内，如何在各种器官中分布，如何进行生物化学过程，然后如何在胆汁或尿液中排出，以及在开发和临床试验过程中未披露的任何未料到的毒性作用。ADME/Tox预测是现在热门的研究领域，并在将来3-5年中会有扩大的市场。
由于许多药物代谢过程涉及氧化还原电势的改变，因此在ADME/Tox领域内电化学检测在各方面都起到了一定的作用。因而它提供了一种在整个组织或体液样品中来量化药物分子及其代谢作用的方法。特别是，它提供了一种灵敏并具有成本效益的方式在单个酶或整个器官水平跟踪药物的代谢过程。
药物代谢酶(DME)是一组不同的蛋白质，这些蛋白质可以使大量异源化合物(外部分子)解毒，包括药物、农药和环境污染物。大部分具有极宽泛的底物特异性已知一些细胞色素P450[CYP]和黄素单加氧酶[FMO]家族中的一些单独的成分可代谢50多种结构各异的化合物。了解DME和它们的底物之间的结构活性关系是影响药理学、毒理学和基础酶学的重要研究领域。特别是，预测一种分子是否可能由体内的CYP作用的能力在选择用于制药研发的待选择药物分子中是至关重要的。
从概念上讲，DME分成两组。包括CYP和FMO的氧化性药物代谢酶将氧原子引入底物分子，一般导致羟基化作用和脱甲基作用。这些酶由氧化还原驱动，而且可以容易地跟踪由它们催化的电化学反应。包括UDP糖基转移酶、谷胱甘肽转移酶、磺基转移酶、N-乙酰基转移酶的共轭酶系催化内生小分子结合到异源化合物上。这常常导致形成易于排出的可溶化合物。一些共轭酶是非氧化还原驱动的，因而它们不特别适于进行电化学检测。而且，作为人类基因组计划的结果也发现了一些未经识别的DME。例如，虽然其准确的功能还不清楚，但最近发现的CYP3A34现已显示在某些身体组织中表达。因而此处的讨论的不仅限于教科书中所明确提到的酶。
由于CYP和FMO氧化性药物代谢酶驱动反应所需要的电子可以由生物反应器容器中的电极通过直接电荷迁移来提供，所以这些酶作为电化学装置的生物传感器部件有特别的价值。确实，在这样的装置中不需要额外的生物或化学成分(例如辅助因子)或通常体外分析中驱动反应所必需的辅助性氧化还原酶。
所提出的生物传感器部件细胞色素P450CYP酶催化异生化合物生物转化的起始阶段(一种称为第一次通过或I期代谢)，该异生化合物包括大部分药物。这些酶是混合功能的氧化酶大家族中的成员，这些氧化酶通常将氧原子传递给底物分子，由此进一步促使代谢过程分解化合物。已知人体中有50多种CYP同工酶，且它们已分成17个家族39个亚家族。在标准术语中，由数字命名家族，字母命名亚家族，第二个数字标示该亚家族的单独成员。
图2显示了CYP2C9的3D分子结构，表示血红素基团、活性部位铁原子及结合的底物。
在人和动物体内，大量药物代谢都仅仅由CPY1、2、3家族的一些成员进行，并主要发生在肝脏中，肝脏是身体中CYP浓度最高的器官。图3显示了由不同CYP家族代谢的药物的百分比。CYP 3A4、2D6、1A2和2C9负责人体中由CPY促成的大部分药物代谢，因而从药物筛选观点来看是最使人感兴趣的。
由CYP促成的有机分子氧化很复杂，但所有反应可以简化为下面的方程
来自辅因子NADPH(一种通用的电子转移分子)的电子转移至CPY内的血红素基团上，在血红素基团发生分子氧活化作用。底物(在上式中用R表示)与一个氧原子反应，而另一个氧原子则还原为水，这需要第二个电子。一些研究已显示驱动此反应所需的电子可电化学提供，电荷转移直接来自厌氧生物反应器中的电极。在这种情况下，不需要NADPH辅助因子。因而CYP酶是结合到电化学传感器中来预测药物代谢的理想选择物。
图4显示了一般所接受的Cyp催化循环。当底物结合到活性位点上时反应开始(1)。如果反应要继续下去，底物必须置换一个水分子，该水分子通常在未结合的Cyp中与血红素铁原子协同作用。这伴随着Fe3+离子的自旋变化从5个3d电子最大限度配对的低自旋(1/2)状态转变为电子最大限度未配对的高自旋(5/2)状态。接着，这引起了铁氧化还原电势约100mV的变化，该电势使得由Cyp的氧化还原伴侣(通常是NADPH或NADH)引起的铁原子还原在热动力学上有利(2)。还原步骤之后是将O2分子同与Fe3+离子相邻的分离位点结合(3)。该状态是不稳定的，并容易自氧化释放O2-。然而，如果发生第二个电子的转移(4)，催化反应就会继续。O22-与来自周围溶液中的质子反应而形成H2O(释放)，留下了已激活的氧原子(5)。然后该原子与底物分子反应(6)产生底物的羟基化形式(7)，然后该羟基化形式从活性位点释放。
驱动该反应循环的电子一般在适当的氧化还原酶帮助下体外通过氧化还原伴侣提供。就DME来说，氧化还原伴侣常常是在氧化(NADP+)和还原状态之间转换的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。现在的体外DME试验需要相当复杂的反应混合物，该混合物能在适当的氧化状态下再生该氧化还原伴侣。
黄素单加氧酶例如CYP酶的黄素单加氧酶利用分子氧和NADPH催化有机化合物氧化，NADPH作为电子源用于还原一个氧原子。然而，它们在机理上不同于CYP，因为它们与氧和NADPH在缺少底物的情况下反应而采取细胞内的激活状态，并且与亲核基团例如胺、硫醇、磷酸盐之间的相互作用是完成催化循环所需的全部。
保持稳定而在激活状态保持平衡的能力可能解释FMO同工酶极宽泛的底物特异性。有人认为不象大部分其他的酶，所述同工酶在氧活化的中间体中捕获催化所需的几乎全部能量，并不需要排列或扭曲底物分子。于是，FMO的活性位点比其他酶的空间限制少的多，允许多种分子作为底物。在人的肝脏中FMO3是最多的形式，而且就全部药物代谢而言，人们认为它是该酶家族中的主要成员。
至于CYP，其可能通过电化学提供电子而驱动FMO介导的反应，并因而也是结合到预测药物代谢的电化学传感器中的理想选择。
虽然氧化性DME适于结合到预测药物代谢的电化学传感器中，但它们还没有完全电化学开发。为在电化学方面研究氧化性DME介导的反应动力学，速率限制步骤必须是氧化性DME催化反应，而不是电子向酶的迁移。由于大的氧化性DME分子相对低的扩散速率引起在电极表面缓慢的质量传递，所以不可能获得准确的动力学数据。
电化学驱动酶催化反应的一个最重要的方面是电子从电极到酶内的催化位点进行有效迁移。一种使该迁移最大化的做法是将酶固定在电极表面上。
根据本发明的第一方面，提供了一种包括固定在电极表面上的氧化性药物代谢酶(DEM)的电极，以使得电子从电极向氧化性DME内的催化位点进行有效迁移。
如果迁移速率至少如同代谢一种待选药物时由DME消耗电子速率一样快，即发生电子从电极向DME内的催化位点的有效迁移。如果电子迁移限制了待选药物的代谢，则由于电子迁移到DME成为速率限制步骤而不可能进行待选药物代谢转换速率的准确测量。
通常，DME分子每秒转换大约10-100个底物分子。根据Cyp催化机理，对每个被转换的底物分子而言消耗两个电子。这样，电极应能以每秒至少20个电子的速率将电子转移至DME，更优选以每秒至少40个电子的速率，最优选以每秒至少200个电子的速率。
电极可以是任何适宜的导电材料，优选是石墨或金属，最优选金。
DME可以共价或非共价固定到电极表面上。
DME可以通过连接物固定到电极上。连接物共价或非共价固定到电极上，并共价或非共价与DME结合。
连接物应使得电子从电极有效迁移至DME内的催化位点上。优选的，连接物包括离域电子系统。
优选的，连接物包括一个或多个电极结合基团，以将DME固定到电极上。结合基团应使得在电极的操作电压下形成与电极的稳定结合。优选的用于连接到金属电极上的金属结合基团包括酰胺、胺、羧酸以及杂环基团，例如噻吩或含氮的杂环基团，例如吡啶、嘌呤或嘧啶。对金电极，适宜的功能基团包括(但不限于)硫醇、硫醚、噻吩、吡啶、含氮的杂环、羧酸以及大部分带负电核的物质。
连接物的物理化学特性必须与固定到电极上的DME的特性相匹配。特别是连接物与DME相互作用的吉布斯自由能必须合适。结合中焓和熵的变化是重要的。
优选的，对结合的焓有贡献的功能基团包括氢键供体和受体，例如羟基、胺、酰胺、羧酸、芳香族、杂环、烯醇、乙醚、酮、醛、硫醇、硫醚，加卤素、硝基、磷酸和硫酸基团，或这些集团的硫醇等价物。优选的，连接物包括至少两个或三个这样的基团。
优选的，对结合的熵有贡献的功能基团包括胺、酰胺、羧酸、芳香族、环状基团，特别是杂环，烯醇、醚、酮、醛、硫醇、硫醚，加卤素、硝基、磷酸和硫酸基团。
许多种有机分子提供了适宜的连接物。这包括(但不仅限于)金属茂合物、黄素、苯醌及NADH。
优选的连接物包括金属茂合物，特别是二茂铁。钴金属茂合物和钒金属茂合物也是优选的。
金属茂合物具有特殊的结构，即过渡金属离子夹在两个芳环之间，例如带负电的环戊二烯基离子 环戊二烯，环戊二烯基离子两个环戊二烯基环可以与Fe2+离子互相配位形成二茂铁，二茂铁可以在氧化或还原状态存在，因而在DME血红素基团的活性位点反映出铁的特征。

二茂铁特别是二茂铁具有为DME有效转移电荷的适宜氧化还原电势。它们可以携带优化酶结合特性的取代基，而且它们可用适宜的化学基团官能化以使得它们与电极表面紧密结合。
在二茂铁框架中有几个位点可以通过加入化学基团而官能化，以调节分子的氧化还原电势和其他物理化学特性，如形状、大小、疏水性、电荷等等。这些位置在下面的马库什结构中用标记R1-R10表示。
二茂铁本身所有十个取代位点由单个氢原子占据。取代位点可以不独立。例如R1和R2可通过环状结构连接在一起。因而R位置仅仅显示了可能在二茂铁核心周围改变化学特性的位置。
至少一个潜在的R基团携带适于结合到电极上的功能性基团。例如，已知金属金对含硫的基团(如硫醇)具有极强的亲和性。如果一个R基团携带有硫醇，它应可将对金的强结合能力带给该分子。如果该结合基团也能够支持从金属结合位点转移电子到夹心结构中心的配位的过渡金属离子上(例如通过含有离域电子系统)，那么该连接物应还具有为DME提供电子的能力。对于结合到金电极上的硫醇有许多替代物，并且存在许多作为电极材料的金的替代物。
当DME是黄素单加氧酶或一种非细胞色素P450的氧化性DME时，优选使用含硫醇基团的连接物。
根据本发明，其他适于将DME固定到电极表面的例子在下面论述。
蛋白质-电极相互作用固定的蛋白质电化学驱动酶催化反应的一个最重要方面是有效地从电极转移电子至酶中的催化位点。使该转移最大化的一种方式是将酶固定到电极表面上。虽然可以设计含有可溶解酶的系统，但通过使用表面固定化酶最有可能早获成功。
共价修饰的电极例如金属(通常，但不只是金)或石墨电极的表面可以通过共价加入化学基团而修饰，以使它更适于将电子转移到蛋白质上。一种技术包含使用有机硫醇盐(organothiloate)化合物(含有SH基团)与金电极结合。硫醇基团形成与金属表面的强键，分子的其他部分提供适宜的的功能基团用于与蛋白质相互反应。
微孔电解质膜它们是具有高离子电导率的机械和化学稳定的聚合物凝胶体，其以薄层形式包被电极表面。应选择含有凝胶的聚合物以提供适宜环境来将蛋白质俘获在它们的基质中，如高比例(通常至少50％)的羧酸基团(对具有许多带正电的表面残基的蛋白质)、胺基(对在其表面具有许多负电荷的蛋白质)或脂肪族基团(对具有极大的疏水性表面的蛋白质，例如CYP)。
该薄膜应在机械和化学方面足够稳定以便在电极使用的实验期间至少保持物理完整性及化学上的不变性。
聚合物凝胶的离子导电率应该足够高以使得电子能够按照一定速率从电极转移至DME，该速率至少与代谢一种待选药物时被DME消耗电子的速率一样快。
适宜的聚合物凝胶包括具有离域电子的任何大聚合物系统。优选的聚合物凝胶包括碳水化合物凝胶，如多聚糖凝胶、聚吡啶凝胶、含六噻吩的凝胶及聚芳烃凝胶。
聚合物凝胶应具有足够大的微孔尺寸以使得在凝胶基质中俘获DME分子。适宜的微孔尺寸是20-50nm。
优选的聚合物凝胶包括使凝胶与电极在电极的操作电压下稳定结合的金属结合基团。适宜的基团包括硫醇、酰胺、胺、羧酸及杂环基团，特别是含氮的杂环基团，例如吡啶、嘌呤、嘧啶或噻吩。
脂膜天然的CYP酶常与生物膜结合，因为他们大部分都独特地含有在双层磷脂中作为固定器的区域。的确，在分析试验室中用到的CYP通常经过修饰而去除了该固着区域，这样使得酶溶解。CYP对脂双层膜的亲和性提供了将它们固着于电极表面的方式。使用长链脂肪酸、脂或小分子在表面沉积可构建适宜的膜。
适宜的链长度为C5-30，优选C14-22。支链是有利的。
认为去垢剂可提供适宜的膜。
优选的膜包括使该膜与电极在电极的工作电压下稳定结合的金属结合基团。适宜的金属结合基团包括硫醇、酰胺、胺、羧酸及杂环基团，特别是含氮的杂环基团，例如吡啶、嘌呤、嘧啶或噻吩。
金属结合基团可沿脂肪链结合或在脂肪链的末端结合。
根据本发明，也提供了本发明的电极在电化学实验中的应用，例如测定一种待选药物(适宜的是异生化合物)是否被固定到电极上的DME代谢。
如果待选药物作为DME的底物，那么通过DME转换待选药物将消耗电子(例如，如果反应经图4所示的Cyp催化循环进行，认为每个待选药物分子Cyp酶消耗两个电子)。假使电化学反应容器的电极以至少如同DME消耗电子的速率将电子提供给DME，由DME消耗电子的速率可以使用电化学反应容器来测定(否则，由于速率限制步骤变成了电子转移步骤，不可能进行电子消耗速率的准确测定)。欧姆定律推断如果加到电化学反应容器上的电压增加，而电阻为常数，则电流将恒定地线性增加。然而，如果待选药物作为DME的底物，则随着电子在反应中消耗，将看到电流背离了恒定的线性增长。可用这种背离来计算由DME消耗的电子速率，因而通过DME转化的待选药物速率也可计算。如果对不同的待选药物浓度进行该试验，可计算Vmax和Km。
适宜的分析包括下面的步骤i)提供一种包含本发明电极和待选药物的电化学反应容器；
ii)在电化学反应容器上施加变化的电压；iii)测定流过电化学反应容器的电流；及iv)从测定的电流确定该待选药物是否由DME代谢。
根据本发明也提供了一种用于进行本发明分析的电化学反应容器，该反应容器包括电极和本发明的电极。
根据本发明也提供了一种装置，其包括多个电化学反应容器，每一个电化学反应容器包括电极和本发明的电极，其中每一个电化学反应容器的本发明的电极包括不同的DME。
优选的，电极和本发明的电极由同种材料制成，例如石墨或金属，优选金。电极可以是本发明的一种电极。
这些或每一个电化学反应容器优选是微电化学反应容器。
也可理解电子从电极到DME内的催化位点的转移可在一种包含溶解态DME的系统中完成。
根据本发明的第二方面，提供了一种电极，其表面由外加的共价或非共价化学基团修饰，以使得电子从电极向溶解态DME内的催化位点有效迁移。
优选的化学基团包括离域电子系统。
该化学基团优选包括在电极表明形成强键合的功能性基团，和与溶解态DME相互作用的功能性基团。
电极结合基团可使得在电极的操作电压下与电极形成稳定的键合。优选的用于结合到金属电极上的金属结合基团包括酰胺、胺、羧酸和杂环基团，例如噻吩或含氮的杂环基团，例如吡啶、嘌呤或嘧啶。
关于本发明的第一方面，化学基团可以包括含硫基团，例如对金属金具有特强亲和性的硫醇。当DME是FMO或除CYP以外的氧化性DME的情况下，这样的基团是优选的。
在优选的实施方案中，电极是金电极且化学基团是具有SH基团(其与电极表面形成强键合)的有机硫醇盐化合物，也是适宜与溶解态DME相互作用的功能性基团。
许多种有机分子提供了适宜的化学基团。这包括(但不限于)金属茂合物、黄素、苯醌和NADH。
如本发明第一方面所述的，优选的化学基团包括金属茂合物，特别是二茂铁。钴金属茂合物及钒金属茂合物也是优选的。
可以理解该化学基团一定不作为DME的底物或抑制剂，否则就不可能准确测定DME的待选药物转换率。
用在本发明电极中的化学基团必须具有适于驱动酶催化反应的氧化还原电势。下面解释化学基团的氧化还原电势及电化学反应容器电极的操作电压(该电压将电子提供给该化学基团)的重要性。优选，在电化学反应容器中提供电子的电极的工作电压比DME的氧化还原电势更多负电性，并且该化学基团的氧化还原电势比电极的工作电压更少的负电性，而比DME的氧化还原电势有更多的负电性。
氧化反应-还原反应(氧化还原)是一方失去电子而另一方获得电子的反应。当一方获得电子时，它即被还原。当一方失去电子时，它被氧化。在所有的氧化还原反应中，还原与氧化同时发生缺少一方另一方就不可能发生。电子从一种物质流向另一种物质没有净电荷获得或失去。
由电化学电池产生的电力由电池电压E测定。电池电压依赖于发生在电池中的氧化还原反应和反应物的浓度，而不依赖于通过电池的电子数目。
由于我们可以将氧化还原反应割裂为两个部分，我们也可以确定反应的氧化方及还原方的标准电压Eox0及Ered0。我们可以任意选择氢还原半反应具有Ered0＝0，并以此为准测定所有其他的半反应电压。氧化还原电势常相对于这样的参比反应来给定。除了上面所示的氢“电极”，银/氯化银参比也是通用的，参照标准电极系统出版有半反应标准还原电压值的大表。氧化半反应只是相反进行的反应，半电池氧化电压是还原电压的负值。注意，在该测定中的参比电极用于确定“基线”氧化还原电势而能够定量氧化还原差。不论用于试验电化学电池参比电极的材料是什么，其氧化还原电势相差例如100mV的化合物都显示同样的差别。
电池的标准电压E0是氧化还原半反应标准电压的和。所有反应物在25℃及1M浓度或1大气压下测得E0。使用上标“0”显示在标准状态下测定该值。加入单引号E0’表示在所研究系统的标准条件下测定该值。对生物系统，应是在pH、离子浓度及温度相应的生理条件下。为确定氧化还原反应是否是自发的，人们应计算该反应的电压。如果电压是正值，反应即为自发的，如果电压是负值，反应就不是自发的。
对一般的反应平衡常数表达式具有下面的形式此处K是反应的平衡常数，[X]表示物质X的浓度。反应系数Q如下式表达反应的反应系数表达式具有与该反应平衡常数表达式相同的方程，但是如用粗体所显示的，反应系数是用当时的浓度来计算，而不是平衡时的浓度。在平衡的情况下，Q＝K。通过用当时的压力或浓度计算Q并将其与反应的K相比较，Q的一个用途是确定反应将向哪一方向进行。如果Q＜K，那么反应向右移动，且如果Q＞K，那么反应向左移动。
由于电池电压E0决定了电池中的反应是自发的还是非自发的，那么它一定与ΔG(吉布斯自由能的变化)相关。该关系式是ΔG＝-nFE
此处n是在平衡的氧化还原反应过程中交换的电子数量且F是法拉第常数(9.648×104C/mol)。在标准浓度且在25℃时，该公式可写成ΔG0＝-nFE0象所有其他的反应，氧化还原反应可达到一种平衡状态。由于我们知道E0与ΔG0之间的关系式及ΔG0与K之间的关系式，我们可以推出电池电压与平衡常数之间的关系式。由于我们已知ΔG0＝-nFE0及ΔG0＝-RT.ln(K)我们将这两个方程合并为一个方程E0＝(RT/nF).ln(K)在标准条件下，RT/F项目的值为0.0257V，因此我们可以简化上述等式为E0＝(0.0257/n).ln(K)用上述等式，我们可以从平衡常数推出电池电压的值，反之亦然。
在非平衡条件下，我们可以结合ΔG和E之间的关系得到这两者之间的关系式，其方式与我们可在平衡条件下联系K和E大致相同。我们已知以下的关系式ΔG＝ΔG0+RT.ln(Q)ΔG＝-nFEΔG0＝-nFE0结合这三个关系式得出能斯特方程E＝E0-(RT/nF).ln(Q)该方程使我们可以在任何反应物和产物浓度下及在任何温度下计算电池电压。我们通过结合前述常数将该方程稍作简化E＝E0-(0.0257/n).ln(Q)在本发明中，化学集团从电极接受电子，因而被还原。使用上述方程可计算此种情况发生的程度，应该清楚电极电压和氧化还原电势之间的差决定了电化学反应容器中氧化性化学基团与还原性化学基团的相对比例。因此，化学基团的氧化还原电势和电极的操作电压对促使化学反应向所需要的方向发展是非常重要的。同样，随后化学基团传递电子到DME分子，并从而被氧化。在决定化学反应方向及反应发生程度的过程中，两种分子的氧化还原电势差再次成为关键。
通常的Cyp具有-450mV的氧化还原电势(对标准条件E0’下Ag/AgCl参比电极)，因此可用该值确定适宜的化学基团的优选的氧化还原电势。根据标准Cyp催化机理，当底物结合时，该氧化还原电势就降低了100mY左右。每一个DME具有特定的氧化还原电势，但优选的化学基团相对Ag/AgCl电极可能会具有+/-750mV范围内的电势。
化学基团参与两个电化学反应
这些反应必须以一定速率从左向右进行，该速率比由DME催化的反应速率快，相加即为此处R表示药物。
如上所述，由吉布斯自由能的变化确定电化学反应的方向，通过下面的方程该吉布斯自由能与化学焓和熵有关联ΔG＝ΔH-T.ΔS此处，ΔH是焓变化，ΔS是熵变化，T是反应温度。
ΔH主要由下述相互作用确定，例如化学(共价)键、静电相互作用、氢键及范德华相互作用，不仅仅是两个相互作用的分子之间的相互作用，而且也是每个相互作用的分子与溶剂间的相互作用。因而对该成分具有重大影响的功能性基团是那些前面所列出的产生强相互作用的种类。这包括(但不限于)胺、酰胺、羧酸、芳香族、杂环、烯醇、乙醚、酮、醛、硫醇、硫醚，加卤素、硝基、磷酸基和硫酸基团。
ΔS主要由系统中的自由度来确定，例如每个分子可沿其移动或旋转的轴的总数、可旋转键的数量、链状基团中的分支程度及系统中原子的总数。该元素也不仅需要在两个相互作用的分子之间确定，也需要在每个相互作用的分子与溶剂之间确定。因而对该成分具有重大影响的功能性基团是那些对前面所列出的特征有贡献的基团。如前所述这些包括(但不限于)胺、酰胺、羧酸、芳香族、杂环、烯醇、乙醚、酮、醛、硫醇、硫醚，加卤素、硝基、磷酸基和硫酸基团。
上面论述的许多相互作用对ΔG的“疏水相互作用”成分有贡献，通过如芳香族、氢键受体和/或供体及带电基团等功能性基团对该元素特定地产生影响。
应理解，化学基团能以一定速率从电极向DME转移电子，该速率至少与DME代谢待选药物时DME消耗电子的速率相等，优选是该速率的至少两倍。如果待选药物的代谢受电子迁移限制，则由于电子向DME的迁移变成了速率限制步骤，而不可能精确测定DME转换待选药物速率。
通常，DME分子每秒转换大约10-100个底物分子。根据Cyp催化机理对每个转换的底物分子消耗掉两个电子。这样，该化学基团应可以以至少每秒20个电子的速率将电子从电极转移至DME上，更优选每秒至少40个电子，最优选每秒至少200个电子。
本发明第二方面的电极可用于电化学分析，例如以确定一种待选药物(适宜的为异生化合物)是否由固定在电极上的DME代谢。
一种适宜的分析包括i)提供一种在溶液中包含本发明第二方面的电极、DME和待选药物的电化学反应容器；ii)在电化学反应容器上施加变化的电压；iii)测定流过电化学反应容器的电流；及iv)从测定的电流确定该待选药物是否通过DME代谢。
现参照附图描述适宜进行本发明第一或第二方面的分析的许多可能的试验方法中的两种图1显示了药物研发中损耗的原因(数据摘自Kennedy，T.(1997)Drug Discovery Today 2，436-44页，显示了198种在研发阶段失败的潜在待选药物)；
图2显示了CYP2C9三维分子结构；图3显示了由不同CYP家族代谢的药物的百分比(数据摘自Parkinson，A(1996)Toxicology，McGraw-Hill，显示了由已知的CYP酶代谢的368种药物)；图4显示了一般所接受的Cyp催化循环；图5显示了线性扫描(sweep)伏安法的电极电压扫描；图6是使用只含有Fe3+的电解质溶液由电压扫描得到的单一电压的伏安图；图7是对仅含Fe3+的电解质溶液以不同扫描速率记录的一系列线性扫描伏安图；图8显示了对不同还原速率常数值以单一电压扫描速率记录的一系列伏安图；图9显示了用在循环伏安法中的电压扫描，以固定速率从V1至V2然后再回到V1；图10显示了对可逆单电极迁移反应记录的典型循环伏安图；图11显示了电压扫描速率对可逆电子迁移的电流的影响；和图12显示了对不同值的还原氧化速率常数的半可逆反应的伏安图。
反应在包含本发明电极的电化学反应容器中进行。优选在与标准生理条件紧密相配的一定pH、温度及离子浓度下将待选药物溶于水溶液中。在电化学反应容器上施加增加的电压，并测定电流。如果电阻为常数，由欧姆定律预测的电流偏离于电流的恒定线性增长就用于计算不同浓度待选药物的反应速率。然后用不同的反应速率计算由DME转换待选药物的最大速率(Vmax)及产生半Vmax值的待选药物浓度(Km)。
电化学反应容器的尺寸可以是任意适宜的大小。通常是几毫升体积的实验室规模容器，但我们优选的反应容器可与几十或几百纳米的微液流装置相结合。虽然我们优选金，但电极可以是任意适宜的材料。
虽然更优选的是较稀释的条件，但各种成分通常的浓度可在1-100mM范围内。
线性扫描伏安法(LSV)如图5所示，在线性扫描伏安法中，电极电压从下限向上限扫描。由该直线的斜率计算电压扫描速率(v)。已清楚通过改变进行区域扫描的时间，改变扫描速率。
所记录的线性扫描伏安法图的特性依赖于下面的多种因素，包括*电子迁移反应速率*电活化物质的化学反应率*电压扫描速率在LSV测定中，电流响应标绘为电压而非时间的函数，这不同于电势步骤测定。例如，如果我们考虑Fe3+/Fe2+系统使用只含Fe3+的电解质溶液由电压扫描得到的单一电压扫描可参见图6所示的伏安图。
扫描从电流/电压图的左手边开始，那时没有电流流过。当电压进一步扫至右边时(至更还原的值)，电流开始流过并最终在下降前达到峰值。为合理地说明该情况，我们需要考虑电压对建立在电极表面上的平衡的影响。如果我们考虑Fe3+到Fe2+的电化学还原，电子转移的速率比电压扫描速率快。因而，如同热力学所预测的，在电极表面建立了平衡。能斯特方程E=Eθ+RTnFIn[Fe3+][Fe2+]]]>预测了浓度和电压(电势差)之间的关系，此处E是所施加的电势差，E0是标准电极电势。只要电压从V1扫描至V2，电极表面上平衡位置就从反应物V1处的无转换移动至V2处的全转换。
通过考虑电压及质量迁移的影响，可合理说明伏安法的这种确切形式。当电压开始从V1扫描时，电极表面的平衡开始变化，且电流开始流过
随着电压进一步从起始值扫描，电流增加，而同时平衡位置进一步移动到右手侧，这样就转化了更多的反应物。由于在某个点，电极上的扩散层充分增长，使得到电极上的反应物流通量不足够快从而不能满足能斯特方程所需的反应物流通量，所以产生了峰值。在此种状态下，正如在电势步骤测定中那样，电流开始下降。
以单一的扫描速率记录上述伏安图。如果扫描速率改变，电流相应也改变。图7显示了对仅含Fe3+的电解质溶液以不同扫描速率记录的线性扫描伏安图。每一曲线具有同样的形式，而随着扫描速率增加总电流明显增加。通过考虑扩散层的大小及进行记录扫描的时间，可再次合理说明该情况。随着扫描速率的降低，显然线性扫描伏安图将耗费较长时间来记录。因而，依所使用的电压扫描速率，电极表面的扩散层大小是不同的。在较低电压扫描下，与快速扫描相比电极上的扩散层增长得更多。从而，在低扫描速率下到电极表面的流量比在较高速率下要小得多。当电流与流向电极的流量成比例时，在低速扫描的情况下电流量较低，而在高速率下电流量较高。当检测LSV(及循环伏安图)时，这突出了一个重点，虽然在图上没有时间轴，电压扫描速率(从而用来记录伏安图的时间)对所观察的情况有强烈影响。从图7看，记录的终点是电流最大值的位置，很清楚在这同一电压下产生了峰值，这是具有快速电子转移动力学的电极反应的特征。这些快速过程常称为可逆电子迁移反应。
这就留下了关于下面的问题如果电子迁移过程“缓慢”(相对于电压扫描速率)，将发生什么？在这些情况下，该反应称为半可逆或不可逆电子迁移反应。图8显示了对不同还原速率常数值(Kred)在单一电压扫描速率下所记录的一系列伏安图。
在该情况下，所施加的电压不会导致在电极表面上由能斯特方程所预测产生的浓度。这是因为反应动力“缓慢”，因而平衡未快速建立起来(与电压扫描速率相比)而产生的。在这种情况下，所记录的伏安图全部形状与图8所示的相同，但不同于可逆反应，电流最大值的位置现依还原速率常数(及电压扫描速率)而移动。这是由于与可逆情况相比电流需更多时间以对所施电压反应。
循环伏安法循环伏安法(CV)与LSV十分相似。在这种情况下，电压以固定速率在两个值之间(参见图9)进行扫描，而当电压到达V2时，扫描反转，且扫描电压返回到V1。
图10显示了对可逆单电极迁移反应所记录的典型循环伏安图。该溶液也仅包含单个电化学反应物。向前扫描产生了同LSV实验所观察到的相同的响应。当扫描反转时，我们仅逐渐返回平衡位点，将电解产物(Fe2+)转化回反应物(Fe3+)。现在电流从溶液中的物质返回到电极，这以与向前步骤相反的方向进行，而该情况可用同样的方式进行解释。对可逆电化学反应，所记录的CV具有某些限定的特征I)电流峰值之间的电压差为ΔE=EPd-EPC=59nmV]]>II)峰值电压的位置不作为电压扫描速率的函数变化III)峰值电流比率等于1|ipdipc|=1]]>IV)峰值电流与扫描速率的平方根成比例
ipd和ipc∝ 对可逆电子迁移电压扫描速率对电流的影响可参见图11。至于LSV，扫描速率的影响解释为可逆电子迁移反应的扩散层厚度。
在电子迁移不可逆的情况下，CV显示了相当不同于可逆对应状态的情况。图12显示了对不同的还原氧化速率常数值的半可逆反应的伏安法图。第一条曲线显示了氧化速率常数和还原速率常数都依然很快的情况，而随着这些常数降低，曲线漂移至更还原的电势。根据表面平衡不再快速建立起来，这种情况再次可合理推出。在这些情况下，峰值差不再固定，却作为扫描速率的函数而变化。类似的峰值电流不再作为扫描速率的平方根的函数而变化。通过分析作为扫描速率函数的峰值位置的变化，可能估算出电子迁移速率常数。
应用领域在概念上，药物研发组想在开始临床试验前获得化合物在人体中代谢途径及动力学的详细描述，包括可能的副反应，如CYP诱导/抑制及有毒代谢物的产生。尽可能多的地收集此类数据包括增加目标分析系统的结合。整个的动物常用来进行开始的毒理评估，在代谢作业进行前，这些实验结果可避免一种化合物进入下一阶段。目前结合多种分析方法使用培养的肝细胞、活体动物或肝脏切片，检验这样的研究以确定整个代谢特征。当前，使用在人造膜中包含分离的酶的微粒体、合成细胞来进行这样的分析。
随着日益复杂的分析方法的应用，在使用动物、细胞或细胞级分获得关于包括化合物代谢的特定生物化学过程的信息中仍存在着明显的难度。DME的分子遗传学和生物化学的进展及药物发现过程中对更高有效性的需求驱使了基于分离的DME的体外新方法的发展。这些方法已用于筛选成千种化合物并易于结合入药物发现过程早期阶段。在其中一些重组CYP用于体外代谢研究及这些研究的基础理论方式在下面的部分描述。同样通常的方法可应用于其他DME例如FMO，但在最多的情况下，这些方法研究得不如它们在CYP中应用的那样好。
同工酶识别在你的特定药物代谢中所涉及的主要酶的识别可能是早期研究最重要的部分。一旦这已知，就进行药物代谢动力学[PK]研究(参见下文)而获得Km(近似测定酶与底物的亲合性)及Vmax(酶处理底物分子有多快)。这些参数一起用来估算体外清除率、治疗效能的关键性决定因子。特定酶代谢速率的知识可提醒药物发现组发现潜在的遗传药理问题或药物-药物之间的相互作用。
CYP水平的遗传差别是个体对于疗法的变异性的主要原因。例如，一般8％的白种人是2D6底物的不良代谢者，并当主要由该同工酶代谢的药物施用普通剂量时可能遭受严重的副反应。而且，一些药物-药物之间的相互作用的可导致严重的副反应或甚至致命的情况，例如药物引导的心律不齐。对主要相应于药物代谢的酶的识别且助于有效设计评定可能的药物相互作用的临床研究。用作生化传感器的CYP和FMO酶组可以使经每一同工酶的新药处理程度精确定量。这可使用根据本发明的装置而实现。
测定动力学参数不利的PK特性常常是在临床前研究中化合物被淘汰的因素。体外研究的目的是用各CYP同工酶确定化合物的关键PK参数(Km和Vmax)，以便于可以估计体外总清除率。试图从粗酶制备物如微粒体中获得精确动力数据的问题包括经多于一种同工酶对底物的代谢，进一步的产物修饰(例如缀合)、通过污染氧化还原酶消耗的NADPH和底物或产物对细胞蛋白或其它大分子的结合。从酶学家的观点看，唯一获得精确动力数据的途径是使用分离的酶系统。用作生物传感器的分离的CYP酶可提供这种能力。
高通量筛选由于它们与现有治疗药物的代谢相互作用，或由于它们因快速代谢导致的不良生物利用度，大量合成于药物研发阶段的药理学活性化合物被抛弃了。在许多情况下，这是由于该化合物是一种或更多的CYP同工酶的底物或抑制剂。通过分离及定量产自亲本化合物的代谢物，一般可分析CYP及其他DME。在大多数情况下，这涉及色谱技术(常为HPLC)，一些情况下为涉及相分离。这些分析方法具有两个主要缺陷。第一，需要分离反应产物，这使得该方法对用于任意类型的大体积分析而言太麻烦并耗时并排除了连续动力数据的收集。第二，测定代谢物需要对每一底物使用不同的分析方法，从而明显对筛选不同代谢化合物造成技术障碍。由于通用的分析方法允许直接定量每一底物的代谢速率，而使得以高通量筛选[HTS]方式对不同化合物确定关键的药物动力学参数(作为Vmax/Km计算)，所以该方法是理想的。获得该目的的直觉方法是监测NADPH的消耗，该消耗量理论上是同底物转化有化学计量关系的。然而，由于NADPH的消耗和底物转换的偶联在不同底物之间是变化的，且常低至20-30％，所以还未证明该方法有实践性。氧的消耗测定具有同样的缺点；总耗氧量的显著百分比转化成反应性的氧中间体而不是代谢物和水。
由于这些原因现在所使用的用于筛选的主要方法是竞争性抑制试验，在该试验中由实验化合物产生的探针底物转化的抑制用于鉴别潜在的底物和抑制剂。从这些竞争性抑制筛选中发现的物质必须进一步评估以确定它们是否是所指明的同工酶的抑制剂或底物。已研究出许多方法用于高通量筛选CYP抑制。这些技术包括用于分离放射标记的CYP 2D6代谢物的快速相分离方法、研制机器人控制的、用于分析CYP3A4睾酮代谢的多柱HPLC分离系统、新的发光试剂定量依赖CYP脱甲基化反应过程中形成的甲醛的用途，以及用于代谢物分析的快速LC/MS方法。然而，所有这些方法都包括相对麻烦的反应后分离步骤，这些步骤限制了它们在HTS模式中的应用。能在药物代谢动力学水平上跟踪CYP介导的反应的芯片实验室模式生物检测器不需要这些分离步骤，因而对现在的HTS技术提供了实质的优点。
权利要求
1.一种电极，其包括固定在电极表面上的氧化性药物代谢酶(DME)以允许电子从电极向DME内的催化位点有效迁移。
2.一种根据权利要求1的电极，其中通过连接物将DME固定在电极表面上。
3.一种根据权利要求1或2的电极，其中DME共价固定在电极的表面上。
4.一种根据权利要求1或2的电极，其中DME非共价固定在电极的表面上。
5.一种根据任一前述权利要求的电极，其中通过共价或非共价加入化学基团来修饰电极的表面。
6.一种根据权利要求5的电极，其中电极是金电极，并且化学基团是有机硫醇盐(organothiloate)化合物。
7.一种根据权利要求1、2或4的电极，其中电极表面由具有高离子电导率的稳定聚合物凝胶机械或化学包被，将DME捕获在聚合物凝胶基质内。
8.一种根据权利要求7的电极，其中如果DME具有许多带正电的表面残基，则聚合物凝胶包括具有高比例羧酸基团的聚合物。
9.一种根据权利要求7的电极，其中如果DME在其表面具有许多负电，则聚合物凝胶包含具有高比例胺基团的聚合物。
10.一种根据权利要求7的电极，其中如果DME具有大的疏水性表面，则聚合物凝胶包含具有高比例脂族基团的聚合物。
11.一种根据权利要求1、2或4的电极，其中DME是CYP，该CYP通过脂膜固定在电极表面上。
12.一种根据权利要求11的电极，其中该膜包括沉积在电极表面上的长链脂肪酸、脂或类似分子。
13.一种根据权利要求2的电极，其中连接物包括离域电子系统。
14.一种根据权利要求2至4或13的电极，其中连接物包括羟基、酰胺、胺、羧酸基团、芳香基团、环状基团、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶，烯醇、醚、酮、醛、硫醇、硫醚、卤代-、硝基-、磷酸基-或硫酸基团。
15.一种根据权利要求2至4、13或14的电极，其中连接物包括金属茂合物、黄素、苯醌或NADH。
16.一种根据权利要求15的电极，其中连接物包括二茂铁。
17.一种根据权利要求15的电极，其中二茂铁是具有下列分子式的化合物 其中R1是任何下述基团硫醇、硫醚、酰胺、胺、羧酸、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶；以及R2-10独立地是任何下述基团羟基、酰胺、胺、羧酸基团、芳香基团、环状基团、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶，烯醇、醚、酮、醛、硫醇、硫醚、卤代-、硝基-、磷酸基-或硫酸基团。
18.一种电极，具有经共价或非共价外加化学基团修饰的表面，以允许电子从电极向溶解态的DME内的催化位点有效迁移。
19.一种根据权利要求18的电极，其中电极是金电极，而且该化学基团是具有与电极表面形成强键的SH基团的有机硫醇化合物，和与溶解态的DME相互作用的适宜官能团。
20.一种根据权利要求18的电极，其中化学基团包括离域电子系统。
21.一种根据权利要求18或20的电极，其中化学基团包括羟基、酰胺、胺、羧酸基团、芳香基团、环状基团、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶、烯醇、醚、酮、醛、硫醇、硫醚、卤代-、硝基-、磷酸基-或硫酸基团。
22.一种根据权利要求18、20或21的电极，其中化学基团包括金属茂合物、黄素、苯醌或NADH。
23.一种根据权利要求22的电极，其中化学基团包括二茂铁。
24.一种根据权利要求23的电极，其中二茂铁是具有下列分子式的化合物 其中R1是任何下述基团硫醇、硫醚、酰胺、胺、羧酸、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶；以及R2-10独立地是任何下述基团羟基、酰胺、胺、羧酸基团、芳香基团、环状基团、杂环基团，如噻吩，或含氮的杂环基团，如吡啶、嘌呤或嘧啶，烯醇、醚、酮、醛、硫醇、硫醚、卤代-、硝基-、磷酸基-或硫酸基团。
25.一种电化学反应容器，其包括根据权利要求1-17中任一项的第一电极及第二电极。
26.一种装置，包括多个根据权利要求25所述的电化学反应容器，其中每个电化学反应容器的第一电极包含不同的DME。
27.一种电化学反应容器，包括根据权利要求18-24任一项的第一电极、第二电极及DME。
28.一种装置，包括多个根据权利要求27的电化学反应容器，其中每个电化学反应容器的第一电极包含不同的DME。
29.一种根据前述任一项权利要求的电极、电化学反应容器或装置在电化学感应中的应用。
30.根据权利要求29的应用，用于预测药物代谢。
31.根据权利要求30的在分析中的应用，其包括下面的步骤i)提供一种在溶液中包含根据权利要求1-17任一项的电极和一种待选药物的电化学反应容器；ii)向电化学反应容器施加变化的电压；iii)测定流过电化学反应容器的电流；及iv)从测定的电流确定该待选药物是否由DME代谢。
32.根据权利要求30的在分析中的应用，其包括下面的步骤i)提供一种在溶液中包含根据权利要求18-24任一项的电极、DME和待选药物的电化学反应容器；ii)对电化学反应容器施加变化的电压；iii)测定流过电化学反应容器的电流；及iv)从测定的电流确定该待选药物是否由DME代谢。
全文摘要
本发明公开了用于电化学分析的电极，以确定待选药物是否通过氧化性药物代谢酶(DME)代谢。在第一类型电极中，DME固定在电极表面。在第二种类型的电极中，电极的表面经共价或非共价加入化学基团修饰，从而使得电子从电极向溶液中的DME有效迁移。本发明描述了该电极在电化学分析中的用途，及包含该电极的电化学反应容器。
文档编号C12Q1/00GK1678750SQ03820036
公开日2005年10月5日 申请日期2003年6月27日 优先权日2002年6月28日
发明者B·P·艾伦, 周晓峰, R·吉尔伯特 申请人:E2V技术英国有限公司