专利名称：用于甲型肝炎病毒核酸捕捉、检测和定量的寡核苷酸的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒诊断领域。更具体地说，本发明涉及准确诊断甲型肝炎病毒感染和检测生物样品中甲型肝炎病毒的核酸分析方法。
背景技术：
甲型肝炎是一种肠道传染病，可引起发热、不适、食欲缺乏、恶心、腹部不适及黄疸。引起甲肝的原因是甲肝病毒感染，这是一种小的无包膜的球形病毒，属于小核糖核酸病毒科肝炎病毒属。HAV基因组由一条单链线性RNA分子组成，长度为7.5kb，其编码的多聚蛋白前体经处理后形成结构蛋白并具有病毒复制所需要的酶活性(Najarian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 822627-2632(1985))。HAV在细胞培养物中生长状况差，产生的病毒数很少，不能引起细胞病变。虽然从病毒颗粒中提取的HAV RNA可以感染细胞培养物(Locarnini等，J.Virol.37216-225(1981)和Siegl等，J.Gen.Virol.57331-341(1981))，但是直接对病毒基因组进行操作比较困难，因为病毒基因组是由RNA构成的。
HAV编码4种衣壳蛋白(A、B、C和D)，这些蛋白含有能被感染个体的抗体识别的主抗原性结构域。除了衣壳蛋白以外，也有报道证明在结构蛋白如2A和病毒编码蛋白酶中也存在抗原性结构域。其他重要的HAV抗原性结构域位于衣壳蛋白前体P1和2A之间的连接处。
HAV通常是由粪-口途径传播的，通过人与人的接触或摄入被污染的食物或水而感染。但是，输入血浆产物也可能是HAV的传播途径。由于缺乏脂质包膜，因此HAV很难通过物理化学方法灭活，而且能够耐受常规的血制品加热消毒。和细小病毒B19一样，HAV也可以通过输入血浆衍生物进行传播。开发敏感的高特异诊断方法来鉴定感染个体内HAV抗原和/或抗体的以及开发核酸检测方法来检测病毒血样以避免其传播是公共卫生领域一大课题。
Robertson等人的美国专利No.5,290,677描述了利用抗体捕捉完整HAV病毒的方法。分离RNA，制备其cDNA。然后用根据HAV基因组上VP1和VP3衣壳区的引物PCR扩增该cDNA，扩增出的产物用根据基因组同一区的探针进行检测。引物和探针的选择根据所要检测的HAV的基因型来确定。
目前，仍然需要开发出一种可靠的诊断试验方法来检测病毒血样中的甲肝病毒，以避免病毒通过血液或血浆衍生物传播，或者通过人与人之间的近距离接触传播。
发明概述本发明的目的在于开发出一种灵敏可靠的核酸诊断方法用于检测潜在感染个体来源的生物样品中的HAV。本文所描述的方法用样品中提取的核酸作为模板通过PCR、转录介导的扩增(TMA)以及5’核酸酶法如TaqManTM技术来扩增HAV序列上的保守基因组区。这些方法可检测病毒血样中的HAV。在某些实施方式中，本发明利用据HAV基因组5’UTR区设计的引物和探针。另外，本发明的方法还可实现一锅化分析(one-pot analysis)，即捕获的样品核酸可在一个容器内扩增和检测。利用本发明的方法可鉴定被感染的样品，避免被感染的样品被输入以及避免这些感染的样品被制成血液衍生物。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种检测样品中HAV感染的方法，该方法包括(a)在高离液盐浓度下或适于固相支持物与靶核酸序列形成复合物的杂交条件下使生物样品与固相支持物接触；(b)从样品中分离(a)步骤后的固相支持物；(c)扩增可能存在的靶核酸序列；以及(d)检测扩增的靶核酸序列，其存在表明样品中存在HAV。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV感染的方法，该方法包括(a)在高离液盐浓度下或适于固相支持物与靶核酸序列形成复合物的杂交条件下使生物样品与固相支持物接触；(b)从样品中分离(a)步骤后中的固相支持物；以及(c)利用据HAV基因组5’UTR设计的引物例如具有SEQ ID NOs1和2所示的序列的引物，扩增靶核酸链。在某些实施方式中，该方法还包括利用根据HAV基因组5’UTR的探针例如SEQ ID NOs3所示探针检测被扩增的靶核苷酸以判断样品中是否存在HAV的步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV感染的方法，该方法包括从怀疑含有HAV的生物样品中分离核酸；
用至少两个引物扩增核酸，其中，(a)每个引物的长度都不超过约60个核苷酸，引物之一含有SEQ ID NOs1中的至少10个连续核苷酸，另一个引物含有SEQ IDNOs2中的至少10个连续核苷酸，或者，(b)引物序列与(a)所述核苷酸序列具有90％的一致性，其中两个引物分别所述分离核酸的正义链和反义链的部分序列具有足够的互补性以与之杂交；以及检测扩增的核酸，如有扩增的核酸则表明样品中存在HAV。
在某些实施方式中，如下从生物样品中分离核酸(a)使含捕捉核酸的固相支持物与生物样品在杂交条件下接触使靶核酸链与捕捉核酸杂交；以及(b)从样品中分离固相支持物。
在另外的实施方式中，分离、扩增和检测是在一个容器内进行的。
在另外一个实施方式中，捕捉核酸含有一种或多种寡核苷酸，其中每种的长度都不超过60个核苷酸并含有选自SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列中的至少10个连续核苷酸。
另一实施方式中，捕捉核酸还包含长度约为15-25个核苷酸的一段同聚物链，如聚A、聚T、聚G、聚C或聚U。
在另外的实施方式中，扩增方法包括PCR、转录介导的扩增(TMA)或TaqMan。
在另外一个实施方式中，本发明的方法还包括利用标记的寡核苷酸探针检测扩增产物的步骤，探针的长度不超过约60个核苷酸并含有SEQ ID NO3所示序列中的至少10个连续核苷酸。
在某些实施方式中，探针在其5’末端和3’末端还含有可检测的标记物，如选自以下的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
在其他的实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV感染的方法，该方法包括(a)使固相支持物与含一种或多种寡核苷酸的捕捉核酸接触，所述一种或多种寡核苷酸含有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的序列，接触在能使捕捉核酸连接到固相支持物上的条件下进行，(b)使固相支持物与生物样品在杂交条件下接触使样品中可能存在的HAV来源的靶核酸链与捕捉核酸杂交；以及(c)从样品中分离步骤(b)后的固相支持物；
(d)用含SEQ ID NO1的正向引物和含SEQ ID NO2的反向引物扩增核酸，其中正向引物和反向引物分别与分离核酸的正义链部分和反义链的部分序列充分互补以与之杂交；以及(e)检测扩增的靶核酸序列以判断样品中是否存在HAV。
在上述方法的某些实施方式中，固相支持物包括小珠，如磁珠，核酸的分离、扩增和检测在一个容器内进行。
在另外的实施方式中，本发明提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含任一
图1所示的核苷酸序列。
在其他的实施方式中，本发明提供了一种长度不超过60个核苷酸的分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包含(a)具有选自SEQ ID NOs1、2和3的序列中至少10个连续核苷酸的核苷酸序列；(b)与(a)所述核苷酸序列有90％一致性的核苷酸序列；或者(c)(a)和(b)的互补序列。
在某些实施方式中，寡核苷酸是选自SEQ ID NOs1、2和3的序列中的至少10个连续核苷酸。
在其他的实施方式中，寡核苷酸在其5’末端和3’末端还含有可检测的标记物。在某些实施方式中，可检测标记物选自以下的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
另外还有一个实施方式，本发明提供了一种诊断检测试剂盒，该试剂盒包括本文所描述的一种或多种引物，诊断试验操作说明书。在某些实施方式中，试剂盒还包括一种寡核苷酸探针，该探针含有约10-50个核苷酸的连接有检测标记物的HAV特异性杂交序列。
在另外一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV的试剂盒。试剂盒包括含有一种或多种寡核苷酸的捕捉核酸，所述一种或多种寡核苷酸含有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ IDNO14的序列；引物含有SEQ ID NOs1和2；寡核苷酸探针含有SEQ ID NO3。在某些实施方式中，试剂盒还包括聚合酶和诊断试验操作说明书。
在另外一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV感染的试剂盒，该试剂盒包括
含有一种或多种寡核苷酸的捕捉核酸，其中每种寡核苷酸的长度都不超过约60个核苷酸并具有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ IDNO13和SEQ ID NO14的序列中的至少10个连续核苷酸；至少两种引物，其中(a)每个引物的长度不超过约60个核苷酸，引物之一含有SEQ ID NO1中的至少10个连续核苷酸，另一个引物含有SEQ ID NO2中的至少10个连续核苷酸；以及鉴定HAV感染的文字说明。
在某些实施方式中，试剂盒还包括长度不超过约60个核苷酸的寡核苷酸探针，该探针含有SEQ ID NO3中的至少10个连续核苷酸。探针在其5’末端和3’末端还含有可检测的标记物。在某些实施方式中，可检测标记物选自以下的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
在某些实施方式中，上述试剂盒还包括聚合酶和缓冲液。
本发明的这些方面及其他方面通过参考下面的详细描述和附图将变得更加清楚。另外，本文所引用的各种参考文献对某些方法和组合物进行了更为详细的描述。
附图的简要描述图1A-1B(SEQ ID NOs1和2)例举了用于扩增分离的HAV核酸的引物。
图2(SEQ ID NO3)描述了用于检测扩增的靶核酸以判断HAV是否存在的探针，其中X是6-FAM(荧光素)，Z是接头加上TAMRA(四甲基罗丹明)。
图3A-3F(SEQ ID NOs10-15)例举了用于分离生物样品中HAV核酸的捕捉寡核苷酸。
图4A描述了HAV野生型靶序列(SEQ ID NO16)。图4B(SEQ ID NO17)例举了一种捕捉和扩增过程的内对照序列。黑体字部分代表野生型序列与内对照序列替换的差异部分。
本发明的详细描述除非另外说明，利用本领域内常规的化学、生物化学、重组DNA技术和病毒学方法就可以实现本发明。这些技术方法在文献中已有详细解释。见《基础病毒学》，第二版，卷I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Worth Publishers，Inc.，Current Addition)；Sambrook等，《分子克隆实验室操作手册》(第二版，1989)《酶学方法》(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；《寡核苷酸合成技术》(N.Gait编辑，1984)；《分子克隆实验指导》(1984)。
下面的氨基酸缩写用于整篇文章中丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N) 天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C) 谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly(G)组氨酸His(H)异亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)赖氨酸Lys(K)蛋氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)丝氨酸Ser(S)苏氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)缬氨酸Val(V)I.定义在描述本发明时使用了下列术语，这些术语的定义如下。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并不限于最短的产物。因此，肽、寡肽、二聚物、聚合物等也包括在这个定义内。全长的蛋白质及其片段也包含在这个定义内。该术语还包括多肽的表达后修饰产物，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，在用于本发明时，“多肽”也指经修饰的蛋白质，如天然序列的缺失、添加和替代(一般是指保守的替代)，只要蛋白质依然保持所需要的活性就可以。这些修饰可以是特异造成的，如通过位点特异性突变，也可以是偶发事件，如产生蛋白的宿主的突变或者由于PCR扩增所造成的错误所致。
当“分离的”用于修饰多肽时意味着该多肽分子与其天然所在的完整有机体分离，或基本上没有其他同类生物大分子存在。术语“分离的”用于修饰寡聚核苷酸时意味着该核酸分子完全或部分去除了天然与其相连的序列；或者该核酸分子以其天然状态存在但与之共存相连的是异源序列；或者从染色体上分离出的核酸分子。
某序列“来源的”或“特异性的”聚核苷酸是指至少含有与所述某序列的某区域相应、相同或互补的连续序列，该连续序列含约6个核苷酸以8个为佳，10-12个更好，15-20个还要好。所得到的聚核苷酸不一定是物理意义上的取自感兴趣的核苷酸序列，而可化学合成方法、复制方法、反转录或转录等方法获得，这些方法都是基于聚核苷酸来源区的碱基序列所提供的信息。因此，它可以代表原始聚核苷酸的正义方向，也可以代表反义方向。
“同源”是指两个聚核苷酸或两个多肽基序之间的一致性的百分率。两个核酸或两个多肽序列彼此“基本同源”是指两个序列在指定长度上的一致性至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约80-85％、90％的序列一致性，最优选至少95％-98％的序列一致性。本文所用的“基本同源”也指与特定核酸或多肽序列完全一致的序列。
一般来说，“一致性”是指两个聚核苷酸序列或两个多肽序列的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应性。一致性的百分率可通过直接比较其序列信息来确定将两个分子的序列对齐，计算对齐后两个序列之间精确匹配的数目，将该数目除以两序列中较短的那个再乘以100。
现在已经有一些计算机程序可用于帮助分析同源性和一致性，如Dayhoff，M.O.在《蛋白质序列和结构图谱》(M.O.Dayhoff编辑，5 Suppl.3353-358，Nationalbiomedical Research Foundation，Washington，DC)中描述的ALIGN程序，该程序采用了Smith和Waterman在《应用数学进展》2482-489，1981中所描述的局部同源性算法用于分析多肽序列。用于分析核苷酸序列同源性的程序有“Wisconsin序列分析包”，版本8(来自Genetics Computer Group，Madison，WI)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也采用了Smith和Waterman算法。这些程序由于采用了厂家推荐的及上述Wisconsin序列分析包中所描述的默认参数，因此使用非常方便。例如，可用Smith和Waterman同源性算法，采用默认计分表和6核苷酸位置间隔补偿来确定一个特定核苷酸序列与参考序列同之间的源性百分率。
本发明计算同源性百分率的其他方法还有MPSRCH程序包，该程序包的版权所有者是爱丁堡大学，是由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发的，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)进行推广。这套程序包也采用了Smith-Waterman算法，默认参数用于计分表(如间隔开放补偿为12，间隔延伸补偿为1，间隔为6)。从数据中所得到的“匹配”值反映了“序列同源性”。其他适用的计算两个序列一致性或同源性百分率的程序通常都是本领域所熟知的，如另外一个排列程序是BLAST，采用默认参数。例如，BLASTN和BLASTP采用下列默认参数genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的详细内容可在下列网址中查到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，同源性还可以通过下述方法确定在适于同源区形成稳定双螺旋的条件下使聚核苷酸杂交，然后用单链特异性的核酶消化，确定消化所得片段的长度。基本同源的核酸序列可用例如就特定系统而言的严谨条件下的Southern杂交试验确定。确定合适的杂交条件是本领域技术人员所熟知的，见上述文献Sambrook等；《DNA克隆》；《核酸杂交》。
本文所用的术语“重组的”用于描述核酸分子时是指基因组聚核苷酸、cDNA、病毒聚核苷酸、半合成的聚核苷酸或合成的聚核苷酸因其来源或对其操作不再与其天然相关聚核苷酸的全部或部分相关。术语“重组的”用于指蛋白质或多肽时是指通过表达重组聚核苷酸而制备的多肽。通常是将目的基因克隆出来，然后转化生物体而表达，这些方法将在下文进一步描述。生物体宿主在表达条件下表达外源基因并产生蛋白质。
“调控元件”是指帮助与其相连接的核苷酸序列转录和/或翻译的聚核苷酸序列。该术语包含启动子，转录终止序列，上游调节区，聚腺苷酸化信号，包括5’-UTRs和/或3’-UTRs的非翻译区，前导序列和增强子，这些序列互相配合使编码序列在宿主细胞内转录和翻译。
本文所用的“启动子”是指能与聚合酶结合并启动与其存在下相连的下游(3’方向)核苷酸序列转录的调节区。为了实现本发明，启动子序列包括能启动感兴趣的序列发生背景水平以上的可检测水平的转录所必需的最少数量的碱基或元件。启动子序列内包含转录起始位点以及负责RNA或DNA聚合酶结合的蛋白结合区(共有序列)。例如，启动子可以是能被DNA依赖性RNA聚合酶(“转录酶”)识别的核酸序列，聚合酶将其识别为与核酸结合并从特定位点开始RNA转录的信号。这种转录酶的结合通常要求DNA其包含启动子序列及其互补序列的部分呈双链；模板部分(待转录序列)则不一定要是双链。不同的DNA依赖性RNA聚合酶各自识别多种不同的启动子序列，这些启动子启动转录的效率大不相同。当RNA聚合酶结合到启动子序列上并起始转录时，启动子序列本身并不是要转录的部分。因此所产生的RNA转录物不包括启动子序列。
当RNA或DNA聚合酶结合到启动子序列并转录其相邻序列时就是所谓的调控序列“指导核苷酸序列的转录”。
“DNA依赖性DNA聚合酶”是能从DNA模板开始合成该模板的互补DNA拷贝的酶。如大肠杆菌来源的DNA聚合酶I和噬菌体T7 DNA聚合酶。所有已知DNA依赖性DNA聚合酶都需要互补引物以启动合成。在适宜的条件下，DNA依赖性DNA聚合酶也可以由RNA模板合成互补的DNA拷贝。
“DNA依赖性RNA聚合酶”或“转录酶”是能从含有启动子序列(通常是双链)的双链或部分双链DNA分子合成多个RNA拷贝的酶。RNA分子(“转录物”)从启动子下游的特异性位点开始按5’到3’方向合成。转录酶的例子有大肠杆菌来源的和噬菌体T7、T3和SP6来源的DNA依赖性RNA聚合酶。
“RNA依赖性DNA聚合酶”或“反转录酶”是能以RNA为模板合成互补DNA拷贝的酶。所有已知的反转录酶都能以DNA为模板合成互补的DNA拷贝；因此它既足RNA依赖性DNA聚合酶，又是DNA依赖性DNA聚合酶。不论以RNA模板还是DNA模板进行合成都需要引物。
“RNA酶H”是可降解RNA:DNA双螺旋中RNA部分的酶。这些酶可以是内切酶，也可以是外切酶。大多数反转录酶除了具有聚合酶活性外还具有RNA酶H的活性。但是其他来源的RNA酶H没有相关的聚合酶活性。降解可导致RNA从RNA:DNA双螺旋上解离下来。另外，RNA酶H还可以在各种位置上简单切割RNA，这样RNA部分就可以被熔化掉或者使酶展开RNA部分。
术语“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中包括任意长度的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物形式。这些术语只指分子的一级结构。因此术语包括三链、双链和单链DNA，也包括三链、双链和单链RNA，还包括其修饰物，如通过甲基化和/或加帽而形成的修饰物，以及聚核苷酸的未修饰形式。更特殊的是，术语“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)，以及其他类型的聚核苷酸即嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的，以及其他含非核苷酸骨架的聚合物，如聚酰胺(即肽核酸(PNAs))和聚吗啉代(polymorpholino)(Anti-virals，Inc.Corvallis，Oregon的产品，商品名为Neugene)聚合物，以及其他含有核苷碱且其构型能够发生如DNA和RNA中所见碱基配对和碱基堆积的序列特异性合成核酸聚合物。术语“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在长度上是没有区别的，这些术语可以互相替换。这些术语只指分子的一级结构。因此这些术语包括3’-脱氧-2’，5’-DNA，寡聚脱氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸酯，2’-O-烷基-替代的RNA，DNA:RNA杂交链，以及PNAs与DNA或RNA的杂交链，也包括已知类型的修饰物，如本领域所熟知的标记物、甲基化、“帽子”、类似物替代一个或多个天然核苷酸，核苷酸内修饰，如不带电荷的连接(如磷酸甲酯，磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)以及带正电荷的连接(如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)，含侧链的修饰物，如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L赖氨酸等)，含嵌合剂的修饰物(如吖啶、补骨脂素等)，含螯合剂的修饰物(如金属、放射金属、硼、氧化性金属等)，含烷化剂的修饰物，含有修饰连接的修饰物(如核酸α端基异构体等)，以及未经修饰的聚核苷酸或寡核苷酸。DNA特指脱氧核糖核酸。
本文所用的术语“靶核酸区”或“靶核酸”是指具有待扩增的“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是单链的也可以是双链的，在靶序列旁边还可以包含可能不被扩增的其他序列。术语“靶序列”是指靶核酸上待被扩增的特定核苷酸序列。靶序列可以包含探针杂交区，该杂交区位于靶分子内，在适宜的条件下探针与该区可形成稳定的杂交体。“靶序列”也包括复合序列，寡核苷酸引物与这样的负复合序列结合并以靶序列为模板延长。当靶核酸原本是单链核酸时，术语“靶序列”也指出现在靶核酸中的该“靶序列”的互补序列。如果“靶核酸”原本是双链核酸，术语“靶序列”既指正(+)链也指负(-)链。
术语“引物”或“寡核苷酸引物”用于本文中是指在诱导引物延伸产物合成的条件下启动互补核酸链合成的寡核苷酸，所述条件是指存在核苷酸和聚合诱导如DNA或RNA聚合酶，以及适宜的温度、pH、金属离子浓度和盐浓度。引物优选单链核酸以达到最大的扩增效率，但也可以是双链。如果是双链，引物在使用前必须经处理将双连打开，然后用于制备延伸产物。这个变性步骤通常通过加热来完成，但是也可以通过使用碱处理再中和来完成。因此，“引物”是与模板互补的，通过氢键与模板结合或杂交，形成引物/模板复合物以便于聚合酶开始核酸的合成，在DNA合成过程中碱基与模板互补地共价连接到3’端从而使引物得以延伸。
本文所用的术语“探针”或“寡核苷酸探针”指由聚核苷酸构成的结构，含有与靶核酸分析物中的核酸序列互补的核酸序列。探针的聚核苷酸区由DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷酸类似物构成。“寡核苷酸探针”用于5’核酶分析试验如TaqManTM时，探针内至少含有一个荧光团和一个淬灭剂，淬灭剂可被反应中所用的聚合酶的5’内切核酸酶活性所消化以便于检测靶核苷酸序列是否被扩增。在这种情况下，寡核苷酸探针在其5’端应有足够数量的磷酸二酯键以便于5’到3’核酸酶活性能有效降解结合的探针从而使荧光团和淬灭剂分离。当寡核苷酸探针用于TMA技术时，探针应当用适宜的标记物标记，详见后文。
杂交序列并不一定要完全互补才能形成稳定的杂交体。在许多情况下，四个或更多个核苷酸形成环结构忽略不计时，碱基错配低于10％仍可以形成稳定的杂交体。所以，本文所用的术语“互补的”是指在试验条件下与其“互补”序列可以形成稳定的双螺旋的寡核苷酸，此时的同源性约90％或更高。
术语“杂交”是指两个足够互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对法则形成稳定的复合物的过程。当引物可与靶序列(模板)“杂交”，则所得复合物(或杂交体)的稳定性足以保证其启动功能，例如DNA聚合酶启动DNA的合成。
本文所用的术语“结合对”是指能彼此特异性结合的第一和第二分子，如能形成核酸双螺旋的互补聚核苷酸对。结合对中的第一成员与样品中第二成员结合的亲和力和特异性比与样品中其他组分结合的亲和力和特异性高说明第一成员与第二成员的结合是“特异性结合”，反之亦然。结合配对中的两个成员之间的结合一般是非共价结合。除非明确说明，“亲和分子”和“靶分析物”用于本文中分别指结合对中的第一成员和第二成员。
术语“特异性结合的分子”和“亲和分子”在本文中可以互换，是指通过化学的或物理的方式选择性地与样品中存在的可检测物质结合的分子。“选择性结合”是指一个分子优先与靶序列结合，或者与目的靶序列结合的亲和力比与其他分子的高。例如，核酸分子与基本互补的序列结合而不与不相关的序列结合。
双链核酸分子的“解链温度”或“Tm”定义为由于加热或其他原因，如酸或碱处理等使碱基对之间的氢键断裂而导致的核酸的双螺旋结构丢失一半时的温度。核酸分子的Tm取决于其长度和碱基组成。富含GC碱基对的核酸分子的Tm要比富含AT碱基对的核酸分子的Tm高。当温度低于Tm时，分开的互补核酸链可自然地从新结合或复性形成核酸双螺旋。在Tm以下约25℃时核酸杂交的几率最高。Tm可通过下面的公式进行估算Tm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur等，(1962)J.Mol.Biol.5109-118)。
本文中“生物样品”是指从有机体中分离出的组织或液体样品，通常包含有机体产生的抗体。常见的样品包括而不限于血液、血浆、血清、粪便、尿液、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道分泌物、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活组织，也包括体外细胞培养物成分的样品，其中包括而不限于在培养基中培养细胞和组织培养物后得到的条件培养基，如重组细胞和细胞组分。优选的生物样品是血液、血浆和血清。
本文所用的术语“标记物”和“可检测的标记物”是指能检测到的分子，包括而不限于放射性同位素、荧光团、化学发光物质、生色团、酶、酶的底物、酶的辅助因子、酶的抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素、亲和素、链亲和素或半抗原)等。术语“荧光团”是指能在能够发出可检测到的荧光的物质或其部分。
本文所用的术语“固相支持物”是指固体表面，如磁珠、乳胶珠、微量滴定板孔、玻片、尼龙、琼脂糖、丙烯酰胺等。
II.本发明的实施方式在详细描述本发明之前，应当理解的是本发明并不限于特定的制剂或过程参数，这些制剂或过程参数是可以改变的。还应当理解的是本文的用语只是为了描述本发明的特定实施方式，并不意味着对本发明作出限制。
虽然也可以用那些与本文所述相似的或等同的组合物和方法来实施本发明，但是以下所述的是优选的材料和方法。
如上所述，本发明的基础是发现了精确检测生物样品中甲肝病毒(HAV)的新型诊断方法。这些方法依赖于敏感的核酸检测技术，样品中即使含有极少量的病毒也可以用该技术鉴定样品中的HAV靶核酸序列。更具体地说，本发明的发明人发现用HAV基因组的5’UTR来源的序列可以快速而灵敏地检测生物样品中的HAV。许多HAV分离株中的HAV基因组序列，包括5’UTR都是已知的。见NCBI登录号K02990；AB020564；AB020565；AB020566；AB020567；AB020568；AB020569；AF268396；M16632；M14707；M20273；NC001489；X83302；Cohen等，J.Virol.(1987)6150-59。通过比较各种HAV分离株的序列，可以很容易地鉴定用于本发明的这些和其他5’UTR序列。为了简便，本发明所用的各种核酸分子根据NCBI K02990来编号，NCBI K02990的5’UTR序列位于1-723位。
在本发明的策略中，靶核酸是从非同源的DNA/RNA中分离的。本发明内容之一中，靶核酸通过与固相支持物形成复合物来分离。另一内容中，靶核酸用固定在固相支持物上的捕捉寡核苷酸进行分离，其中捕捉寡核苷酸是待检测生物体特异性的。然后可用带有报道基团尾巴的寡核苷酸探针来检测或扩增分离的靶核酸。对于HAV来说，分离的靶核酸优选用非翻译区如5’UTR内的引物来扩增。代表性的这个区内的引物是含SEQ ID NOs1和2的引物(图1)。
另外，可能含有靶核酸的生物样品与固相支持物接触，固相支持物上可以带有捕捉寡核苷酸。捕捉寡核苷酸可以通过例如探针部分与固相支持物共价结合、通过亲和力结合、氢键结合或非特异性结合与固相支持物相连接。
捕捉寡核苷酸包含约5到500个核苷酸，优选包含约10到100个核苷酸，更优选包含10到60个核苷酸，或者这些范围内的任一整数数目的核苷酸，如包含目的核酸区上的18、19、20、21、22、23、24、25、26...35...40等个核苷酸。典型的捕捉寡核苷酸来源于HAV分离株的5’UTR序列，如本文图3A-3F(SEQ IDNOs10-15)所描述的序列。
捕捉核酸可以通过各种方式连接到固相支持物上。例如，寡核苷酸可以通过捕捉寡核苷酸的3’或5’末端核苷酸连接到固相支持物上。更优选的是捕捉寡核苷酸通过一个接头连接到固相支持物上，这些接头可以使探针与固相支持物保持一定的距离。接头的长度通常为至少10-50个原子，更优选的足至少10-30个原子。接头所需要的长度要根据所用的特定固相支持物而定。例如，当用高交联的聚苯乙烯作为固相支持物时6个原子的接头就足够了。
本领域所熟知的多种接头都可用于将捕捉寡核苷酸连接到固相支持物上。接头可以由各种化合物，只要它不明显干扰靶序列与连接于固相支持物上的捕捉寡核苷酸杂交就可以。接头可以是同源聚合的寡核苷酸，这样的寡核苷酸可以很容易地通过自动合成添加到接头上。同源聚合物序列可以连接到病毒特异性序列的5’或3’上。本发明中，捕捉寡核苷酸可以与同源聚合物链相连，如聚A、聚T、聚G、聚C、聚U、聚dA、聚dT、聚dG、聚dC或聚dU，以便于其连接到固相支持物上。同源聚合物链可长约10到40个核苷酸，优选约12到25个核苷酸，或者这些范围内任意整数长度，如10...12...16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。
典型的同源聚合物序列包括聚T或聚A序列。另外，聚合物如官能化的聚乙二醇也可以用作接头。这种聚合物不会明显干扰探针与寡核苷酸靶的杂交。连接的例子包括聚乙二醇、氨基甲酸酯和酰胺连接。固相支持物、接头和捕捉寡核苷酸之间的连接以在高温碱性条件下去除碱基保护基团时不被裂解掉的为佳。
捕捉寡核苷酸在其3’末端还可以被磷酸化以防止捕捉寡核苷酸的延伸。
固相支持物可以是各种形式的，如硝酸纤维素颗粒，样品培养基通过滤网时其中的此类支持物的可以被回收；含有磁性颗粒等的硝酸纤维素膜或材料，因此在加上磁场后可使硝酸纤维素膜在样品培养基内迁移；能被过滤或具有电磁特性的磁珠或颗粒；分配在水性介质表面的聚苯乙烯小珠；以及磁化二氧化硅。优选用于固定捕捉寡核苷酸的固相支持物包括调孔玻璃、玻片、聚苯乙烯、亲和素包被的聚苯乙烯小珠、纤维素、尼龙、丙烯酰胺凝胶和活化的葡聚糖。
本发明包括含磁化二氧化硅或磁珠的固相支持物，磁化二氧化硅或磁珠还可以含有伯胺官能团以便于捕捉寡核苷酸与磁性支持颗粒共价结合或缔合。或者，磁化二氧化硅或磁珠上已固定了同源聚合物，如聚T或聚A序列。利用含磁化二氧化硅或磁珠的固相支持物可以实现一罐法分离、扩增和检测，因为固相支持物可通过磁性方式从生物样品中分离出来。
磁珠或磁粒可用标准技术制备或者购买。磁珠或磁粒通常由磁性颗粒构成，虽然也可以是其他磁性材料或金属氧化物，可以是不纯的材料、合金或组合物，只要这些材料具有一个活性表面，能够对磁场起应答就可以。可以单独使用或与铁联合使用的其他材料包括而不限于钴、镍和硅。适用于本发明的磁珠包括含聚dT基团的磁珠，商品名为Sera-MagTM寡核苷酸磁珠，生产厂商为Seradyn，Indianopolis，IN。适用于本发明的磁性二氧化硅包括Novagen，Madison，WI的MagPrepTM磁性二氧化硅。
接种，通过使固相支持物与含捕捉寡核苷酸的介质接触来使捕捉寡核苷酸与固相支持物的结合以。一方面，含聚dT基团的磁珠与靶序列杂交，靶序列含有与HAV基因组保守单链区的序列相邻近的聚dA。捕捉寡核苷酸上的聚dA与固相支持物上的聚dT杂交因而可将捕捉寡核苷酸固定或结合到固相支持物上。另一方面，磁珠可在其表面固定约10到75个核苷酸的核苷酸序列，优选约含10到25个核苷酸的核苷酸序列，这些序列来源于美国专利申请No.10/267,922所述的核苷酸序列，申请日为2002年12月9日。
固相支持物在高浓度高离液盐条件或杂交条件下与生物样品接触。捕捉寡核苷酸与生物样品中的靶核酸链杂交。一般来说，捕捉寡核苷酸与靶序列的杂交可在约15分钟内完成，但也可能长到3-48小时。
在另一方面，二氧化硅磁性颗粒在可促进复合物形成的条件下与含靶序列的介质接触。复合物在二氧化硅磁性颗粒、介质和离液盐的混合物中更容易形成。
高离液盐是高离液离子盐，在水溶液中是高度可溶的。此类盐提供的高离液离子，当其在蛋白质或核酸水溶液中的浓度足够高时可引起蛋白展开，如果是双链核酸则可使双链核酸失去二级结构或熔解。高离液离子具有这种效应被认为是因为它可以破坏在水中形成的氢键网络，从而使变性的蛋白和核酸比其正确折叠或具有正常构象的结构具有更高的热动力学稳定性。代表性的高离液离子包括而不限于胍盐、碘盐、高氯酸盐、三氯乙酸盐。本发明优选胍离子。高离液盐包括而不限于盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠和三氯乙酸钠。优选的是胍盐，更优选的是硫氰酸胍。
用于实现本发明方法的高离液离子的浓度优选约0.1M到7M之间，更优选的是约0.5M到5M之间。混合物中高离液离子的浓度必须足够高以使生物靶材料粘附到混合物中的二氧化硅磁性颗粒上同时不能使靶材料发生变性、降解或从混合物中沉淀出来。蛋白质和双链核酸大分子如病毒核酸在0.5-2M的高离液盐中是稳定的，但是当离液盐的浓度超过约2M时就会沉淀。
在本发明的一个方面中，孵育上述所形成的复合物直到至少有一些核酸粘附到二氧化硅磁性颗粒上形成复合物。这个孵育步骤的温度至少约0℃，优选至少约4℃，更优选的是至少约20℃，但是孵育温度最好不要超过约75℃。因此，孵育温度的范围为0℃到75℃，优选4℃到50℃，最优选的是约15℃到约35℃，或者这些范围内任意整数温度。孵育步骤的温度最好低于二氧化硅磁性颗粒开始失去结合核酸材料的能力的温度，孵育可以在室温下(约25℃)进行。
然后通过过滤、滤柱或通过磁性方式将固相支持物从生物样品中分离出来。正如本领域技术人员所熟知的，选择何种分离方法要根据所选的固相支持物的类型而定。由于靶序列与固定在固相支持物上的捕捉核酸杂交，因此与样品中的杂质分离开来。在某些情况下，无关的核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞碎片以及其他杂质也可能结合到支持物上，但其浓度比在生物样品中的原浓度低的多。本领域的技术人员知道，那些无关物质可以通过洗涤支持物而被去除。较好的是，从生物样品中分离固相支持物可除去样品中至少约70％的非靶核酸，更优选的是至少除去约90％、95％的非靶核酸。
本发明的方法也包括扩增捕获的靶核酸以获得扩增的核酸。扩增靶核酸是用核酸聚合酶产生寡核苷酸靶或其片段的多个拷贝。适用于本发明的扩增技术都是本领域所熟知的，如转录相关的扩增，聚合酶链式反应(PCR)，复制酶介导的扩增以及连接酶链式反应(LCR)。
本发明的方法所用的引物优选具有被检测生物体特异性。这样，为了检测例如HAV，引物就来源于HAV非翻译区的保守区，如图1所示。
用于本发明方法的引物和捕捉寡核苷酸通过标准方法可以很容易地制备，如通过磷酸酰亚胺化学固相合成技术，见于美国专利Nos.4,458,066和4,415,732；Beaucage等，(1992)Tetrahedron 482223-2311；以及Applied Biosystems UserBulletin No.13(1987年8月1日)。其他化学合成方法包括磷酸三酯法，见于Narang等，Meth.Enzymol.(1979)6890和磷酸二酯法，见于Brown等，Meth.Enzymol.(1979)68109。利用上述方法还可将聚(A)、聚(C)或其他非互补核苷酸延伸物插入到探针内。通过本领域所熟知的方法可以将六环氧乙烷延伸物偶联到探针上。见Cload等，(1991)J.Am.Chem.Soc.1136324-6326；Levenson等的美国专利No.4,914,210；Durand等，(1990)Nucleic Acids Res.186353-6359；以及Horn等，(1986)Tet.Lett.274705-4708。一般来说，引物的长度在10-75个核苷酸之间，如15-60、20-40等，更常见的是18-40个核苷酸之间，以及上述范围内的任意长度的核苷酸。典型的探针长度在10-50个核苷酸之间，如15-40、18-30等，以及上述范围内的任意长度的核苷酸。
另外，探针还可以连接上标记物以便于检测。现在已知有几种方式可使寡核苷酸衍生为具有反应性官能度，从而可连接上标记物。例如，有几种方法可使探针生物素化，这样放射性的、荧光的、化学发光的、酶的或高电子密度的标记物可通过亲和素连接到探针上。见G.，Broken等，Nucl.Acids Res.(1978)5363-384，其中描述了使用铁蛋白-亲和素-生物素标记物的方法；以及Chollet等，Nucl.AcidsRes.(1985)131529-1541，其中描述了通过一个氨基烷基磷酸酰胺连接臂将寡核苷酸5’末端生物素化的方法。另外还有几种方法可用于合成氨基化的寡核苷酸，这种寡核苷酸很容易被荧光团或其他类型的氨基活性基团衍生的化合物标记，如异硫氰酸盐、N羟基琥珀酸亚胺等，见Connolly(1987)Nucl.Acids Res.153131-3139，Gibson等，(1987)Nucl.Acids Res.156455-6467以及Miyoshi等人的美国专利No.4,605,735。还有一些方法可用于合成寡核苷酸巯基衍生物，这些寡核苷酸衍生物可与硫醇特异性的标记物反应，见Fung等人的美国专利NO.4,757,141，Connolly等，(1985)Nucl.Acids Res.134485-4502以及Spoat等，(1987)Nucl.Acids Res.154837-4848。标记核酸片段的方法学的全面论述可参见Matthews等，Anal.Biochem.(1988)1691-25。
例如，探针可在其非连接端连接上一个荧光分子而被荧光标记。选择合适的荧光标记物的方法见Smith等，Meth.Enzymol.(1987)155260-301；Karger等，Nucl.Acids Res.(1991)194955-4962；Haugland(1989)《荧光探针和研究化学手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。优选的荧光标记物包括荧光素及其衍生物，如美国专利No.4,318,846和Lee等，Cytometry(1989)10151-164所描述的，以及6-FAM(荧光素)、JOE(2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯荧光素)、TAMRA(四甲基罗丹明)、ROX(rhodaniineX)、HEX-1、HEX-2、ZOE、TET-1、NAN-2等。
另外，探针还可以用吖啶酯(AE)通过以下方法标记。现有的技术可将AE标记物置于探针内的任何位置上。见Nelson等，(1995)，《非同位素探针、杂交及测序》中的“根据化学发光检测吖啶酯”，Kricka L.J.(编辑)Academic Press，SanDiego，CA；Nelson等，(1994)，《聚合酶链式反应》中的“杂交保护分析(HPA)用于PCR”，Mullis等(编辑)Birkhauser，Boston，MA；Weeks等，Clin.Chem.(1983)291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)342087-2090。AE分子可用非核苷酸连接臂直接连接到探针上，这个连接臂可使AE分子放置到探针的任何位置上。见美国专利Nos.5,585,481和5,185,439。
在某些实施方式中，加入了内对照(IC)或内部标准作为靶序列捕捉和扩增的对照。IC最好含有与靶序列不同的序列，该序列可与从样品中分离生物体特异性的寡核苷酸所用的探针序列杂交，并可以被扩增。使用内对照可控制分离过程、扩增过程以及检测系统，并可以监测试验是否成功以及可对样品定量。IC可在任何适当的过程点添加，比如添加到裂解缓冲液中。在一个实施方式中，IC包含具有HAV的部分核苷酸序列的RNA并具有能与探针杂交的独特序列。因此，在某些实施方式中，IC包含HAV基因组的部分序列，其中有5-30个核苷酸，如6...9...12...15...20等或更多个碱基被其他碱基替代而修饰。替代碱基可在全长靶序列上分布，其中只有2个或3个连续核苷酸被替代。HAV的代表性IC见图4B所示，它含有HAV基因组5’UTR来源的721bps。图4B中的大写黑体字母代表与野生型序列(见图4A)相比被取代的碱基。试验中还可以包括内标特异性探针(IC探针)。
代表性的IC序列的探针在实施例中有详细描述，即SEQ ID NOs18和19。IC探针还可以偶联与靶序列上不同的可检测标记物。在可检测标记物是荧光团的实施方式中，IC可通过分光光度法及检测极限研究来定量。
一般来说，IC的拷贝数对靶序列的检测没有影响，IC的拷贝数可通过用固定IU/拷贝/PFU的靶序列滴定IC来确定，优选取低端值，然后通过稀释国际通用的标准样品来作标准曲线。
在另一个实施方式中，如本文所描述，按照本领域技术人员所熟知的标准方法将IC连接到从样品中分离出的RNA上。然后用反转录酶将RNA反转录成cDNA。可将该cDNA序列用标记的引物进行扩增(如通过PCR方法)。分离扩增产物，通常用电泳方法分离，测定所掺入的标记物的量(与扩增产物的量成正比)。然后通过与已知标准所产生的信号进行比较计算出样品中mRNA的量。
上面所描述的引物和探针可用于以聚合酶链式反应(PCR)为基础的方法来检测生物样品中的HAV感染。PCR是用于扩增核酸分子或分子混合物中靶核酸序列的技术。在PCR中，需使用过量的引物对与靶核酸的互补链杂交。聚合酶以靶核酸为模板将引物延伸。延伸产物与原来的靶核酸链解离后其本身又变成靶序列。然后新引物与之杂交并被聚合酶延伸，随着循环次数的增加，靶序列分子的数量呈几何级数增长。扩增样品中靶核酸序列的PCR方法是本领域所熟知的，描述于Innis等(编辑)《PCR手册》(Academic Press，NY 1990)；Taylor(1991)《PCR操作方法》中的“聚合酶链式反应基本原理及自动化”，Mcpherson等(编辑)，Irl Press，Oxford；Saiki等，(1986)Nature 324163；以及美国专利Nos.4,683,195、4,683,202和4,889,818。
具体地说，PCR使用相对较短的寡核苷酸引物，引物位于所要扩增的靶核苷酸序列两侧，两个引物的3’末端彼此相对，每个引物都朝向另一个引物延伸。聚核苷酸样品提取后经变性，优选通过加热变性，然后与过量的第一引物和第二引物杂交。在4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPS--dATP，dGTP，dCTP和dTTP)存在的条件下用引物-和模板-依赖性聚核苷酸聚合剂如各种能产生引物延伸产物的酶催化聚合反应，聚合酶包括大肠杆菌的DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、从Thermus aquaticus分离出的热稳定的聚合酶(Taq)、各种商品酶(Perkin Elmer)、Thermus thermophilus(United States Biochemicals)、Bacillusstereothermophilus(Bio-Rad)或Thermococcus Litoralis(″Vent″聚合酶，New EnglandBiolabs)。聚合反应产物为两个“长产物”，两个产物的5’端各自包含相应的引物，其后共价连接者新合成的原始链的互补链。然后将反应混合物从新置于聚合反应条件下，例如降低温度、灭活变性剂或者增加聚合酶，第二个循环于是开始。第二个循环有两个原始链、两个第一循环的长产物和从长产物复制出的两个“短产物”。短产物具有靶序列的序列，并在两个末端各带一个引物。每一个循环增加两个长产物和许多短产物，短产物的数目等于长产物的数目加上上一循环结束时留下的短产物数目。因此，含靶序列的短产物的数目随着循环次数呈指数级增长。PCR最好用市售热循环仪进行，如Perkin Elmer。
RNA可通过将mRNA反转录成cDNA然后按照上述方法进行PCR(RT-PCR)来扩增。或者，美国专利No.5,322,770所述，这两个步骤可使用同一个酶。还可以将mRNA反转录成cDNA后进行不对称间隙连接酶链式反应(RT-AGLCR)，就如Marshall等，(1994)PCR Meth.App.480-84所述。
荧光5’核酸酶分析即TaqManTM分析(Perkin-Elmer)是一个高效且多效的以PCR为基础的核算目标检测系统。因此，可将来源于本文所描述的HAV基因组的引物和探针用于TaqManTM分析以检测生物样品中是否有HAV感染。该试验与热循环联用，监测荧光信号的产生情况。该分析系统不需要进行凝胶电泳，并且能定量检测靶序列的拷贝数。
利用AmpliTaq GoldDNA聚合酶可以很方便地进行荧光5’核酸酶分析，该酶具有5’核酸内切酶活性，该酶消化同时以有荧光报道染料和淬灭剂标记的内部寡核苷酸探针(见Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)887276-7280；以及Lee等，Nucl.Acids Res.(1993)213761-3766)。通过测定扩增循环中荧光强度的变化就可以得到分析结果，因为扩增循环中，荧光探针被消化后，染料标记与淬灭剂标记解离引起荧光信号增强。
扩增产物可在溶液中检测或者用固相支持物检测。这种方法中，TaqManTM探针应设计为可与PCR产物内的靶序列杂交。TaqManTM探针的5’端含荧光报道染料，其3’端被封闭以避免探针延伸并含有一个可淬灭5’荧光团所发荧光的染料。在随后的扩增过程中，如果反应液中的聚合酶具有5’外切酶活性就会将5’荧光标记物切下，由此导致检测到荧光增强。
所以，本发明内容之一涉及采用具有5’到3’外切酶活性的核酸聚合酶、能与HAV靶序列杂交的一个或多个引物以及能与位于引物3’端的HAV靶序列杂交的寡核苷酸探针来扩增靶HAV核苷酸序列的方法。在扩增过程中，寡核苷酸探针与靶序列杂交后被聚合酶消化，使得报道分子与淬灭分子分离。随着扩增的进行，可逐渐检测到报道分子的荧光，这样的荧光表征了核酸的扩增。报道分子优选荧光素染料，淬灭分子优选罗丹明染料。
引物和探针的长度可以改变，探针序列应该具有比引物序列更高的解链温度。探针序列所预计的解链温度最好比扩增引物序列的解链温度高出约10℃。所以，引物通常比探针短。一般来说，引物的长度为10-75个核苷酸，更优选的是20-45个核苷酸。探针的长度通常在10-50个核苷酸之间，更优选的是15-40个核苷酸之间。
对TaqManTM分析及其所用试剂和反应条件的详细描述见Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.(1991)887276-7280；美国专利Nos.5,538,848、5,723,591和5,876,930。
本文所描述的HAV序列也可作为转录介导的扩增(TMA)试验的基础。TMA是一种检测生物样品中极少量靶核酸序列的方法。如此含量的序列用直接检测方法很难或不可能检测到。具体地说，TMA是一种等温自催化核酸靶序列扩增系统，可以扩增出10亿以上靶序列的RNA拷贝。该方法可以是定性的，即精确地检测生物样品中是否存在靶序列。该方法也可以在几个数量级的浓度范围内定量检测靶序列。TMA可自催化合成靶核酸序列的多个拷贝而不用重复调整如温度、离子强度和pH等反应条件。
一般来说，TMA包括以下步骤(a)从怀疑被HAV感染的感兴趣的生物样品中分离核酸，包括RNA；以及(b)制备含下列物质的反应混合物(i)分离的核酸，(ii)第一和第二寡核苷酸引物，第一引物具有与可能存在的RNA靶序列(如(+)链)3’端部分足够互补从而可的与之形成复合物的复合序列，第二引物具有与可能存在互补RNA靶序列(如(-)链)3’端部分足够互补从而可的与之形成复合物的的复合序列，其中第一寡核苷酸引物在所述复合序列的5’端还含有一段带启动子的序列，(iii)反转录酶或RNA和DNA依赖性DNA聚合酶，(iv)选择性降解RNA-DNA复合物中RNA链的酶(如RNA酶H)，以及(v)能识别启动子的RNA聚合酶。
反应混合物中的各组分可先后混合也可以一次混合。反应混合物在能形成寡核苷酸/靶序列复合物的条件下孵育足够的时间以获得靶序列的大量拷贝，所述条件包括核酸转录启动和核酸合成条件(包括核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核苷三磷酸)。反应条件最好保持反应组分如酶的稳定并且无需在扩增反应过程进行修改或调整。因此，反应条件可以是基本恒温，且离子强度和pH也基本恒定。该反应不需要通过变性来将第一轮DNA延伸反应中产生的RNA-DNA复合物分离。
适宜的DNA聚合酶包括反转录酶，如禽髓母细胞过多症病毒(AMV)反转录酶(可从Seikagaku America，Inc.购买)和Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(可从Bethesda Research Laboratories购买)。
适于掺入到引物内的启动子或启动子序列是能被RNA聚合酶特异性识别并结合从而启动转录由此获得RNA转录产物的核酸序列(天然的、合成的或限制性内切酶消化产物)。该序列可以比RNA聚合酶实际识别位点长，这样可以增加稳定性或对降解过程的敏感性或提高转录效率。可用的启动子的例子包括能被某些噬菌体聚合酶识别的启动子，如那些噬菌体T3、T7或SP6来源的启动子或大肠杆菌的启动子。这些RNA聚合酶很容易购买到，如从New England Biolabs和Epicentre购买。
适用于本发明方法的反转录酶有些具有RNA酶H活性，如AMV反转录酶。然而，即使用的是AMV反转录酶，最好还是采用外源RNA酶H，如大肠杆菌的RNA酶H。RNA酶H很容易买到，如从Bethesda Research Laboratories购买。
利用这些方法制备的RNA转录物可作为模板通过上述机制制备更多的靶序列拷贝。该系统是自催化性的，不需要重复修改或调整反应条件如温度、pH、离子强度等就可以自动催化进行扩增。
检测的方法多种多样，其中包括直接测序、用序列特异性的寡聚物杂交、凝胶电泳以及质谱法。这些方法可采用异质形式或同质形式，可以用放射性标记物，也可以用非放射性标记物，或者根本不用标记物。
优选检测方法之一是利用上述靶序列特异性的寡核苷酸探针。可将探针用于杂交保护分析(HPA)。在这个实施方式中，探针以吖啶酯(AE)标记，AE是一个高强度化学发光分子。见Nelson等，(1995)《非同位素探针、杂交和测序》中的“根据化学发光检测吖啶酯”，Kricka L.J.(编辑)Academic Press，San Diego，CA；Nelson等，(1994)，《聚合酶链式反应》中的“杂交保护分析(HPA)用于PCR”，Mullis等(编辑)Birkhauser，Boston，MA；Weeks等，Clin.Chem.(1983)291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)342087-2090。一个AE分子通过非核苷酸连接臂直接连接到探针上，这个连接臂可使标记物放置到探针的任何位置上。见美国专利Nos.5,585,481和5,185,439。化学发光可通过与碱性过氧化氢的反应来激发，反应产生的激发态N-甲基吖啶酮，它回复基态时会发出一个光子。
当AE分子共价连接到核酸探针上时，其在弱碱性条件下很快水解。如果AE标记的探针与靶核酸完全互补，则AE水解的速率大大降低。因此，杂交的和未杂交的AE标记的探针不需要通过物理方法就可以直接在溶液中测知。
HPA一般由下列步骤组成(a)AE标记的探针与靶核酸在溶液中杂交约15到30分钟。然后加入弱碱溶液，未杂交探针上偶联的AE被水解。该反应大约需要5到10分钟。检测留下的与杂交体偶联的AE作为靶核酸的量。这个步骤大约需要2到5秒。差异水解步骤优选采用与杂交步骤相同的温度，一般为50-70℃。或者，可在室温下进行第二次差异水解。这次可使用较高的pH，如pH10-11，这样杂交的和未杂交的AE标记探针之间水解速率的差异就会扩大。关于HPA的描述见美国专利NOS.6,004,745；5,948,899515以及5,283,174。
有关TMA的描述见美国专利NO.5,399,491。在一标准方法实施例中，分离出的怀疑含有HAV靶序列的核酸样品与缓冲浓缩物混合，缓冲浓缩物中含有缓冲剂、盐、镁、核苷三磷酸、引物、二硫苏糖醇及亚精胺。反应可在约100℃孵育约2分钟使各种二级结构变性。冷却到室温后，加入反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H，混合物在37℃孵育2-4小时。然后对产物进行分析，即将产物变性，加入探针溶液，60℃孵育20分钟，加入特异性水解未杂交的探针的溶液，60℃孵育6分钟，在光度计上测定留下的化学发光强度。
很容易理解的是，本文所描述的试验方法可以做出大量的修改，这些修改都是本领域所熟知的。上面的说明书只是作为一个指导，本领域的技术人员利用本领域熟知的技术很容易对本文描述的方法做出修改。
上面所描述的试验用试剂，包括引物、探针、结合有探针的固相支持物以及其他检测试剂可以试剂盒的形式提供，再配以说明书和其他必需的试剂，这样就可以进行上述的试验。
试剂盒通常包括装在各自容器内的以下试剂引物和探针(已经结合在固相基质上，或者另有将其固定到基质上的试剂)、对照(阳性对照和/或阴性对照)、试验可能需要的标记试剂以及如果标记物不能直接产生信号时的信号产生试剂(如酶底物)通常还包括指导如何进行试验操作的说明书(书写的、打印的、VCR、CD-ROM等)。根据所进行的试验的不同，试剂盒还可以包含其他试剂和材料(如洗涤缓冲液等)。如上面所描述的标准方法可用这些试剂盒进行。
III.试验下面所描述的是实现本发明的具体实施方式
的实施例。实施例只是用于说明，而不意味着以任何方式对本发明的范围作出限制。
我们已经尽了最大努力确保所使用数字的准确性(如数量、温度等)，但是某些实验误差和偏差仍在所难免。
在下面的实施例中，所用的酶都是购买的，并按照厂商的说明书来使用。硝酸纤维素滤膜等也是购买的。
在分离RNA和DNA片段时，除非特别指出，所有有关RNA和DNA的操作都是按标准程序进行的。见上述的Sambrook等。限制性内切酶、T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段及其他生物试剂均可从生产厂家买到并按照厂商的说明书来使用。双链核酸片段以琼脂糖电泳上分开。
实施例1从生物样品中提取HAV RNAHAV核酸阳性血清购自BioClinical Partners(Berkeley，CA)。用两种方法从样品中分离核酸。具体地说，通过(a)结合到二氧化硅上；(b)与靶-特异性寡核苷酸复性来提取RNA。
(a)通过结合到二氧化硅上分离核酸利用Boom，R.等，(1990)“纯化核酸的快速而简单的方法”，J.Clin.Microbiol.28，495-503所描述的方法通过结合到二氧化硅上来提取RNA。在存在高浓度的高离液盐如异硫氰酸盐胍的情况下，核酸可以结合到二氧化硅上。小的核酸在酸性pH条件下结合二氧化硅的效率更高。结合的核酸在低盐、碱性pH缓冲液、高温条件下很容易被洗脱下来。利用磁化二氧化硅代替普通二氧化硅可大大促进核酸分离中洗涤和洗脱。用磁性底来捕捉结合了核酸的二氧化硅颗粒，这样就无需沉淀普通二氧化硅颗粒所必需的离心。
所用的裂解缓冲液购自Organon-Teknika(Durham，NC)。这种裂解缓冲液所含有的异硫氰酸盐胍可溶解蛋白和灭活RNA酶和DNA酶。去污剂Triton X-100可促进细胞结构和核蛋白的溶解和分解从而释放出核酸。裂解试剂被酸化后可增强核酸的结合，用50μl碱性洗脱缓冲液洗脱结合的核酸。用预先分装好的9.0ml裂解剂从2.0ml HAV IgM阳性血浆中提取核酸。用磁化二氧化硅(MagPrep颗粒，购自Novagen，Madison，WI)捕捉结合了核酸的二氧化硅颗粒，这样就无需沉淀普通二氧化硅颗粒所必需的离心。结合的核酸在50μl含1mM EDTA、pH为9.0的10mM Tris中洗脱。分离出核酸以后，通过下述TaqManTMPCR确定HAV是否存在。
(b)通过与靶-特异性的寡核苷酸复性来分离核酸虽然利用磁化二氧化硅加快并简化了洗涤和洗脱步骤，但是分离核酸仍然费力费时。因此可以用磁珠从血浆或血清中一步分离出特定靶核酸。为了使这种方法可适用于各种病毒核酸捕捉试验故采用偶联寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(寡聚dT)的通用磁珠。带有约14bp寡聚dT的Sera-Mag磁性寡聚(dT)磁珠(Seradyn，Indianapolis，IN)与捕捉寡核苷酸联合使用，捕捉寡核苷酸在其3’末端含有一个于HAV特异性序列相连的聚A尾巴(位于下述特异性序列的末端)。
磁珠悬浮于0.4m1无引物的TMA裂解缓冲液(GenProbe，San Diego，CA)中，分别加入或一起加入捕捉引物进行试验。捕获以后，用洗涤缓冲液洗涤磁珠三次，洗涤缓冲液是含0.3M NaCl的10mM Hepes(pH7.5)、0.5％NP-40。捕获了核酸的磁珠悬浮在100μl TaqMan一步RT-PCR试剂中，然后转移到TaqManTMRT-PCR微量滴定板上进行以下TaqManTMPCR检测。TaqManTM分析结果表明，几种寡核苷酸组合物可有效捕获HAV。
所用的捕捉寡核苷酸如下(序列后的数字对应于该序列在HAV基因组内的位置，所述HAV基因座为NCBI登录号K02990。捕捉序列是所示位置的反向互补序列，因为HAV是正链RNA病毒)
CGGCGTTGAATGGTTTTTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt483-503，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO4)TCACCAATATCCGCCGCTGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt451-474，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO5)AATTTAGACTCCTACAGCTCCATGCTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt291-319，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO6)TTGACCCCGCCGGGCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(264-280，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO7)GAGCCTAGGGCAAGGGGAGAGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(233-255，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO8)AGCCTATAGCCTAGGCAAACGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(73-95，加上一个22bp聚A尾巴，p＝磷酸化的)(SEQ ID NO9)实施例2通过TaqManTM检测HAV RNA用TaqManTM技术扩增捕获的靶RNA。为此设计了几个HAV特异性的寡核苷酸扩增引物。引物如下5’非翻译区的扩增引物和探针VHAV1-GGATTGATTGTCAGGGCTGTC(正向引物-nt538-558)(Seq ID No.1)VHAV2-CCCTCTCACAGGATCCCATTT(反向引物-nt612-632，反向互补)(Seq ID No.2)VHAV3-XCCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACCATTTZ(探针-nt576-605)(Seq ID No.3)其中X＝6-FAM(荧光素)，Z＝接头+TAMRA(四甲基罗丹明)。
将实施例1的核酸稀释成约100IU/20μl。TaqMan分析所用的试剂来自AppliedBiosystems，Foster City，CA。TaqManTM反应混合物的终体积为50ml，含25mlTaqManTM一步RT-PCR混合物，每种扩增引物0.5pmol，0.2pmol探针。反应条件为48℃进行30分钟RT反应，10分钟96℃的酶活化，然后在95℃进行45个循环，每个循环进行30秒，最后在ABI 7900序列检测仪上60℃反应30秒。使用正向PCR扩增引物VHAV1、反向引物VHAV2和探针VHAV3。
制备721nts的内对照转录物，图4B(SEQ ID NO17)，该转录物可被捕获和扩增，但其探针结合序列被改变。图4B所示序列中的黑体字代表IC中代替靶序列(图4A，SEQ ID NO16)相应部分的序列。IC的探针序列示例是xCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz(SEQ ID NO18)或xCCCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz(SEQ ID NO19)，其中x＝TET，z＝接头+TAMRA。
实施例3检测扩增的效率和捕捉寡核苷酸组合根据NCBI K02990的序列合成HAV的5’UTR核苷酸序列。将这个序列克隆到M13质粒中得到单链DNA，纯化所得单链DNA。
(a)扩增效率克隆的及纯化后的DNA的浓度通过分光光度法测定，以10,000到0.5Cps的DNA稀释液进行各次TaqMan扩增，所用的方法、引物和探针如前所述。一般来说，在45个循环以内样品的信号阈值大于0.2就认为是阳性。表1显示了详细的试验结果。
表1
(b)捕捉寡核苷酸混合物捕捉/引物混合物的效率用25Cps/反应的ssDNA来检测。含SEQ ID NOs4、5、6、7、8和9序列的捕捉寡核苷酸的混合物效率最高。
以上描述了新的HAV序列和利用这些序列进行检测的方法。根据前面的描述，虽然本文为了说明本发明已经描述了本发明的一些具体实施方式
，但是本发明的精神和范围还包括各种修改形式。
权利要求
1.一种长度不超过60个核苷酸的游离寡核苷酸，包含(a)具有选自SEQ ID NOs1、2和3的序列中至少10个连续核苷酸的核苷酸序列；(b)与(a)的核苷酸序列有90％一致性的核苷酸序列；或者(c)(a)和(b)的互补序列。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中的寡核苷酸是具有选自SEQ ID NOs1、2和3的序列中至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQ ID NO1。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQ ID NO2。
5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQ ID NO3。
6.如权利要求5所述的寡核苷酸，该寡核苷酸在其5’和/或3’末端还含有可检测标记物。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸，其中的可检测标记物是选自下列一组的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
8.用于扩增甲型肝炎病毒核酸的一对引物，所述的引物对分别由含SEQ IDNO1和SEQ ID NO2的引物构成。
9.一种检测生物样品中甲型肝炎病毒(HAV)的方法，该方法包括从怀疑含有HAV的生物样品中分离核酸；用至少两个来源于HAV基因组5’UTR区的引物扩增所述分离核酸，其中每个引物的长度为10-60bp，并且分别与所述分离核酸的正义链和反义链的部分序列具有足够的互补性以与之杂交；以及检测扩增的核酸，如有扩增的核酸则表明样品中存在HAV。
10.如权利要求9所述的方法，其中，(a)引物之一含有SEQ ID NO1中的至少10个连续核苷酸，另一个引物含有SEQ ID NOs2中的至少10个连续核苷酸，或者(b)引物序列与(a)所述核苷酸序列具有90％的一致性；以及检测扩增的核酸，如有扩增的核酸则表明样品中存在HAV。
11.如权利要求9所述的方法，其中，将核酸从生物样品中分离的方法包括(a)使结合了含捕捉核酸的固相支持物与生物样品在杂交条件下接触使靶核酸链与捕捉核酸杂交；以及(b)从样品中分离固相支持物。
12.如权利要求11所述的方法，其中的固相支持物包含小珠。
13.如权利要求12所述的方法，其中的小珠是磁珠。
14.如权利要求13所述的方法，其中分离、扩增和检测在一个容器内进行。
15.如权利要求11所述的方法，其中的捕捉核酸含有一种或多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸的长度都不超过60个核苷酸并含有选自SEQ ID NO10、SEQID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的序列中的至少10个连续核苷酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中的捕捉核酸在其3’或5’端还含有一个约15-25个核苷酸的同聚物链，所述同聚物链选自聚A、聚T、聚G、聚C和聚U。
17.如权利要求16所述的方法，其中的同聚物链是聚A链。
18.如权利要求9所述的方法，其中扩增方法包括PCR、转录介导的扩增(TMA)或TaqMan。
19.如权利要求18所述的方法，其中扩增方法包括TMA。
20.如权利要求18所述的方法，该方法还包括利用含可检测标记物的寡核苷酸探针检测扩增序列的步骤，其中寡核苷酸探针的长度不超过约60个核苷酸并含有SEQ ID NO3中的至少10个连续核苷酸。
21.如权利要求20所述的方法，其中探针在其5’末端和3’末端含有可检测标记物。
22.如权利要求21所述的方法，其中可检测标记物是选自下列一组的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
23.一种检测生物样品中甲型肝炎病毒(HAV)感染的方法，该方法包括(a)使固相支持物与含一种或多种寡核苷酸的捕捉核酸接触，所述一种或多种寡核苷酸具有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ IDNO13和SEQ ID NO14的序列，接触在能使捕捉核酸连接到固相支持物上的条件下进行，(b)使步骤(a)后的固相支持物与生物样品在杂交条件下接触使样品中可能存在的HAV来源的靶核酸链与捕捉核酸杂交；以及(c)将步骤(b)后的固相支持物与样品分开；(d)用含SEQ ID NO1的正向引物和含SEQ ID NO2的反向引物扩增核酸，其中正向引物和反向引物分别与分离核酸的正义链部分和反义链的部分序列充分互补以与之杂交；以及(e)检测扩增的靶核酸序列，如有扩增的靶核酸序列则表明样品中存在HAV。
24.如权利要求23所述的方法，其中的固相支持物包含小珠。
25.如权利要求24所述的方法，其中的小珠是磁珠。
26.如权利要求25所述的方法，其中分离、扩增和检测是在一个容器内进行。
27.一种检测生物样品中是否存在甲型肝炎病毒(HAV)的试剂盒，该试剂盒包括；含有一种或多种寡核苷酸的捕捉核酸，其中每种寡核苷酸的长度都不超过约60个核苷酸并具有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ IDNO13和SEQ ID NO14的序列中的至少10个连续核苷酸；至少两个引物，其中(a)每个引物的长度不超过约60个核苷酸，引物之一含有SEQ ID NO1中的至少10个连续核苷酸，另一个引物含有SEQ ID NO2中的至少10个连续核苷酸；以及鉴定HAV感染的文字说明。
28.如权利要求27所述的试剂盒，该试剂盒还包括聚合酶和缓冲液。
29.如权利要求27所述的试剂盒，该试剂盒还包括寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的长度不超过约60个核苷酸并含有SEQ ID NO3中的至少10个连续核苷酸。
30.如权利要求29所述的试剂盒，所述探针在其5’末端和3’末端还含有可检测标记物。
31.如权利要求30所述的试剂盒，所述可检测标记物是选自下列一组的荧光标记物6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2′，4′，5′，7′，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
全文摘要
本发明公开了甲型肝炎病毒基因组保守区来源的甲型肝炎病毒特异性的引物和探针。本发明还公开了利用捕捉寡核苷酸、引物和探针的核酸分析方法。
文档编号C12Q1/70GK1675378SQ03819416
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月12日 优先权日2002年6月12日
发明者V·石亚马拉 申请人:希龙公司