专利名称：用于检测生物样本中的dna的装置和方法
技术领域：
本发明涉及用于检测生物样本中的DNA的装置和方法。特别地，本发明涉及利用电子辅助核酸杂交检测DNA序列的新装置，以及涉及优化这种装置的性能的方法。
背景技术：
利用电子辅助核酸杂交是在含有DNA的生物样本例如血液、血浆、尿液等的分析中的已知技术。通常地，用于DNA检测的芯片是用各种材料构成，包括玻璃、二氧化硅和金属。在芯片的表面上，采用已知技术形成大量的电接触。为了检测生物样本中的特定DNA序列，由互补DNA片段组成的捕获探针被附着到芯片的表面上。如果生物样本含有目标DNA，目标DNA将会通过杂交结合到互补DNA片段上，并且各种成像技术被用于检测这种杂交，从而检测到在该样本中存在目标DNA。将电流施加到捕获探针上，可以加速杂交过程，从而也加快了检测过程。这种基础的杂交技术被公开在例如US5 849486中。
现有技术在这种装置和技术中，涉及到的主要问题是捕获探针结合到芯片的表面上，以及当发生杂交时使杂交成像和可视化。对于杂交成像和可视化，常规的检测方法是检测荧光，但是最近Taton等(″Science″Vol.289，8 September 2000，1757-1760)描述利用链霉抗生物素包被的金纳米颗粒来进行检测。在这种技术中，金纳米颗粒用互补于目标DNA序列的寡核苷酸序列包被。含有这种被包被的金纳米颗粒的溶液被加到芯片的表面上，然后金颗粒将会结合到任何结合了目标DNA的探针上。金颗粒本身太小而不能检测到，但是可以将芯片表面与含有银离子的溶液一起温育。银离子沉积到金纳米颗粒的表面上，形成可见的银层，该银层可以通过常规的成像装置来检测。
对于捕获探针与芯片表面的结合，难点在于DNA寡核苷酸附着到芯片表面(例如硅片)是一个关键步骤，对试验条件的变动高度敏感。特别地，当在电子辅助杂交过程中施加电流时，可能发生电解，这会反作用于后续的反应和检测。例如用琼脂糖凝胶包被芯片表面，用作捕获探针的DNA寡核苷酸在一端用生物素标记并且通过生物素和链霉抗生物素之间的高度亲合作用被包埋在琼脂糖层中，链霉抗生物素在包被芯片表面之前被溶解在琼脂糖中。
但是，采用琼脂糖存在许多问题。首先，加工融化的琼脂糖凝胶以在芯片上面维持平坦的包被十分困难。此外，必需精确地控制琼脂糖凝胶的密度和浓度。因此，采用合适的琼脂糖层加工芯片是非常困难的。而且，一旦被应用，必需保持凝胶湿润以防止干燥和破裂，而且琼脂糖非常不稳定，并且在高温下降解，所以在应用琼脂糖层后，芯片必需被冷藏。琼脂糖层还非常脆弱，并且对机械应力敏感，因此存储和运输已经制备的芯片是困难的。在任何情况下，采用琼脂糖凝胶不能克服由电离引起的潜在问题。
发明概述按照本发明，提供用于检测生物样本中的目标DNA的装置，包括由至少一个反应池构成的基底，其中所述反应池包括用于附着DNA捕获探针的氧化铝表面。
通过这种安排，由于氧化铝提供稳定的附着表面，该表面容易形成和加工，方便装置的后续处理和存储，这克服或者至少减少了电解问题，因此，现有技术中的一些问题被解决，或者至少被减轻。
可以通过氧化已经形成的铝层或者直接地例如通过喷涂来形成氧化铝附着表面。
将捕获探针附着到氧化铝层的方法将会使加工更加便捷。吸附到氧化铝的附着层将具有这种功能。能够正确地将捕获探针定位到附着层也是重要的。一种蛋白质可能具有这两种活性。优选地，该蛋白质可以是用于标记DNA捕获探针的蛋白质的抗体，使得捕获探针通过抗体-蛋白质配对连接以特定方向被连接到附着表面上。但是，可选择地，该表面可以用任何蛋白质包被，而捕获探针可以用对第一种蛋白质具有高亲合性的蛋白质标记，例如链霉抗生物素/或生物素。
为了降低背景信号，附着表面可以用一种试剂包被，例如白蛋白，鲑鱼精子DNA，聚蔗糖(Ficoll)或者其他蛋白质。
从另一个主要方面看，本发明包括用于检测生物样本中的目标DNA的试剂盒，所述试剂盒包括(a)包括至少一个反应池的基底，所述至少一个反应池具有氧化铝表面，(b)包含包括所述目标DNA的互补DNA片段的捕获探针的第一种试剂，(c)用于接受所述样本的缓冲液，(d)包含包括所述目标DNA的互补DNA片段的检测探针的第二种试剂，(e)链霉抗生物素包被的金纳米颗粒的溶液，和含有银离子的溶液。
从另一个方面看，本发明还延伸到用于检测样本中的目标DNA的DNA芯片，其包括具有氧化铝表面的基底，和附着到所述氧化铝表面的DNA捕获探针。
从还有另一个方面看，本发明还扩展到用于检测生物样本中的目标DNA的方法，包括步骤(a)提供由氧化铝表面构成的反应池，(b)用第一种蛋白质包被所述表面以方便被连接到捕获探针上的第二种蛋白质的结合，使得所述捕获探针正确定位，(c)向所述反应池中加入含有捕获探针的溶液，该捕获探针由互补于所述目标DNA的DNA序列构成并用对所述第一种蛋白质具有高亲合性的第二种蛋白质标记，(d)将所述样本加到所述反应池中，(e)向所述反应池中加入含有目标DNA检测探针的溶液，该探针由与所述目标DNA互补的DNA序列构成，(f)向所述反应池中加入材料来在一个反应池中产生可检测的信号，其中目标DNA已经被所述捕获探针捕获，并且被所述检测探针检测到，和
(g)检测所述信号。
附图描述本发明的一些实施方案将通过实施例来描述，并参考附随的附图，其中附
图1是图解按照本发明的实施方案的芯片以及阐明杂交和检测方案的示意图，附图2(a)-(d)表示试验性地获得的反应池，其显示存在捕获探针使得目标DNA能够被被检测。
附图3(a)-(d)表示试验性地获得的反应池，其显示存在目标DNA在银沉淀形成之前是必需的。
附图4(a)-(d)表示试验性地获得的反应池，表明随着样本中的目标DNA浓度升高，银沉积程度增加，和附图5表示试验性地获得的反应池，表明银沉积密度随着捕获探针浓度而变化。
优选实施方案的详细描述首先参见附图1，其图示按照本发明的一种实施方案的用于检测生物样本中的DNA的新装置。该芯片包含硅片1，在其上面制造铝层2，在铝层2的上面形成氧化铝层3。氧化铝层3是下面描述的DNA探针的附着表面。
氧化铝层3通过铝层氧化来形成，或者通过在芯片的表面上直接沉积铝，而根本不需要铝层。这些可能的情况将被更加详细地描述。
在第一种形成氧化铝层的方法中，铝可以在暴露于氧气和水的洁净铝表面上增厚。二氧化硅芯片在其表面上构建一层铝，首先用蒸馏水洗涤，浸没在5％(w/v)NaOH溶液中约30秒钟来清洁，然后按照在Sharma CP & Sunny MC“白蛋白吸附到氧化铝和聚亚胺酯表面上”(Albumin adsorption on to aluminum oxide and polyurethanesurfaces)Biomaterials，1990；11255-257中描述的技术用蒸馏水洗涤数次。然后芯片在烤箱中在37℃下加热过夜，容器中有一些水来保持水分。在这些条件下，铝的表面氧化为氧化铝，具有约50的厚度。在这种方法的改进中，芯片可以简单地用蒸馏水洗涤，然后在60℃下加热48小时。
作为通过氧化铝层来形成氧化铝的可选择方法，按照如下喷涂条件，氧化铝被直接沉积到硅片上设备ARC-12M喷涂系统RF功率120W基础压力1.04×10-5托(torr)处理压力5×10-3托气流Ar/O2＝30.2/7.5sccm阶段旋转8rpm喷涂时间45分钟最小厚度100芯片尺寸5mm×5mm氧化铝包被的芯片可以通过常规照相平版印刷技术来绘制。此外，无论采用何种方法来形成氧化铝层，在杂交之前，被包被的芯片都用1xPBS(磷酸缓冲生理盐水，pH7.4)在室温下通过在芯片表面反复吹吸溶液洗涤一次。对于形成氧化铝层的可选择方法，喷涂是优选的，如试验表明其产生的背景信号最小。无论采用何种技术来形成氧化铝层，厚度至少为50。
氧化铝优选作为探针附着表面，因为与例如琼脂糖相比，氧化铝更加便宜、更稳定和更加耐用。此外，氧化铝可以在室温下被干燥存储。重要的是，氧化铝还减少与电解相关的问题。此外，尽管琼脂糖难以被处理来形成受控制的层，氧化铝层的孔径和厚度可以很容易被控制(例如通过改变喷涂条件或者空气水分含量)。采用常规照相平版印刷技术，氧化铝还很容易被绘制。采用被绘制的氧化铝层是有利的，其减少了非特异结合以及通过提高被探测器成像的区域与背景之间的对比，降低了背景信号。
参照附图1，还示例性地显示采用按照本发明的一种实施方案的装置和方法的基本杂交方案。特别地，在附图1中，附着表面是一层在铝上形成的氧化铝。通过将氧化硅沉积在氧化铝附着表面上构成循环反应孔(circular reaction well)。在每个反应孔中，捕获探针被附着到氧化铝层上。但是，捕获探针不是直接附着的，而是通过由洋地黄毒苷(DIG)和抗洋地黄毒苷(抗DIG)抗体形成的连接来附着。特别地，抗DIG抗体被氧化铝表面吸附，而捕获探针由DIG标记形成，其中捕获探针可以通过抗DIG抗体被连接到氧化铝附着表面上。氧化铝表面具有许多孔，能够结合许多不同的分子。抗DIG包被作为附着层以确保被固定的DNA捕获探针正确地定位。如果没有进行包被，存在检测探针(将在下文描述)结合到氧化铝表面的危险，导致干扰目标DNA的检测。此外，如果没有进行包被，捕获探针可能以不正确的方向结合到氧化铝上。原则上，抗DIG/DIG连接可以被任何类似的化合物配对取代，例如抗体和目标蛋白，或者一对相互之间具有非常高亲合性的蛋白质，或者任何一对能够相互作用的非蛋白质分子。还应当理解，抗体/蛋白或蛋白/蛋白连接的顺序是可颠倒的。例如，虽然在本文描述的优选实施方案中，抗DIG被用作限制反应涂层，而捕获探针用DIG标记，也可以颠倒过来。但是，实际上，将小分子例如DIG附着到捕获探针上比将抗体附着到捕获探针上更加容易。此外，应当指出，可以通过添加末端胺或者乙醛基团将捕获探针直接附着到氧化铝层上。
还应当理解，捕获探针用互补于样本中将被检测的DNA靶点的DNA序列来构成。因此，当样本被加到捕获探针附着的芯片的表面时，如果存在目标DNA，则目标DNA将会通过已知的DNA杂交过程结合到捕获探针的互补DNA序列上。如本领域所知，优选地可以通过施加电流来加速杂交。
一旦样本被添加到芯片表面，有必要检测已经结合到捕获探针上的来自样本的任何目标DNA。为了达到这一目的，加入含有生物素酰化的检测探针的溶液。该检测探针包括与目标DNA互补的DNA序列，该DNA序列将会结合到任何事先被捕获探针捕获的目标DNA上。为了使被捕获的目标DNA能够被可视化检测，加入用链霉抗生物素包被的金纳米颗粒，并且由于链霉抗生物素与生物素之间的亲合性，金纳米颗粒将会附着到检测探针上。金纳米颗粒本身太小，以致不能被清楚地看见，但是加入含有银离子的溶液，将会沉积(reduced)在链霉抗生物素包被的金纳米颗粒上，形成银层，可以看到黑色沉淀。
为了降低背景信号，优选用鲑鱼精子DNA来处理芯片。作为鲑鱼精子DNA的替代，可以采用白蛋白或者其他蛋白质，或者聚蔗糖。
可以使用定色溶液，例如硫代磷酸钠，来进一步提高银沉淀的可见度。常规的成像设备和技术可以被用来检测反应池中的黑色沉淀，黑色沉淀是由样本中存在目标DNA产生。
实施例如下实施例是用于检测样本中的β-肌动蛋白DNA的方案。杂交步骤是电子辅助的，虽然持续地施加电流也是可以的，优选通过施加脉冲的脉冲杂交。但是，脉冲杂交限制了对芯片的破坏，并且产生较高的信号。对于样本DNA杂交到捕获探针上，典型的杂交条件包括施加10秒钟脉冲(13微安)，接着暂停3秒钟，重复到8分钟(即总共48个脉冲)。对于检测探针杂交到被捕获的样本DNA上，可以采用相同的条件，但是仅为3分钟(即18个脉冲)。
1.抗DIG用1xPBS(磷酸缓冲生理盐水)，pH7.4稀释100倍。
2.将50μl稀释的抗DIG加到氧化铝包被的芯片上，在41℃下温育2小时。
3.弃去抗DIG溶液，用80μl的1xPBS，pH7.4洗涤芯片3次(在每次洗涤中反复吹吸)。
4.将含有1μl的10μM DIG标记的捕获探针与0.2μg鲑鱼精子DNA的50μl 1xPBS加到芯片上，在41℃下温育30分钟。首先通过加热到95℃来变性鲑鱼精子DNA，以形成单链，然后与DIG标记的捕获探针混合。
5.弃去DIG标记的捕获探针溶液和鲑鱼精子DNA溶液，用80μl的1xPBS洗涤三次，用1xSSPE洗涤一次。
6.将5μl的11μM β-肌动蛋白序列样本(91个核苷酸的单链靶点)加入1xSSPE，如所述施加电子脉冲8分钟。在杂交后，用1xSSPE洗涤芯片三次。
7.将检测探针(1μl，10μm)加到芯片上。如所述施加电脉冲电流3分钟。用0.1xSSPE洗涤三次和用1xPBS洗涤一次。
8.用1xPBS，pH7.4稀释链霉抗生物素包被的金纳米颗粒(得自SigmaChemical Co.，Ltd，路易斯街，密苏里，美国)10倍。
9.将稀释的链霉抗生物素包被的金纳米颗粒加到芯片表面，在41℃下温育15分钟。
10.弃去被稀释的链霉抗生物素包被的金纳米颗粒的溶液，并用80μl1xPBS，pH7.4洗涤2次(每次洗涤时反复吹吸)，和用80μl高压灭菌的超纯水洗涤3次(每次洗涤时反复吹吸)。
11.在使用前制备银增强溶液A和B(得自Sigma Chemical Co.，Ltd，路易斯街，密苏里，美国)的1∶1的混合液，如下步骤在暗室中进行。将50μl银增强溶液加到芯片上，并在室温下温育5分钟。
12.弃去银增强溶液，并在往芯片上滴加50μl 2％硫代硫酸钠之前用高压灭菌的超纯水洗涤芯片1次。吹吸一次来去除背景并固定颜色。
13.在温育2分钟后，弃去硫代硫酸钠溶液，并在往芯片上加50μl高压灭菌超纯水之前用50μl超纯水洗涤。
14.用光学信号检测系统观察芯片上出现的黑色的斑点。
试验结果如下在附图2-5中所示的试验结果是采用上述杂交方案获得的，某些参数被改变，这可以从如下内容知晓。在所有情况下，基本的DNA检测方案如下氧化铝附着层上具有抗DIG，DIG标记的含有与单链核苷酸靶点互补的DNA片段的捕获探针，用于结合被捕获的靶点的生物素标记的检测探针，和具有银增强来可视化被检测的目标DNA的链霉抗生物素包被的金纳米颗。
附图2(a)-(d)阐明了DIG标记的捕获探针在检测DNA靶点中的有效性。附图2(a)和(c)都表示杂交前的芯片。由于还没有形成银沉淀，反应池是白色的。附图2(b)和(d)表示杂交后的芯片，附图2(b)中存在DIG标记的捕获探针，而附图2(d)中没有。附图2(b)的反应池比附图2(d)的黑，表示有银沉淀。
附图3(a)-(d)表示变暗的银沉淀仅在存在目标DNA的反应池中形成。与附图2类似，附图3(a)和(c)表示杂交前的芯片，而附图3(b)和(d)表示杂交后的芯片，仅在附图3(b)中存在目标DNA，而附图3(d)没有。同样，可以看出黑色的银沉淀仅在存在目标DNA的附图3(b)中的反应池中形成。
附图4(a)-(d)证明随着目标DNA浓度的升高，银沉淀变得更黑，并且光学信号与目标DNA的浓度成比例地变大，进一步阐明本发明的有效性。附图4(a)-(c)表示杂交后的芯片，以及用(a)未稀释的目标DNA，(b)稀释5倍的目标DNA和(c)稀释10倍的目标DNA进行检测。可以观察到，附图4(a)的反应池比附图4(b)的反应池更黑，而附图4(b)的反应池比附图4(c)的反应池更黑。作为比较的附图4(d)表示不存在目标DNA的芯片，因此，白色的反应池没有被沉淀的银。
最后，附图5表示光学信号强度随着DIG捕获探针的浓度而变化。在附图5中，DIG捕获探针浓度从左到右降低，而且由于较少的银被沉淀，反应池相应地变得更亮。
权利要求
1.用于检测生物样本中的目标DNA的装置，包括由至少一个反应池构成的基底，其中所述的反应池包括用于附着DNA捕获探针的氧化铝表面。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝表面通过铝层氧化来形成。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝表面通过喷涂技术来形成。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝表面用第一种蛋白质包被包被来作为捕获探针的附着层。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述装置还包括附着到所述氧化铝表面的捕获探针，并且其中所述捕获探针用能够连接到所述第一种蛋白质的第二种蛋白质标记。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述第一种和第二种蛋白质包括一种抗体-蛋白质配对。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述第一种蛋白质包括抗洋地黄毒苷抗体，而其中所述第二种蛋白质包括洋地黄毒苷。
8.根据权利要求5所述的装置，其中所述第一种和第二种蛋白质包括链霉抗生物素和生物素，或者反之亦然。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝表面用第一种分子包被来作为捕获探针的附着层。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述装置进一步包括附着到所述氧化铝表面的捕获探针，并且其中所述捕获探针用与所述第一种分子具有亲合性的第二种分子标记。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝层具有至少50的厚度。
12.根据权利要求1所述的装置，其中所述氧化铝表面用在检测过程中降低背景信号的试剂包被。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述试剂包括鲑鱼精子DNA。
14.根据权利要求12所述的装置，其中所述试剂包括白蛋白或者其他蛋白质，或者聚蔗糖。
15.用于检测生物样本中的目标DNA的试剂盒，所述试剂盒包括(a)包括至少一个反应池的基底，所述至少一个反应池具有氧化铝表面，和至少以下之一(b)包含包括所述目标DNA的互补DNA片段的捕获探针的第一种试剂，(c)用于接受所述样本的缓冲液，(d)包含包括所述目标DNA的互补DNA片段的检测探针的第二种试剂，(e)链霉抗生物素包被的金纳米颗粒的溶液，和(f)含有银离子的溶液。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述氧化铝表面用第一种蛋白质包被以确保捕获探针正确定位，并且其中所述捕获探针用与所述第一种蛋白质具有亲合性的第二种蛋白质标记。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述第一种和第二种蛋白质包括抗体-蛋白质配对。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一种蛋白质包括抗洋地黄毒苷抗体，而其中所述第二种蛋白质包括洋地黄毒苷。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，还包括用于降低背景信号的第三种试剂。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述的第三种试剂包括白蛋白或者鲑鱼精子DNA。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，还包括定色剂。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述定色剂包括硫代硫酸钠。
23.用于检测生物样本中的目标DNA的方法，包括如下步骤(a)提供由氧化铝表面构成的反应池，所述表面用第一种蛋白质包被以确保捕获探针正确定位，(b)向所述反应池中加入含有捕获探针的溶液，该捕获探针由互补于所述目标DNA的DNA序列构成并用对所述第一种蛋白质具有高亲合性的第二种蛋白质标记，(c)将所述样本加入所述反应池中，(d)向所述反应池中加入含有目标DNA检测探针的溶液，该探针由与所述目标DNA互补的DNA序列构成，(e)向所述反应池加入材料来在反应池中产生可检测的信号，其中目标DNA已经被所述捕获探针捕获，并且被所述检测探针检测到，(f)检测所述信号。
24.如在权利要求23中所述的方法，其中所述的第一种和第二种蛋白质包括抗体-蛋白质配对。
25.如在权利要求24中所述的方法，其中所述的第一种和第二种蛋白质包括抗洋地黄毒苷和洋地黄毒苷。
26.如在权利要求24中所述的方法，其中所述的第一种和第二种蛋白质包括相互之间具有亲合性的蛋白质或非蛋白质分子的相互配对。
27.如在权利要求24中所述的方法，其中所述的第一种和第二种蛋白质包括链霉抗生物素和生物素，或者反之亦然。
28.如在权利要求23中所述的方法，还包括加入用于降低背景信号的试剂。
29.如在权利要求28中所述的方法，其中所述背景信号降低试剂是白蛋白或者来源于鲑鱼精子DNA。
30.如在权利要求23中所述的方法，其中在步骤(f)中，其中用于产生所述信号的材料包括结合到所述检测探针上的链霉抗生物素包被的金纳米颗粒的溶液，和还原到所述金纳米颗粒表面来形成银沉淀的银离子溶液。
31.用于检测样本中的目标DNA的DNA芯片，包括具有氧化铝表面的基底，和附着到所述氧化铝表面的DNA捕获探针。
32.用于检测样本中的目标DNA的DNA芯片，包括具有氧化铝表面的基底，和附着到所述氧化铝表面的DNA捕获探针，其中所述目标DNA和所述捕获探针之间的杂交通过施用电流来加速。
33.如在权利要求23中所述的方法，其中所述电流是脉冲电流。
全文摘要
本发明描述了利用捕获探针和电子辅助杂交来检测生物样本中的目标DNA的装置和方法。反应池由氧化铝附着表面构成，以具有更好的导热和物理特性，并且氧化铝表面用抗DIG抗体包被，给捕获探针提供便利的附着层，使它们正确地定位，而捕获探针由DIG－标记构成，使得它们通过抗DIG/DIG连接附着到反应池的表面上。
文档编号C12Q1/68GK1675375SQ03819478
公开日2005年9月28日 申请日期2003年8月12日 优先权日2002年8月13日
发明者于常海, 刘乐庭, S·S·W·林, D·K－Y·陈 申请人:香港基因晶片开发有限公司