Mcam抑制剂的制作方法

专利名称：Mcam抑制剂的制作方法
背景技术：
恶性肿瘤脱落细胞，它们迁移至新的组织并产生继发性肿瘤。产生继发性肿瘤的过程被称为转移，它是一个复杂的过程，其中肿瘤细胞移植至远离原发性肿瘤的部位。转移是一个多步骤过程，其中肿瘤细胞脱离原发性肿瘤，侵袭细胞基质，渗透过血管，从而进入循环系统(内渗)，在远处停止迁移，退出血流(外渗)并生长。(参阅，如，G.L.Nicolson(1982)Biochim.Biophis.Acta.695，113-176；G.L.Nicolson和G.Poste(1983)In.Rev.Exp.Patho1.25，77-181；G.Poste和I.J.Fidler(1980)Nature 283，139-145；和E.Roos(1984)Biochim.Biophis.Acta.738，263)。已提出肿瘤的转移过程涉及细胞粘附分子(CAM’s)，它们介导了细胞-细胞之间或细胞-基质之间的相互作用。
在多种肿瘤中上调的细胞粘附分子是MCAM。MCAM也已知为MUC18、Mel-CAM或CD 146。MCAM是一种表观分子量为113000Da的内在膜糖蛋白。它包含五个免疫球蛋白样结构域，且其胞质结构域含有数个蛋白激酶识别基元，这表明在细胞信号传导中涉及MCAM(参阅，C.Sers等(1993)Proc.Nat.Sci.USA 90，8514-8518)。
文献(Xie等(1997)Cancer Res.57，2295-2303)显示非侵袭性SB-2细胞在经MCAM cDNA转染后变成侵袭性的。他们还证明了抗MCAM的单克隆抗体可抑制此人工诱导的侵袭。不过，以蛋白质过表达的研究为基础确定蛋白质的生理学作用是不安全的和推测性的，解释过表达试验的结果需要非常小心是科研中一条公认的准则。举例说来，基于过表达试验，已提出过氧化物酶蛋白质PEX11在脂肪酸氧化中起作用。文献(Li和Gould(2002)J.Cell Biol.156(4)643-651)中细致的试验表明PEX11在过氧化物酶体分配中不具有这样的功能和取代作用。
蛋白质生理学作用的确定是决定干扰此蛋白质功能是否是疾病治疗的一条可能途径的先决条件。必须记住的是，在生理学条件下，即，在天然存在的患者肿瘤细胞中，MCAM与能调控和改变MCAM功能的其它蛋白质一起过表达。这是MCAM与决定MCAMs生理学作用的相关蛋白质之间在功能上的相互作用。文献Shih(1999)J.Pathol 189，4-11通过证明MCAM的生理学作用涉及它与其尚未鉴定配体之间的相互作用证实了这一点。重要的是，与MCAM相互作用的蛋白质的表达在组织与组织间有所不同(Shih等(1997)Cancer Res.57(17)，3835-3840)，为此原因在其中必定观察到MCAM过表达的结果。利用另一类型肿瘤(即乳癌)获得的结果也证实了这一点。Shih等(1997)Am.J.Pathol.151(3)，745-751显示在此过程中侵袭被MCAM的高水平表达所抑制。在此过程中MCAM起到了肿瘤抑制剂的作用。为此，在侵袭和转移中MCAM的生理学作用尚未清楚。
转移形成的过程取决于肿瘤细胞的侵袭力。因此，这对于鉴定抑制侵袭并由此阻止原发性肿瘤转移的分子以及随后的药物开发将是有用的。
发明概述发明者的成绩是以无偏筛选(unbiased screen)鉴定可抑制天然存在肿瘤细胞多肽(特别是抗体和抗体片段)侵袭力的分子，所述分子作为上述的抑制剂与MCAM的细胞外结构域结合。
本发明涉及所述多肽，它可以与MCAM的细胞外结构域特异结合并且抑制MCAM的功能。在优选的实施方案中，这些多肽是抗体片段或抗体。此外，如果需要，本发明的多肽可用可检测基团标记或可以作为生物缀合物的一部分。
本发明还涉及包含本发明多肽以及任选的药用可接受添加剂和稀释剂的组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及编码本发明多肽的核酸分子，以及含有所述核酸的载体和含有所述载体的宿主细胞。
在又一实施方案中，本发明涉及利用抑制MCAM功能的分子制备药物用于治疗或防止天然存在的癌细胞的侵袭和/或转移，其中所述癌细胞的侵袭力和/或转移潜能取决于MCAM功能。在另一实施方案中，这样的分子特异结合已表达的MCAM并且抑制MCAM的侵袭和/或转移功能。所述分子是与MCAM的细胞外结构域结合的小化合物或某些多肽，特别是本发明的多肽或生物缀合物。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗或防止患者体内发生侵袭和/或转移的方法，其中所述癌细胞的侵袭和/或转移潜能取决于MCAM的功能。
在另一实施方案中，本发明涉及确定天然存在癌细胞的侵袭对于MCAM功能的依赖性的方法。
在另一实施方案中，本发明涉及抑制肉瘤细胞侵袭的抗体片段的鉴定方法，特别是与MCAM的细胞外结构域结合的所述抗体片段的鉴定方法。
发明详述为了能更充分的了解本文所述的发明，进行了以下的详细说明。用于此处时，除非另外指出，否则应使用以下定义。
用于此处的“多肽”是含有10个以上、优选20个以上、最优选30个以上氨基酸且少于10000个、更优选少于2500个、最优选少于1000个氨基酸的分子。此外，还包括具有较高氨基酸同一性的多肽以及含有低百分率已修饰的或非天然氨基酸的多肽。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”用于此处时是指任何免疫结合剂，包括多克隆和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，将抗体划归为五个主要种类中的一种IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的数种被进一步划分为亚类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，等等。相应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定区被分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
抗体还可选自经修饰的免疫球蛋白，例如，对于本发明相应抗体片段而言，在其CDR区域内特别是在其CDR3区域内呈现较高氨基酸序列同一性且基本保持与相应抗体片段相同的与MCAM亲和性的化学或重组产生的抗体、CDR移植抗体或人源化抗体、定位诱变抗体。
抗体的CDR(互补性决定区)是这些分子中决定其特异性并使其与特异配基结合的部分。CDR是分子中最可变的部分并且造成了这些分子的多样性。它们在结构上局限于人IgG内轻链的第24-41位(CDR-L1)、50-57位(CDR-L2)和90-101位(CDR-L3)氨基酸和重链第26-38位(CDR-H1)、51-70位(CDR-L2)和100-125(CDR-H3)氨基酸(参阅Kabat等(1987)第四版，US Department of Healthand Human Services，Public Health Service，NIH，Bethesda)。本领域技术人员通过将抗体片段与所述人IgG进行比对并且鉴定相应与人IgG CDR的抗体片段的氨基酸，可以很容易的确定抗体片段的CDR区域，如，利用可以进行“Blast”的NCBI软件，从而将两种序列相互比较。
较高氨基酸序列同一性用于此处时是指两种被比对的氨基酸序列中至少70％的氨基酸、优选至少85％的氨基酸、更优选除了5个氨基酸之外的所有氨基酸、还更优选除了3个氨基酸之外的所有氨基酸以及更优选除了1个氨基酸以外的所有氨基酸，特别是比对的CDR是相同的。
术语“抗体片段”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子片段，此术语包括诸如scFv、dsFv、Fab’、Fab、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(DAB)、二体等抗体片段。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中是众所周知的(参阅Kabat等(1991)J.Immunol.147，1709-19)，在此特别将它们收编作为参考。
“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间能使scFv形成预期结构用于抗原结合的多肽接头。
“Fv”片段是保持完整抗原结合位点的最小抗体片段。“dsFv”是通过二硫化物稳定的Fv。“Fab”片段是抗原结合片段，含有与重链VH和CH1结构域配对的完整轻链。“Fab”片段是被还原的F(ab’)2片段。F(ab’)2片段是二价片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段。
“单结构域抗体(DAB)”是只具有来自抗体结构中仅一个结构域的一条(代替了两条)蛋白链的抗体。对于一些抗体而言，抗体分子的一半几乎象完整分子一样很好的与其靶抗原结合，Dab就是利用了这一发现(Davies等(1996)Protein Eng.9531-537)。
“二体”是二价的或双特异性的抗体，其中VH和VL结构域表达于一单一多肽链上，但使用的接头太短以至不能使同一条链上的两个结构域之间配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生了两个抗原结合位点(Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448)。
术语“标记”或“被标记”分别指可检测标记物或这些标记物的掺入，例如，通过掺入荧光团-、发色团-或放射性标记的氨基酸或者将荧光团、发色团或放射标记附着于多肽上或者附加通过被标记的第二种分子可检测的组分，所述被标记的第二种分子含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记或酶活性。这样一种两步检测方法的例子是众所周知的生物素-亲和素系统。在本领域中已知并可以使用各种方法标记多肽和糖蛋白(例如，参阅，Lobl等(1988)Anal.Biochem.，170502-511)。
“表位”包括能特异结合免疫球蛋白或抗体片段的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，诸如暴露的氨基酸、氨基糖或其它碳水化合物侧链等，且通常具有特殊的三维结构特性以及特殊的电荷特性。
本文所述“天然存在的癌细胞”是还未经过转染、转导或实验室中其它遗传工程处理的细胞。这样的细胞不包含如载体等人工DNA序列或只在其它物种中发现但在该天然存在癌细胞的来源物种中不经常能找到的DNA序列。不过，天然存在的癌细胞中可以包含在其来源物种中不经常发现的序列，只要那些序列是由病毒感染或突变过程以及天然存在癌细胞来源个体中进行的选择引起的以及/或在天然存在癌细胞的持续培养中产生的即可。
本发明上下文中优选使用和/或处理的选定的癌细胞类型包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原发性神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管气泡癌、上皮腺癌、以及它们的肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维耳姆斯氏瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，以及重链和轻链疾病，还有子宫颈腺癌、子宫和卵巢上皮癌、转变中的膀胱细胞癌、B细胞和T细胞淋巴(结节状的和扩散状的)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、软组织肉瘤和/或平滑肌肉瘤。
“治疗转移性肿瘤”，用于此处指肿瘤的转移被防止、延迟或抑制。
“转移性肿瘤”用于此处时包括在原发位点的能转移的肿瘤和在继发位点的已转移的肿瘤。这样的转移性肿瘤的组织来源可以是肺、肝、肾、胃、小肠、骨、脾、脑、周围神经系统、甲状腺、胰腺、子宫内膜、卵巢、宫颈、皮肤、结肠或淋巴组织。
“侵袭力”用于此处是细胞迁移穿越一层其它细胞的能力或迁移穿越胞外基质的能力。侵袭力可以通过实施例5所述的Matrigel测定进行评估。根据在一定保温期间到达过滤膜底面的细胞数估计侵袭的情况。在如实施例5的侵袭测定中，当6-12小时内40％以上的天然存在的癌细胞到达滤膜另一侧并形成集落时，这种天然存在的癌细胞被定义为侵袭性的。相反对照细胞在同一时限内只形成5％的集落，并且因此被定义为非侵袭性的。
用于此处时“粘附性”是细胞在从其生长的基质上迁移走、以单个细胞溶液悬浮(不与溶液中的其它细胞直接接触)并再次铺于其有可能粘附的基质上后重新附着的能力。如果在实施例7中所述的测定中，在30-120分钟的时间内有40％以上的细胞粘附，则该细胞被定义为具有粘附性。然而，在同一时限内只有5％的对照细胞粘附。
用于此处时“增殖”是真核细胞(例如哺乳动物细胞)增生并自身分裂成子代细胞的能力。例如，在细胞培养物中，增殖导致总细胞数目随着时间而增加。
用于此处时，转移潜能是肿瘤细胞在远离其来源的原发性肿瘤部位形成新肿瘤(转移瘤)的能力。通过将例如1×106个细胞注射入无胸腺裸鼠的侧部尾静脉并在例如注射2个月后测定肺中肿瘤结节的数目来估量转移的潜能，参阅，例如Huang等(1996)Oncogene 132339-2347第2346页的“肿瘤细胞注射章节；或Radinsky等(1994)Oncogene 91877-1883第1882页的“动物和肿瘤的产生和“钙化基质的组化分析章节。此测定中在肺内产生3个以上、优选8个以上、更优选20个以上肿瘤结节的细胞系被认为是转移性。
治疗有效量是消除或降低患者肿瘤负荷的量或预防或减少转移的量。剂量取决于许多参数，包括肿瘤的特性、患者的病史、患者的状况、可能共同使用的细胞毒剂和给药方法。给药方法包括注射(如，肠胃外的、皮下的、静脉内的、腹膜内的注射，等等)，其中抑制MCAM功能的分子在药用可接受载体中提供。一般而言，选择合适的载体和稀释剂，诸如水、盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、5％的人血清白蛋白、不挥发性油、油酸乙酯或脂质体，使其不会显著削弱结合剂的生物活性(如，结合特异性、亲和性或稳定性)。可接受载体可包括生物相容的、惰性的或生物可吸收的盐、缓冲剂、寡糖或多糖、多聚体、诸如透明质酸等粘弹性化合物、粘度改进剂、防腐剂，等等。此外，药用组合物或制剂还可包括其它载体、佐剂、或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。典型的剂量范围为约0.01至20mg/kg，或者更具体而言是从约1mg/kg至约10mg/kg。
应用抑制MCAM功能的分子进行治疗的方法可与化疗、手术和放疗结合，取决于肿瘤的类型、患者的状况、其它健康组织和多种因素。
“抑制MCAM功能的分子”是导致MCAM活性被抑制的分子。可以通过测定MCAM生物活性的一个或多个指征，诸如MCAM依赖性侵袭或MCAM依赖性粘附，来评估此MCAM生物活性的抑制。MCAM生物活性的这些指征可以通过数种体外或体内测定法中的一种或多种进行评估(参阅，实施例5、7和6.2)。优选的，通过对MCAM诱导的侵袭性人肉瘤细胞(特别是实施例5、7和6.2中所用的细胞)的侵袭、粘附或增殖的抑制作用来评估分子抑制MCAM活性的能力。
本发明的“抑制MCAM功能的分子”不是作为蛋白质作用普通抑制剂的分子，如蛋白酶，如变性剂，例如尿素或盐酸胍，如重金属原子或如与生物分子(脂类、蛋白质、糖)共价和非特异反应的小分子(如，醛或异氰酸盐)。抑制MCAM功能的分子的特征在于在某一浓度抑制MCAM功能的能力，它在此浓度不抑制胰岛素受体(例如，按抗磷酸酪氨酸蛋白质印迹检测法所测定的，参阅，例如，B.Cariou等(2002)J Biol Chem.，277，4845-52)和乙酰胆碱受体(如，根据Ca流入量的检测测定的，参阅，M.Montiel等(2001)Biochem Pharmacol.63，337-42.)以及B-CAM细胞表明糖蛋白(例如，按文献Udani等(1998)J.Clin.Invest.101(11)2550-2558中第2551页的“流动腔测定法(Flow chamber assays)”部分所述，通过测定血红蛋白A红血细胞(AA RBCs)与固定化层粘连蛋白的结合)的功能。只有抑制MCAM功能但在同一浓度不显著影响所提及的其它三种受体功能的分子才是用于本专利中时抑制MCAM功能的分子。按上述侵袭测定法中MCAM功能所定义的，抑制作用被理解为，与同一实验条件下不含本发明分子的阴性对照相比较，功能下降了至少30％，优选下降40％，更优选下降50％，还更优选下降60％。如果本发明分子所引起的功能减弱小于20％、更优选小于15％、还更优选小于10％，则此分子被认为不显著影响其它三种受体的功能。
此外，就抑制MCAM基因表达的本发明分子而言，当其实验浓度为10nM至100μM(优选1μM左右)时，利用经过存在的β微管蛋白水平校准的定量western印迹法进行测定，发现这样的分子使MCAM的表达减少了50％以上，更优选80％以上，还更优选90％以上，最优选95％以上，其中MCAM的量是在另外两个相同的样品之间进行比较，在其中一个样品中本发明的分子可以抑制MCAM的表达。在同一实验中，本发明的分子不会使每个细胞中存在的β微管蛋白的量下降超过20％，且所述分子不会使胰岛素受体和B-CAM细胞表面糖蛋白的相对水平下降超过20％。
另外，就本发明的多肽、特别是本发明的抗体或抗体片段而言，当所述抗体片段浓度为1nM至50μM(优选大约20μM)时，如果在如同实施例5的实验中本发明的多肽能使天然侵袭性癌细胞的侵袭力减少了30％以上，更优选60％以上，那么就认为本发明的多肽抑制了MCAM的生物功能。
另外，就本发明的小化合物而言，当浓度为10nM至100μM(优选大约1μM)时，如果在如同实施例5或7的实验中所述化合物能使天然侵袭性癌细胞的侵袭力减少了30％以上，更优选60％以上，却不影响细胞形态、细胞周期进程(通过碘化丙锭染色和FACS检验分析细胞群中的DNA含量进行测定)，而且不会提高培养物中表现出凋亡迹象的细胞的百分数(例如，用所谓的隧道测定法，通过检测表现出DNA片段化的细胞的百分数进行测定)，那么就认为所述化合物抑制了MCAM的生物功能。用于此发明中的小化合物是分子量50Da和10000Da之间、优选100Da和4000Da之间、更优选150Da和2000Da之间的分子或者它们的生理可接受盐。
此处所提及的“特异结合MCAM”或“特异于MCAM”的分子是在实施例1和2给定的条件下结合表达MCAM的HT1080细胞，但不结合Hs-27细胞或MCAM阴性的SBcl-2细胞的分子(Shih等(1997)CancerRes.57(17)，3835-3840)。也就是说，当所述分子的测试浓度为0.1nM至10μM、优选1nM至1μM、还更优选10nM至500nM、最优选约100nM时，它于HT 1080细胞的结合比与Hs-27细胞或SBcl-2细胞的结合至少高2倍、优选高5倍、最优选高20倍。
另外，这样的分子与MCAM的结合常数低于10μM，优选低于1μM，更优选低于100nM，最优选为0.1nM至20nM。结合常数可以用，例如类似BIACORE系统的标准方法按制造商手册的说明书进行测定。
术语“至少一种”用于此处时是指“一种或多种”，具体而言是一种、两种、三种、四种和五种。
本发明首次证实了对于特异的、天然存在的肿瘤细胞而言，它们的粘附、侵袭和/或转移过程中基本上都涉及了MCAM的表达和作用。本发明提供了无偏筛选方法用于鉴别抑制MCAM功能的分子。
因此，本发明涉及能与MCAM细胞外区域特异结合并抑制MCAM侵袭、增殖、粘附和/或转移功能的分子或多肽。符合本发明的多肽含有至少一种选自以下种类的序列SEQ ID NO.39至SEQ ID NO.57，它们代表在结合类似如MCAM等肿瘤特异细胞表面分子中特别涉及到的CDR的序列；或SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.33，它们代表在结合类似如MCAM等肿瘤特异细胞表面分子中特别涉及到的scFv的序列。
在一个实施方案中，本发明的多肽是抗体片段，特别是scFv、dsFv、Fab’、Fab、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体或二体，更具体而言是scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或二体，还更具体而言是scFv、单结构域抗体或二体，更优选scFv。
在另一实施方案中，本发明的多肽是抗体，在某一优选的实施方案中是抗体来源于scFv抗体片段，在另一优选的实施方案中是多克隆抗体或单克隆抗体，特别是人的单克隆抗体。
在另一实施方案中，抗体或抗体片段的CRD3区域与表1中通过下划线标出的scFv序列的相关核苷酸所显示的CDR3区域之一相同的。
抗人MCAM结合抗体可选自经修饰的免疫球蛋白，例如，对于本发明相应抗体片段而言，在其CDR区域内特别是在其CDR3区域内呈现较高氨基酸序列同一性且基本保持与相应抗体片段相同的与MCAM的亲和性的化学或重组产生的抗体或人源化抗体、定位诱变抗体。
在另一实施方案中，本发明的多肽是选自以下的人类抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，特别是IgG和IgM，更具体而言是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4。
在本发明的另一优选实施方案中，用可检测标记物标记本发明的多肽，尤其是本发明的抗体片段或抗体。具体而言，可检测标记物的例子有放射性同位素、发色团、荧光团、酶或放射性同位素。可检测标记物可选自，例如，这些种类。
在另一实施方案中，本发明的多肽可分别共价或非共价的缀合和/或偶联至另一蛋白质、固相基质(如，珠子)上，与其自身一起形成多聚体，如，进一步增强其对靶细胞毒性的细胞毒剂、细胞抑制剂、原药或能修饰表达MCAM的细胞或使免疫细胞募集的效应分子。所有这些缀合物都是本发明的“生物缀合物”。
细胞毒剂的名单中包括，但不局限于，道诺霉素、紫杉酚、阿霉素、甲氨蝶呤、5FU、长春碱、放线菌素D、鬼臼亚乙苷、顺铂、阿霉素、染料木黄酮、adnribosome抑制剂(如，天花粉蛋白(trichosantin))或各种细菌毒素(如，假单胞菌外毒素；金黄色葡萄球菌蛋白A)。
用各种双功能蛋白质偶联剂制备含本发明多肽(特别是本发明抗体片段或抗体)和所述细胞毒性部分的生物缀合物。所述试剂的一些例子包括N-琥珀酰亚胺3-(2-二硫吡啶)-丙酸酯(SPDP)、诸如盐酸二甲基adipimidate(dimethyl adipimidate HCl)等亚氨酸酯的双功能衍生物、诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯等活性酯、诸如戊二醛等醛、诸如his(R-叠氮苯甲酰)己二胺等bisazido化合物、诸如双-(R-重氮苯甲酰)乙二胺等bisdiazonium衍生物、诸如亚苄基2，6-二异氰酸酯等二异氰酸酯和诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯等双活化的氟化合物。用于产生生物缀合物的方法详见March’s高级有机化学反应、机制和结构(March’s Advanced OrganicChemistryReactions，Mechanisms and Structure)，第五版，Wiley-Interscience；或生物缀合技术(Bioconjugate Techniques)，编辑Greg Hermanson，学术出版社。
可利用本发明的生物缀合物或多肽(特别是本发明的抗体或抗体片段)检测与转移相关的MCAM抗原的表达。从受试者中提取样品，如，从疑似具有转移性肿瘤的组织中获取活检标本。一般而言，在进行测定前处理样品。可利用的测定包括ELISA、RIA、EIA、western印迹分析、免疫组化染色等等。根据所使用的测定法，可以用酶、荧光团或放射性同位素标记抗原或抗体(参阅，如，Coligan等(1994)免疫学通用方法(Current Protocols in Immunology)，John Wiley&SonsInc.，纽约，纽约州；和Frye等(1987)Oncogene 41153-1157)。
因此，本发明的一个实施方案涉及利用至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的标记的多肽和/或至少一种本发明的生物缀合物来用于检测MCAM。例如，可利用本发明的一种多肽或本发明的一种已标记多肽或本发明的一种生物缀合物检测MCAM，或者可以将一种已标记的多肽与一种生物缀合物或两种或三种多肽或两种已标记的多肽一起利用。对于这样的检测而言，多肽将与MCAM的细胞外区域结合。MCAM的细胞外区域被定义为细胞膜外侧的MCAM蛋白部分，特别是在第24位氨基酸和第553位氨基酸之间的胞外氨基酸环。MCAM应当理解是糖蛋白，因此不仅是所提及的氨基酸，其中的糖修饰也被认为是MCAM胞外区域的一部分。
在另一实施方案中，本发明包括了诊断试剂盒。这样的试剂盒含有至少一种生物缀合物和/或至少一种本发明的已标记多肽和/或至少一种本发明的多肽，尤其是本发明的抗体片段或抗体，或者它们的标记形式，另外还有进行标准竞争性或夹心检测所必需的试剂和材料。所述诊断试剂盒可用于测定生物样品的侵袭潜能，特别是某些种类癌细胞的侵袭潜能。试剂盒通常包含一容器。
通过利用本发明的多肽，特别是本发明的抗体片段或抗体，还有可能产生抗独特型抗体，它可以用于筛选抗体以鉴定该抗体是否具有与本发明的人单克隆抗体相同的结合特异性并且能用于活性免疫接种(Herlyn等(1986)Science，232100)。用众所周知的杂交瘤技术可产生这样的抗独特型抗体(Kohler等(1975)Nature，256495)。抗独特型抗体是识别存在于目的抗体上的独特决定簇的抗体。这些决定簇位于抗体的高变区。此区域与给定的表位结合，因此造成了抗体的特异性。可通过用目的多肽，特别是目的抗体片段或抗体免疫动物制备抗独特型抗体。被免疫的动物会识别并响应进行免疫的抗体的独特型决定簇并产生针对这些独特型决定簇的抗体。通过利用抗独特型抗体，有可能鉴别表达具有同一表位特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤。
还可能利用模拟某一表位的抗独特型技术产生单克隆抗体。例如，针对第一种单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体在其高变区具有结合结构域，它是第一种抗体所结合表位的“影像”。从而，这种抗独特型单克隆抗体抗体可用于免疫接种，因为这种抗独特型单克隆抗体结合结构域可有效的用作抗原。
在另一实施方案中，如果用侵袭测定法进行检测(参阅实施例5)，本发明的多肽，特别是本发明的抗体片段或抗体使侵袭性肿瘤细胞的侵袭力减少了30-60％，或优选减少了30-55％、40-50％或甚至至少减少了60％。尽管优选通过多肽与MCAM的细胞外结构域的特异结合减少侵袭力，但按照另一实施方案，还可以通过多肽与诸如整合蛋白或ephrins等其它表面分子结合来降低侵袭力。
在另一实施方案中，如果用粘附测定法检测(见实施例7)，本发明的多肽，特别是抗体或抗体片段使侵袭性肿瘤细胞的粘附减少30-60％，或优选30-55％、40-50％或甚至至少60％。
在另一实施方案中，如果用增殖测定法检测(见实施例6.2)，本发明的多肽，特别是抗体或抗体片段使侵袭性肿瘤细胞的增殖减少30-60％，或优选30-55％、40-50％或甚至至少60％。
在另一实施方案中，本发明的抗体片段特异识别MCAM的一个或多个表位、或MCAM保守变体的表位、或MCAM的肽片段。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明分子，特别是选自下列分子本发明的小化合物、抑制MCAM基因表达的分子、本发明的生物缀合物或多肽，更具体而言是本发明抗体片段或抗体作为药物的的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及含有效量的至少一种(具体而言是一种)本发明分子、特别是本发明多肽或核苷酸序列中的至少任一种、或至少一种抑制MCAM基因表达的分子以及药用可接受载体和/或稀释剂的组合物。药用组合物可用于治疗人MCAM过表达或异位表达相关的病症，尤其是治疗转移性肿瘤，尤其是来自上述种类癌细胞的转移性肿瘤。
在本发明的另一实施方案中，提供了药物组合物，其中含药用可接受载体和治疗有效量的至少一种抑制MCAM功能的分子，特别是通过与MCAM的细胞外区域结合抑制MCAM功能的分子，更具体而言是其中的分子是本发明的小化合物、核酸序列、多肽或生物缀合物，还更具体而言的分子是本发明的抗体片段，还更优选其中的分子是本发明的scFv或来源于本发明所述scFv的抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及在药用可接受组合物中给药抑制MCAM功能的分子，特别是其中的分子通过受体介导的途径抑制MCAM的基因表达。
或者，抑制MCAM功能的分子可以特别是能结合MCAM细胞外区域的分子，更具体而言，其中的分子是小化合物或本发明的抗体或抗体片段或多肽或本发明的生物缀合物，还更具体而言，其中的分子是本发明的抗体片段，更优选其中所述分子是本发明的scFv或来源于所述本发明scFv的抗体。
本发明还涉及通过重组技术产生本发明多肽的方法。这些技术在本领域中是众所周知的(Skerra等(1993)，Curr.Opin.Immunol.5，256-62；Chadd等(2001)，Curr.Opin.Biotechnol.12，188-94)。
例如，可分离编码本发明多肽、特别是抗体片段或抗体的核酸序列(如，编码表1或2的抗体片段或其抗体的基因)并克隆入一个或多个多核苷酸表达载体，且所述载体可转化入适当宿主细胞系用于本发明重组多肽表达。编码本发明多肽的基因的表达可以为提高多肽的产量作准备，还可为通过引入氨基酸取代、删除、添加和其它修饰来进行多肽的常规修饰作准备，例如在本发明抗体片段可变区和恒定区这两个区域内的人源化修饰(Rapley(1995)Mol.Biotechnol.3139-154)，所述修饰不会造成结合特性或MCAM阻断功能的关键性丧失(Skerra等(1993)Curr.Opin.Immunol.5256-262)。
本发明因此涉及上文提及的分离核酸分子，它们编码本发明任一种多肽，特别是本发明的抗体片段，更具体而言是本发明的scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或本发明的二体，还更具体而言是scFv、单结构域抗体、本发明的二体或来源于所述本发明scFv的抗体，更优选本发明的scFv或来源于所述本发明scFv的抗体。
在优选的实施方案中，本发明涉及编码含有选自以下序列的多肽的核酸分子SEQ ID NO.39至SEQ ID NO.5 7，它们代表在结合如MCAM等肿瘤特异细胞表面分子中特别涉及到的CDR的序列；或SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.33，它们代表在结合如MCAM等肿瘤特异细胞表面分子中特别涉及到的scFv的序列。
此外，本发明的分离核酸序列包含选自以下的任一种核酸序列SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.38。
本发明还涉及在严谨条件下与SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.38中任一序列杂交的核酸序列。用于此处的术语“在严谨条件下”指只允许高同源性(优选高于70％)核酸序列聚集的杂交条件和温度。典型的杂交条件对于本领域技术人员而言是众所周知的。简而言之，对于要求高特异性的应用而言，我们通常期望利用相对较低的盐浓度和/或高温条件，诸如在50℃至70℃温度提供0.02M-0.15M的NaCl。
本发明还涉及含有本发明核酸的载体。具体而言的载体是质粒、噬菌粒或粘粒。
例如，本发明的核酸分子可以以适当的形式克隆入原核或真核表达载体(Sambrook等，“分子克隆实验室手册(Molecular cloninga laboratory manual)”第二版，冷泉港实验室出版社(1989))。这样的表达载体包含至少一个启动子、至少一个翻译起始信号、至少一种本发明的核酸序列-在原核表达载体的情况中-还有翻译终止信号，而在真核表达载体的情况中，优选另外转录终止信号和聚腺苷酸化信号。
原核表达载体的例子，对于大肠杆菌中的表达而言，是例如美国专利4,952,496中所述的基于T7 RNA聚合酶所识别的启动子的表达载体，对于酿酒酵母中表达所用的真核表达载体而言，是例如载体p426Met25或526GAL1(Mummberg等(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，对于昆虫细胞中的表达而言，是例如EP-B1-0127839或EP-B1-0549721中所述的杆状病毒载体，而对于哺乳动物细胞中的表达而言，是例如载体Rc/CMV和Rc/RSV或SV40-载体，它们是通常已知的且商品化的。
产生这些表达载体的分子生物学方法以及转染宿主细胞并培养该转染宿主细胞的方法和从所述被转化宿主细胞中产生和获取本发明多肽的条件都是技术人员众所周知的。
本发明还涉及含有本发明核酸和/或本发明载体的宿主，具体而言其中的宿主细胞是微生物，如酵母或其它真菌，如大肠杆菌、枯草杆菌或其它细菌。宿主细胞还可以是高级真核生物来源的细胞，如昆虫细胞，优选被病毒感染的昆虫细胞，更优选杆状病毒感染的昆虫细胞，或如COS、MDCK 293-EBNA1、NS0等哺乳动物细胞或杂交瘤细胞。
本发明还涉及产生本发明多肽、特别是本发明抗体片段的方法，包括培养以含有本发明多肽(特别是本发明抗体片段)编码DNA的重组载体转化的微生物，并从培养基中回收所述本发明多肽、特别是本发明抗体片段或含有它的融合蛋白。
本发明表明，阻断MCAM的功能会抑制说明书前面所列举癌细胞类型来源的某些癌细胞的侵袭力，特别是抑制选定癌细胞的侵袭力，如，来源于人肉瘤细胞、上皮肿瘤、间充质肿瘤、网状内皮组织肿瘤、神经系统肿瘤、畸胎瘤的细胞，更优选人肉瘤细胞。
因此，本发明的某一实施方案是至少一种(具体而言是一种)抑制MCAM功能的分子用于制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防天然存在癌细胞的侵袭和/或转移，其中所述癌细胞的增殖、粘附、侵袭和/或转移潜能取决于MCAM的功能。
在另一优选的实施方案中，抑制MCAM的分子抑制了已表达MCAM的功能。在本发明的上下文中，已表达的MCAM应被理解为在开始任何类型治疗之前就已出现于天然存在癌细胞上的MCAM蛋白质。具体而言，这些分子是结合受体的细胞外区域并通过内部途径抑制MCAM表达的分子。
更具体而言，这样的分子选自小化合物、抗MCAM抗体、抗MCAM抗体片段、本发明的多肽、本发明的抗独特型抗体和/或本发明的生物缀合物，尤其是其中的分子是本发明的多肽和/或生物缀合物。
在另一优选实施方案中，其增殖、粘附、侵袭和/或转移潜能依赖于MCAM功能的天然存在癌细胞可以是选自前述组织或癌细胞类型的任何癌细胞，具体而言，它们可以是以下组织来源肺、肝、肾、胃、小肠、骨、脾、脑、周围神经系统、甲状腺、胰腺、子宫内膜、卵巢、宫颈、皮肤、结肠或淋巴组织，更具体而言，癌细胞是肉瘤细胞。
本发明还涉及可作为药物靶目标的MCAM抗原。本发明的另一方面涉及以高中和能力结合人MCAM的抗体片段。
在本发明的另一实施方案中，将至少一种本发明的多肽和/或本发明的生物缀合物用于鉴定特异结合人MCAM的其它分子，特别是在筛选测定中。这些方法中，在推定竞争性待测结合剂存在的情况下将参照的抗MCAM抗体片段与含MCAM结构域的靶物质结合。在适于参照抗体片段和靶物质之间于缺乏待测结合剂时形成复合物的条件下完成这一接触步骤。检测参照抗体片段和靶物质之间在存在待测结合剂时的复合物形成作为待测结合剂与MCAM特异结合活性的指征。这一筛选方法可用于如其它抗体文库或抗体片段文库、反义寡核苷酸文库或肽和小分子文库的高通量筛选，从而识别和鉴定另外“与MCAM特异结合的分子”。通过下述试验测定竞争作用，其中待测抗体片段或其它测试结合剂基本上抑制参照抗体片段与含MCAM结构域的靶物质的特异结合。可以通过，例如，检测在存在和缺乏推定竞争剂的条件下参照抗体片段与含MCAM结构域的靶物质之间的结合，即，在适于复合物形成的条件下检测“特异结合MCAM的分子”来测定竞争作用。如文献美国专利4,376,110中所述，已知多种类型的竞争结合测定法且它们通常可应用于本发明中。一般而言，这样的测定包括使用含MCAM结构域的靶物质(如，纯化的MCAM或表达MCAM抗原的细胞系)、未标记的“特异结合MCAM的分子”和已标记的对照抗体片段或其它结合剂。通过测定在“特异结合MCAM的分子”存在的条件下结合于靶物质上的标记物的量来检测竞争性抑制作用。通常“特异结合MCAM的分子”是过量存在的。通过这些竞争性测定法(“竞争性结合剂”)鉴定的“特异结合MCAM的分子”包括与对照抗体片段所结合表位或结合位点结合的抗体、抗体片段、肽、反义寡核苷酸、小分子和其它结合剂，以及与对照抗体片段所结合表位足够近的表位或结合位点结合的“特异结合MCAM的分子”。优选的，当过量存在时，本发明的竞争性结合剂抑制对照抗体片段与选定靶物质的特异结合至少达10％，优选至少25％，更优选至少50％，还更优选至少75％-90％或更多。
除了本发明的多肽外，能特异定性于人MCAM的本发明抗体片段或抗体、天然或人造的配体、肽、反义寡核苷酸或其它小分子都可应用。以本发明为基础，可将药物设计成与人MCAM结合或有另外的相互作用并且抑制人MCAM。在这点上，合理的药物设计技术，诸如X-射线晶体分析法、计算机辅助(或协助)分子模拟(CAMM)、定量或定性结构-活性相关性测定(QSAR)及类似技术都可用于新药开发上。通过合理的设计可以预测能与蛋白质或其特殊部分相互作用的分子。这样的分子结构可以化学合成和/或表达于生物体系中。小分子可以按照本领域众所周知的方法通过合成有机化合物而产生。可以合成多种肽、半肽化合物或非肽化合物和有机化合物并随后进行筛选以寻找以高中和能力与MCAM结合的化合物。具体而言，抑制MCAM的化合物与侵袭相关。通常参阅文献Scott和Smith，“用表位文库搜寻肽配体(Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library)”，Science(1990)，249，第386-90页和Devlin等，“随机肽库特异蛋白质结合分子的来源(Random Peptide LibrariesA Source ofSpecific Protein Binding Molecules)”，Science，(1990)，249，第40407页。
本发明还提供了在体外或体内用抗体或抗体片段抑制人MCAM活性或检测肉瘤细胞中人MCAM的方法。在优选的实施方案中，用一种或多种抗体片段处理表达抗原的细胞引起或导致人肉瘤细胞增殖或粘附的减少并/或抑制了它们的侵袭能力。
肿瘤细胞迁移进入组织是转移中重要的一步。可在跨内皮的模型(transendothelial model)中研究粘附和侵袭过程(参阅，Woodward等，(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci 43，1708-14和Vachula等(1992)Invasion Metastasis 12，66-81)。跨内皮的模型为研究扩散过程中细胞的相互作用提供了一个有效的体外体系。本发明因此还提供了用于测定天然发生侵袭性癌细胞的侵袭力对MCAM功能的依赖性体外方法。此方法包括如下步骤●使细胞与抑制MCAM功能的分子接触；●在适于所述癌细胞生长的条件下使癌细胞与凝胶样基质接触；并●测定所述癌细胞穿越形成凝胶的基质的迁移。
用于此处的术语“凝胶样基质”被理解为是水含量至少达90％的半固体物质，它使得癌细胞可与基质接触培养并使侵袭性癌细胞能迁移穿越0.1mm-1mm优选厚度为0.3mm的所述“凝胶样基质”层，但非侵袭性细胞则不能迁移。这样的“凝胶样基质”的例子有，类似蛋白质中细胞外基质的物质和碳水化合物的组合物，具体而言，有商品化的“Matrigel”。具体而言，“凝胶样基质”包含选自IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白中的一种蛋白质。更具体而言，凝胶样基质包含IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。更优选凝胶样基质包含IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、触觉蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
在优选的实施方案中，步骤a)的干扰分子是特异结合MCAM细胞外表位的多肽，具体而言是本发明的多肽，更具体而言是本发明的抗体或抗体片段，还更具体而言是抗体片段，更具体的说是scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或二体，尤其是scFv、单结构域抗体或二体，更优选scFv。
本发明还提供了通过筛选原初抗体片段噬菌体展示文库，鉴定特异结合MCAM细胞外区域的抗体或抗体片段的方法，其中这些抗体片段或抗体(参阅有关抗体噬菌体展示的文献WO 91/17271)能抑制且特别是抑制了肉瘤细胞的侵袭。所述方法包括以下步骤●使抗体片段噬菌体文库与扩散性肉瘤细胞接触；●分离所述细胞；●在所述细胞不裂解的条件下去除与所述细胞非特异结合的噬菌体，例如，通过用缓冲去污剂溶液洗涤所述细胞；●洗脱与所述细胞结合的噬菌体；并●测定洗脱下来的所述噬菌体展示的抗体或抗体片段的特性。
展示获自步骤d)的抗体或抗体片段的噬菌体的特性可通过，如对编码抗体或抗体片段的DNA进行测序来测定，或者在利用商品化的网格(gridded)或编号噬菌体文库时，通过测定噬菌体的网格位置或编号来测定。那么网格位置和编号就能显示噬菌体所展示的抗体或抗体片段的特性。
步骤d)之后富集与MCAM结合的噬菌体。那些与MCAM结合的噬菌体最终可以用本领域已知的各种方法进行鉴定。噬菌体可被分离形成单菌落且噬菌体菌落可用标记的MCAM蛋白或MCAM蛋白质的被标记部分(例如，MCAM细胞外结构域的至少7个氨基酸长的肽)进行探测。与这样的探针结合的菌落被确定为MCAM结合菌落。噬菌体还可在纯MCAM蛋白或重组MCAM上进行亲和纯化。
或者，可将来自整个富集库的编码抗体或抗体片段的开发阅读框架重新克隆入表达载体中，然后抗体或抗体片段可以表达于另一宿主细胞的克隆中，并且通过，例如上述鉴定相关噬菌体克隆的方法、实施例2或9的方法或通过用重组MCAM进行亲和纯化可以鉴定携带含有特异结合MCAM的抗体或抗体片段的编码核酸的表达载体的宿主细胞克隆。
这一方法的具体优势在于得到了特异于MCAM细胞外区域可接近部分的抗体或抗体片段，因为最初的选择步骤是在完整细胞上进行的，这些细胞展示出MCAM细胞外区域中对于噬菌体结合来说可接近的部分。
在本发明优选的实施方案中，以上方法包含代替步骤e)的更多步骤●使分离的噬菌体与重组MCAM接触；●用缓冲去污剂和/或高盐溶液洗涤所述MCAM；并●洗脱与MCAM结合的噬菌体；并●测定洗脱下来的所述噬菌体展示的抗体或抗体片段的特性。
在某些实施方案中，表达于噬菌体上的抗体片段包含选自以下的抗体或抗体片段scFv、dsFv、Fab’、Fab、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(DAB)和二体，更具体而言选自scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或二体，还更具体而言选自scFv、单结构域抗体或二体，更优选scFv。
步骤c)和f)中所用的“去污剂”是去污剂溶液，优选缓冲溶液，可以是浓度为0.001-0.5％、特别是0.01-0.1％的Tween。步骤f)中的“高盐”是高盐溶液，优选缓冲溶液，且具有10mM-1M的离子强度，具体而言是20-500mM，更具体而言是50-350mM，还更优选80-250mM。典型的有效阴离子是，例如，氯化物、柠檬酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐或硼酸盐。典型有效的阳离子是，例如，钠、钾、锂、钙或镁。
以上段落中的缓冲溶液通常pH值为7-8。例如，DMEM或PBS可用作缓冲液，特别是其中含有1-20％的FCS，更具体而言是含5-15％，还更优选约10％的FCS。
通过在200-300g温和离心3-20分钟，具体而言是5-10分钟，分离结合了噬菌体的细胞。通过用2-100mM甘氨酸洗涤来洗脱与细胞和与固定化MCAM结合的噬菌体，具体而言是4-50mM、更具体而言是5-20mM、还更优选约10mM的甘氨酸，pH为0-2.5，具体而言是1-2.5，更具体而言是1.5-2.5。
可以如上所述体内或细胞培养实验中检测这些抗体片段(具体而言是这些scFv)的MCAM抑制活性。细胞培养物测定包括在如实施例5和7所述的侵袭或粘附试验中测定本发明抗体片段抑制作用的检测。例如，侵袭测定的结果如图2所示。
附图描述

图1显示了HT1080染色细胞穿过8μm滤膜的扩散。37℃保温6小时后对产生的荧光进行定量。显示的数据是3个孔的平均值+/-SD。
图2显示了-以表的形式表示-利用HT1080(人纤维肉瘤)细胞进行的侵袭试验的结果。通过如图6中所示的它们的编号确定待测scFv。符号“*”表示各个scFv-按照图6中所示的它们的编号确定-在进行侵袭试验前被克隆入IgG4的形式(format)中。检测细胞通过基质的侵袭并以％表示对侵袭的抑制作用。
图3显示了-以表的形式表示-在各种细胞类型上进行FACS分析的结果，诸如HT1080(人纤维肉瘤)、KHOS-NP(人骨肉瘤)、MCF-7(人乳腺癌)、BT-474(人乳癌，乳腺)、PC-3(人腺癌，前列腺)、Jurkat(人T细胞白血病)、HL-60(人急性骨髓性白血病)、HeLa(人子宫颈癌)、SW480(人结肠癌)、LS174T(人结肠癌)、HT-29(人结肠癌)，与对照细胞(Hs27(人皮肤成纤维细胞))相比较。结果用平均荧光强度表示，其中0-12的平均荧光强度用(+)表示，13-40的平均荧光强度用(++)表示，而40以上的平均荧光强度用(+++)表示。表3a描述了通过其在图6中所示编号确定的scFv。表3b描述了IgG的FACS结果。符号“*”表示各个scFv-按照图6中所示的它们的编号确定-在进行FACS试验前被克隆入IgG4的形式中。
图4显示了免疫沉淀实验的结果。用SDS-PAGE分离免疫复合物并进行银染。
图5显示了pXP14(SEQ ID No.39)的载体图谱以及scFv表达载体的序列。
图6显示了表1中已鉴定单链的肽序列scFv1至scFc19。被描述肽序列中的CDR3区域以下划线标出。相关的序列编号标在旁边。
图7显示了表2中编码多肽scFv1至scFc19的核苷酸序列。相关的序列编号已被标出。
图8显示了-以表的形式表示-在各种基质上进行的粘附试验的结果，诸如CI(I型胶原蛋白S)、CIV(IV型胶原蛋白)、FN(纤连蛋白)和LN(层粘连蛋白)，用各种类型细胞，诸如HT1080(人纤维肉瘤)、PC-3(人腺癌，前列腺)、HeLa(人子宫颈癌)和HT-29(人结肠癌)。通过如图6中所示的它们的编号确定待测scFv。符号“*”表示各个scFv-按照图6中所示的它们的编号确定-在进行扩散试验前被克隆入IgG4的形式式中。检测粘附作用并以％表示对粘附作用的抑制。对于抑制值而言“+”表示1-10％的抑制，“++”表示抑制值＞10-40％，而“+++”表示抑制值＞40-100％。“n.d.”表示未测定。
图9显示了scFv表达载体pXP10(SEQ ID No.40)的载体图谱和pXP10的序列。
图10显示了用MCAM特异抗体进行免疫组化测定的结果(scFv7*和scFv9*)(scFv7和scFv9克隆入IgG1的形式中)。
图11显示了此大小约为110kDa的带中获取的肽混合物的MALDI-MS光谱(a)。以T标示的两个胰酶自消化峰被用于内部校准。以星号标记的总共15个峰与代表性的MCAM氨基酸序列匹配(SwissProt，P43121)，质量偏差小于13ppm。匹配的肽涵盖了SEQ ID No.58(b)23％(151/646个残基)的氨基酸序列。
图12显示了增殖试验的结果，即，通过IgG的施用使SW-480和PC-3的增殖减少。(在进行增殖试验前将scFv7、scFv9和scFv18克隆入IgG4形式)。在第一种抗体加入后指定的时间点用MTS细胞生存能力测试检测SW-480结肠癌细胞(图12b)和PC-3前列腺癌细胞(图12a)的增殖。数据表示为收集自3个独立实验的培养基对照百分数的平均值。误差范围Tukey HSD 95％可信区间。
图13显示了-以表的形式表示-化合物在无胸腺小鼠中皮下生长的人肿瘤异种移植物内的抗肿瘤作用。将肺腺癌(LXFA)用作异种移植物。该表显示了在化合物注射后第0天和第7天的肿瘤大小。将scFv7*(克隆入IgG1形式的scFv7)用于与Docetaxel进行比较。图中还显示了scFv*与Docetaxel的联合疗法的结果。在注射scFv7*后第7天肿瘤尺寸的大小减小了12％。
以下实施例，包括进行的实验和获得的结果，只供说明用，而并不能解释为对本发明的限制。
实施例实施例1scFv的选择和筛选(悬浮细胞的筛选)单链Fv选自含1011个独立克隆的人源非免疫大噬菌体展示库，由Cambridge Antibody Technology Ltd.，Cambridge，英国提供。
为了进行选择，用0.05％EDTA收获HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞系；ATCC CCL-121)并在DMEM+10％FCS中稀释至1×107个细胞/ml。将2×1012cfu噬菌体/107个细胞在25℃用DMEM+10％FCS预封闭1小时，随后以倒转旋转方式(end-over-end rotation)与用DMEM+10％FCS预封闭的Eppendorf管中的细胞一起25℃保温1.5小时。第一轮选择和第二轮选择分别使用了3×107个细胞和1×107个细胞。在220g离心5分钟洗涤细胞，然后去除上清并将细胞重悬于洗涤缓冲液中。用DMEM+10％FCS+0.05％Tween-20作为洗涤缓冲液进行5次洗涤，用DMEM+10％FCS作为洗涤缓冲液进行5次洗涤。通过添加pH2.2的甘氨酸10mM洗脱被结合的噬菌体，用pH7.4的Tris/HCl 1M中和。通常，103-106cfu噬菌体在第一轮选择中被洗脱，因此富集组分的密度与最初的所有组分相比下降了。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1扩增含富集组分的洗脱液。选择含噬菌粒的大肠杆菌并在补充了100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB琼脂平板上30℃培养过夜进行增殖。这一步之后，富集组分可扩增成多克隆集合并用于以反复方式进行更多轮选择直至得到具预期特性的集合或者在空间上进行分离并在单一克隆的水平上根据预期功能进行筛选。通过用辅助噬菌体VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染指数生长的前一轮选择的培养物产生用于下一轮选择的噬菌体颗粒并将培养物在补充了100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xTY中20℃生长过夜。将完成选择的噬菌体用0.5M NaCl/4％PEG-6000从细菌澄清上清液中沉淀并重悬于PBS中。在此实施例中进行了两轮选择，随后在单一克隆水平上进行筛选。
实施例2scFv的选择和筛选(在粘附细胞上的筛选)为了进行筛选，将包含于噬菌体展示载体中且编码选定scFv的基因重新克隆入表达载体pXP14中。这一载体指导了scFv与Strep标签和E-标签的融合表达且不包含丝状噬菌体基因3。将含表达载体的大肠杆菌TG1单菌落培养于微量滴定板的各个孔中，从而使每个孔中只含有一个scFv克隆。将细菌在96孔微量滴定板(#9297，TPP)中用补充了100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY于30℃培养至OD600为0.7。用终浓度0.5mM的IPTG诱导表达并在25℃继续培养过夜。通过在25℃添加终浓度50μg/ml的鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)1小时并在3000g离心15分钟制备含单链Fv的澄清裂解物。在进行筛选ELISA之前，添加等体积DMEM+10％FCS封闭澄清裂解物1小时。为了进行筛选ELISA，将HT1080细胞以3×104个细胞/孔的密度接种于96孔微量滴定平板(#9296，TTP)中，在DMEM+10％FCS中37℃培养过夜。将孔在37℃用DMEM+10％FCS封闭1小时并在25℃添加含有scFv的已封闭澄清裂解物1.5小时。平板用PBS+0.1％Tween-20洗涤2次，用PBS洗涤1次，与缀合了α-E-标签的HRP(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；1∶5000稀释于含5％脱脂奶粉(#70166，Fluka)和0.1％Tween-20的PBS中)一起保温1小时，用PBS+0.1％Tween-20洗涤3次，用PBS洗涤3次，然后用POD(#1484281，Roche)显色并在370nm波长处读取信号。用上述ELISA筛选方法再次针对HT1080细胞和作为对照的人成纤维细胞Hs-27(ATCC CRL-1634)测试阳性克隆。
在典型的筛选中，筛选1472个(16×92)克隆与HT1080细胞的结合，其中16％的阳性克隆为扣除背景后信号＞0.1的克隆。重新测定238个阳性克隆与HT1080细胞的特异结合，将其与Hs-27对照细胞的结合相比较，28％的阳性克隆是扣除背景后的信号在HT1080上为在Hs-27对照细胞上两倍的克隆。
实施例3a测序和大规模表达用Sequiserve GmbH，Vaterstetten，德国进行scFv基因的测序，所用引物为pXP2 Seq2(5’-CCCCACGCGGTTCCAGC-3’；SEQ ID No.41)和pXP2 Seq1(5’TACCTATTGCCTACGGC-3’；SEQ ID No.42)。氨基酸序列如表1中所示，核苷酸序列如表2中所示。
将测序鉴定的独特克隆从其甘油保存菌中划线接种于LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖琼脂平板并在30℃培养过夜。将单菌落接种于LB/Amp/Glu(1％)培养基10ml中并在30℃200rpm振荡培养过夜。第二天早上将过夜培养物放在冰上直至接种于装在2L Erlenmeyer摇瓶内且补充了100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2xYT培养基1L中。将培养物在25℃振荡培养至OD600达到0.5-0.6，然后用终浓度0.1mM的IPTG诱导。加入新鲜配制的氨苄青霉素50μg/ml并在22℃继续振荡培养过夜。早晨将培养物在4℃5000xg离心15分钟，弃上清并用移液器将沉淀小心的重悬于含完全蛋白酶抑制剂(#1697498，Roche)的预冷PBS-0.5M Na缓冲液10ml中。完成重悬浮后，将细菌悬浮液转移至20ml有螺旋盖的耐压塑料离心管中并加入终浓度50μg/ml的鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)，冰置1小时。将裂解的细菌在4℃20000xg离心15分钟并将上清液(裂解物)转移到15ml塑料管中。为了进行亲和纯化，将裂解物以1ml/分钟的流速加到通过并联蛋白纯化系统(自制的)用10个柱床体积(CV)PBS-0.5M Na缓冲液平衡的1ml StrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱中。用PBS洗10CV后，用5CV的PBS/5mM脱硫生物素(Desthiobiotin)(#D-1411，Sigma)洗脱，分部收集，1ml/管。在UV280检测收集的组分，混合含蛋白质的组分并用Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices10.000MWCO(#UFC801024，Millipore)在4700xg浓缩。用考马斯蓝染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶检查浓缩后的scFv的纯度，分装成等份试样，加入20％的甘油后冻存于-80℃。
实施例3b将scFv克隆入IgG形式并进行表达scFv由接头序列连接的可变轻链和可变重链序列组成。用含限制性位点的引物通过PCR分别扩增可变轻链和可变重链。那些限制性位点也存在于含重链和轻链的适当恒定区的载体中。用限制性酶切割经过扩增的可变区并克隆入切割过的载体中。测序证实序列的正确性。
使用了四种载体，一种包含IgG1形式的重链恒定区。第二种载体包含IgG4形式的重链恒定区，而另外两个载体则分别包含λ和κ轻链的恒定区。不同的限制性切点使载体能被切割并将可变区连接入载体中。
为了在哺乳动物细胞系中表达IgG，载体包含了EB病毒复制起点(oriP序列)，它提高了293-EBNA-HEK细胞中的转录水平，因为EBNA蛋白质引起游离载体的复制。
用重链载体和轻链载体进行共转染，导致两条链都在细胞中表达并在内质网中进行IgG的装配。装配好的IgG随后被分泌到培养基中。磷酸钙转染被作为转染方法使用，其中形成了磷酸钙和DNA的沉淀物，然后进入细胞中。转染后将培养基换成无血清培养基。每3天完成每种IgG的三份样品。将上清液(培养基)无菌过滤并贮存于4℃。
为了纯化IgG，通过自流(gravity flow)或通过取决于体积的HPLC，用蛋白A琼脂糖纯化上清液。对于高达200ml的样品，采用了自流的方法。对于两种纯化而言，都是将上清液加到蛋白A柱上，用pH7的Tris缓冲液50mM洗柱并用pH约为2的0.1M柠檬酸盐洗脱。在洗脱组分中加入pH9的0.25M Tris，使pH达到5.5-6.0。根据IgG的进一步用途，用PBS缓冲液对其进行透析并贮存于-20℃。
实施例4对肿瘤细胞特异结合进行的FACS分析为了检测单链Fv或IgG特异结合靶细胞的能力，我们用HT1080细胞、KHOS细胞、PC-3细胞、BT474细胞、MCF细胞、Hela细胞、Jurkat细胞、HL60细胞、LS174T细胞和SW480细胞(106个细胞/ml)进行了荧光激活细胞分选仪(FACS)分析，以Hs-27细胞(106个细胞/ml)作为对照细胞。将细胞与10μg/ml纯scFv一起在CellWash(BD(Becton，Dickinson和Company)#349524)中4℃保温20分钟，洗涤，并用FITC标记的二抗-抗E-标签mab(Amershan#27-9412-01)检测被结合的scFv。洗涤样品并在Becton DickinsonFACSscan上进行分析。选定scFv的结果如图3表3a中所示。用IgG分析获得的结果如表3b中所示。
实施例5侵袭测定将ChemoTx系统(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)以96孔形式用作可置换的趋化性/细胞迁移室，其中包含8μm孔径大小的滤膜轨迹蚀刻(Tracketched)聚碳酸酯，为5.7mm直径/个位点。
将稀释于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中的13.3μl的0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是一种提取自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤的可溶性基础膜制剂，所述肿瘤富含细胞外基质蛋白质。它的主要组分是层粘连蛋白，然后是IV性胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、触觉蛋白和巢蛋白。它还包含TGF-α成纤维细胞生长因子、组织纤溶酶原激活剂和天然存在于EHS肿瘤中的其它生长因子)(Becton Dickenson，BD#356234)加到96孔板滤膜的B-H行中，在A行中加入稀释于0.05M HCl(Sigma#945-50)中的I型胶原蛋白S(Roche#10982929)1.2μg/个位点，在干燥器中20℃保温过夜使其胶凝化。在补充了GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中将HT1080细胞培养至70-80％汇合。然后在37℃、7.5％CO2的条件下，用1∶100稀释于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)中的Bisbenzimide H33342(Sigma#B-2261)原位标记细胞15分钟。细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤2次并在37℃、7.5％CO2的条件下加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA 15分钟进行回收。用不含Ca++、Mg++的PBS(Gibco，10010-015)洗涤2次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)分离细胞，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集细胞，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤细胞2次，将细胞重悬于Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，并将细胞用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀释至6.7×106个细胞/ml。将6.7×106个细胞/ml以1∶1的比率与作为侵袭抑制阴性对照的40μg/ml HT1080特异scFv1以及与HT1080特异scFv(scFv2-scFv10)一起冰置1小时。在用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀释至6.7×105个细胞/ml后，将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv稀释液一式三份以3.4×104个细胞/孔的密度吸取到趋化性室中(B-H行)并在37℃、7.5％CO2的条件下保温6小时。含5％FCS的DMEM/GlutamaxI的用作较低部室中的化学吸引剂。用I型胶原蛋白S包被的A行趋化性室中的1×104至4×104个细胞/个位点制备标准曲线。在底部室中使用了DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(细胞不移动)。从膜的上部去除未迁移的细胞后(除了A行的标准曲线外)，在Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读数器上用370/460nm的激发/发射波长检测已迁移穿越膜的细胞(在测定标准曲线的情况下不迁移)的荧光。在我们的实验中，45000的值相当于100％的迁移细胞。三份平行试样的平均抑制结果如图2中所示。将每个实验都重复三次，得到了基本相似的结果。通过用上述Transwell培养体系比较它们侵袭肿瘤细胞外基质(Matrigel)的相对能力来评估肿瘤细胞的侵袭表型。
实施例6.1MTS生存能力测定通过测定四唑染料MTS(MTS，Celltiter Aqueous one，Promega#G4000)向甲的转变检测能生存的细胞。将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv稀释液(获自侵袭试验中制备的稀释液)以3.4×104个细胞/孔的密度一式三份加入96孔板(黑色，超薄澄清平底，特殊的光学材料，Costar#3615)中，在每个孔中加入10μl MTS并在37℃、7.5％CO2的条件下保温1小时。用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读数器检测492nm处的吸光度。对于所有被检测的scFv而言，未观察到对细胞生存能力的影响。
实施例6.2增殖测定将SW-480和PC-3细胞培养于含L-谷氨酰胺和10％FCS的RPMI(Invitrogen#21875-034，Carlsbad，California)中。
将SW-480和PC-3细胞以100μl/孔的体积接种于96孔板(Corning Costar#3904，Acton，Massachusetts)的培养基中。将细胞在37℃、5％CO2的条件下保温24小时。吸出培养基并加入稀释于培养基中的抗体15μg/ml或50mM NaN3。对照细胞单独保温于培养基中。在第一次添加抗体48小时后，第二次添加相同浓度的抗体。在第一次处理前、处理后的24小时、48小时和72小时测定MTS吸光度。为此，将10μl CellTiter96 Aqueous One溶液(Promega#G3581，Madison，Wisconsin)加入100μl细胞悬浮液中并将混合物在37℃、5％CO2的条件下保温3小时。在FluoStar平板阅读器(BMGLabTechnologies，Offenburg，德国)中检测492nm处的吸光度。结果如图12中所示。
实施例7细胞-基质粘附试验用溶于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)的I型胶原蛋白S(Roche#10982929)1μg/孔4℃包被96孔板(细胞培养处理的)(TPP#9296)过夜。经Dulbeccos PBS洗涤后，在37℃用2％BSA(Sigma#A-7030)/Dulbeccos PBS封闭1小时并用Dulbeccos PBS洗涤。一式三份吸取HT1080细胞和HT1080细胞/scFv稀释液(获自侵袭试验中制备的稀释液)以3.4×104个细胞/孔的密度加到板上并在37℃、7.5％CO2的条件下保温1小时。用Dulbeccos PBS再洗两次后，非粘附细胞被洗去，稀释于Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中的1×104-4×104个染色细胞/孔(获自侵袭试验中制备的稀释液)的标准曲线在A行中进行。在洗涤后的细胞中加入50μl Dulbeccos PBS并在Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读数器上用370/460nm的激发/发射波长检测附着细胞的吸光度和标准曲线的吸光度。在我们的实验中，数值25000相当于100％的粘附细胞。粘附试验还利用了数种基质蛋白进行，诸如CIV(IV型胶原蛋白)、FN(纤连蛋白)和LN(层粘连蛋白)，以及各种类型的细胞，诸如HT1080(人纤维肉瘤)、PC-3(人腺癌，前列腺)、HeLa(人子宫颈癌)和HT-29(人结肠癌)细胞。除了scFv之外，还检测了按照实施例3.2克隆自单链的IgG抑制肿瘤细胞粘附的能力。结果如图8所示。
实施例8用FACS进行竞争性分析为了检测某些抑制性scFv阻断靶细胞上常见抗原表位的能力，用0.5mM EDTA/PBS收集HT1080单细胞悬浮液。在CellWash(BD，#349524)中将约1×106个细胞与10μg/ml scFv一起在4℃保温1小时。用Cell Wash洗涤后，加入10μg/ml FITC标记的scFv并在4℃保温20分钟。在Becton Dickinson FACSscan上分析经过或未经过与其它结合剂预保温的被结合的FITC标记scFv的信号。
实施例9免疫沉淀在含蛋白酶抑制剂混合物(1粒溶于50ml缓冲液中)(BoehringerMannheim，目录号1697498)和100μM Pefablock(Roth，目录号A154.1)的3ml的50mMTris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，1％Triton X-100(v/v)裂解HT1080和Hs-27细胞(108)。将裂解物与StreptactinSepharose(IBA，#2-1201-010)在4℃预保温2小时并将上清液用于免疫沉淀反应中。将HT1080特异的单链Fv(50μg/mg细胞提取物)加入澄清裂解物中，样品在4℃旋转2小时，700xg温和离心沉淀Streptactin Sepharose，沉淀用PBS+0.1％Tween缓冲液洗涤4次，1ml/次，用溶于PBS 0.1％Tween 20的10mM D-脱硫生物素50μl将复合物从Streptactin Sepharose沉淀上洗脱下来进行分离。免疫复合物用SDS-PAGE分离并进行银染以供MS分析。
scFv 2为一种蛋白质，SDS-PAGE银染检测是分子量约为120kDa的条带。这条带在对照样品Hs-27细胞中则没有。
单链Fv1、3、5、6、7、9、15和19是一种蛋白质，经SDS-PAGE银染检测是分子量约为110kDa的条带。用来自HT1080细胞的细胞提取物进行免疫沉淀，以Hs-27作为对照细胞。可观察到这一特殊条带也存在于对照样品中，但在所有的情况下都要弱得多，表明这种蛋白质可能在HT1080细胞系中过表达。对于scFv3而言，这条带只有在使用HT1080细胞提取物时才被检测到，而用Hs-27细胞则检测不到。
scFv8和10是一种蛋白质，经SDS-PAGE银染检测是分子量约为130kDa的条带。这条带在对照样品Hs-27细胞中则没有。
单链Fv4、11和14是两种蛋白质，经SDS-PAGE银染检测是分子量分别为大约150kDa和大约130kDa的两条带。上一条带也出现于对照样品中，但强度要弱得多，而下一条带则在对照样品中没有或非常微弱，表明这两种蛋白质可能在HT1080细胞系中过表达。
实施例10通过质谱分析法进行蛋白质鉴定获自免疫沉淀并经SDS-PAGE获得的凝胶条带在37℃用胰蛋白酶进行胶内消化过夜。用5％的甲酸提取肽，然后用ZipTip μC18(Millipore)使产生的肽混合物脱盐，第一次用2μl 30％ACN/0.1％TFA洗脱，然后用2μl 70％ACN/0.1％TFA洗脱。收集两次洗脱的组分并将获得的肽混合物1μl以1∶1的比率与α-氰-4-羟基肉桂酸(3mg/ml)混合，在Teflon包裹的不锈钢圆盘上共结晶，然后在MALDI-TOF仪器上进行分析产生的肽质量指纹(PMF)在m/z800-3000质谱范围内。用获得的PMF搜索NCBI和SwissProt数据库中人类(HomoSapiens)物种的所有条目。在所有的情况下，都只有以小于13ppm的质量偏差与给定蛋白质匹配的肽才被认为是与给定蛋白质相同的。
用scFv2获得的、大小约120kDa的条带产生了9-10个肽峰，它们与Ephrin A型受体2匹配，最大蛋白质覆盖率(coverage)为14％(134/976个残基)。
大小约为110kDa的条带在不同的MALDI-TOF-MS实验中产生6-15种肽，它们与细胞表面糖蛋白MUC18前体匹配，最大蛋白质覆盖率为23％(151/646个残基)。在数据库中可以得到同一蛋白质的多个条目，它们在氨基酸序列上略有差异。导致MCAM被确定的MALDI谱如图11a中所示。肽的覆盖率如图11b中所示。
任何黑素瘤粘附蛋白的分子量都约在72kDa左右，但因为预期蛋白质会被糖基化，所以不奇怪会在凝胶上发现约110kDa的条带。
用scFv10获得的、大小约130kDa的条带产生了7条肽，它们与整合蛋白α3匹配，蛋白质覆盖率为6％(71/1019个残基)。
这种蛋白质的分子量在119kD左右，但预期它会被糖基化，因此解释了为何在SDS-PAGE上观察到较大的分子量。
大小约150kDa的带是用scFv11-scFv14获得的两条带中较大的一条，产生了17-21条肽，它们与整合蛋白α2匹配，最大的蛋白质覆盖率为19％(225/1181个残基)。
两条带中较小的那一条大小约为130kDa，产生了9-13条肽，它们与整合蛋白β-1匹配，最大的蛋白质覆盖率为13％(106/798个残基)。
整合蛋白α-2的分子量约为129kDa，而整合蛋白β-1的分子量约为88kDa。不过，预计两种蛋白质都被高度糖基化，这可以解释为何在SDS-PAGE上观察到较高的表观分子量。
实施例11表位作图的方法实施例11.1“传统的”表位作图将针对目的抗原的cDNA限定片段表达为重组(融合)蛋白质并用诸如western印迹或ELISA等多种测定法进行探测。
实施例11.2噬菌体展示技术利用随机肽噬菌体展示文库进行表位作图的技术被发展为，将针对目的抗原的cDNA随机小片段克隆入丝状噬菌体的噬菌体蛋白pIII中并将它们展示于噬菌体的表面(Fack等，(1997)J.Immunol.Methods7，43-52)。可以经过所谓的“生物淘选”的步骤用抗体捕捉展示表位的噬菌体。相应噬菌体的插入序列给出了表位上的一些信息。此方法原则上能够识别构象表位。
实施例11.3肽扫描技术这一技术是以用Fmoc化学方法在活化膜上合成固定化肽为基础的。将氨基酸溶液加到活化膜上导致在膜(该膜用PEG活化)上的氨基和所施加氨基酸的活化羧基之间形成肽键。在每一轮循环之后进行特殊的洗涤步骤、乙酰化、去保护并监测自由氨基。与体内合成蛋白质的膜相反，被结合的寡肽链是从C-末端向N-末端逐步合成。可以合成长达20个氨基酸的寡肽，其中含有天然的和修饰过的氨基酸。寡肽合成后，使膜保持平衡并封闭非特异性的结合位点。在与目的抗体一起保温和数次洗涤后，用与ECL-系统联合的HRP-缀合二抗进行检测。根据所用的抗体，膜可以被清除、再生并重复使用达10次。在固相支持物上合成理论上覆盖目的抗原全部氨基酸序列的小的重叠寡肽。这种方法使得线性表位可以在氨基酸水平上得到鉴定。还可以进行快速的突变研究。
实施例12用免疫组化方法进行组织剖析在含112个肿瘤样本和2个对照的组织微阵列中检测两种抗MCAM抗体(scFv7*和scFv9*-scFv7和scFv9克隆成IgG1形式)与各自靶目标的结合。所述样本是来自生长于裸鼠中的人异种移植物的石蜡切片，且用生物素-链霉亲和素/过氧化物酶/二氨基联苯胺对其进行了染色。与各种肿瘤组织的结合结果如图10中所示。
实施例13在皮下生长的人肿瘤异种移植物中化合物的抗肿瘤作用将肺腺癌(支气管腺癌)用作异种移植物。使用大约7周大的NMRI背景裸鼠，在处理开始时平均体重为35g。在研究开始前检查动物的健康状况以保证只有健康状况良好的动物才被选来进行测试。通过各自耳朵标签号识别小鼠，每一笼都用记录卡标志，卡上标明实验的编号、随机选择的日期、小鼠菌株、性别、各个小鼠的编号、试验化合物、剂量、时间表和给药途径。动物被关在带过滤器罩的III型MacrolonM笼中，空调房室温24±1℃，相对湿度60±10％，喂食Altromin Extrudat 1439大鼠/小鼠饲料、含有0.9g/l山梨酸钾且用1N HCl将其pH调节到2的脱矿质无菌水。每天观察监测水的消耗，随意添加食物和水。动物笼内所铺的Altromin GmbH生产的垫料SAWI经过Jelu Werk分析和检验以及Charles River灭菌和分装，并且每周换两次。以单一高剂量水平(50mg/kg，每周两次，共4周)施用抗体。一组只接受载体，第二组接受scFv7*(scFv序列克隆成IgG1形式)，第三组作为阳性对照接受Docetaxel(20mg/kg)，而第四组接受scFv7*和Docetaxel(50/20mg/kg)的组合。
每组6只小鼠，为了获得含类似肿瘤大小的24只小鼠，将总共64个肿瘤碎片移植入32只小鼠中(两侧移植)。用于移植的肿瘤碎片段获自连续传代的裸鼠中的异种移植物。从供体小鼠中切下肿瘤，将肿瘤切成碎片(直径2-3mm)并放到RPMI 1640培养基中(最多30-45分钟)直至皮下移植入小鼠体内。使小鼠吸入挥发性异氟烷将其麻醉，在背部皮肤上(左侧和右侧)切开两个小切口，每只小鼠中植入两块肿瘤碎片。待肿瘤长到平均直径6-8mm之间时开始进行处理。为了随机选择，按肿瘤直径将动物划分成三类大的组＞8mm；中等组6-8mm之间；小的组5mm。在随机选择的情况下，肿瘤种类在不同组之间是平均分布的。
每周两次检查肿瘤大小和小鼠体重，每天记录死亡率和临床症状。将各个肿瘤的相对体积计算成第x天的肿瘤体积和第0天的肿瘤体积的比率(Tx/T0，第0天是进行随机选择的那天和处理的第1天)。相应的计算各个小鼠的相对体重。绘制出相对肿瘤体积和相对体重对时间的曲线。为了估计抗肿瘤活性，计算具体某一天在抗体处理组和载体处理组中中值相对肿瘤体积的比率(T/C％值)。将抗体鉴定为具有活性的最低要求是最小T/C％值＜50％。每周两次处理携带肿瘤的小鼠，共4周。在试验结束时收集肿瘤以供进行进一步的分析。经不同处理后第7天肿瘤大小的比较如图13所示。为了评估NMRI nu/nu小鼠中抗体的血浆水平，在体内治疗试验期间的6个不同时间点对抗体处理组的小鼠进行舌下取血得到血液样品300μl。在第二次施药前4天和第7次施药前22天测定曲线波谷水平。在第26、27、28、29天收获血液样品(每个时间点收集3个血样)。第4、26、28天的样品取自小鼠1-3号，第22、27和29天的样品取自小鼠4-6号。血样的量足以制备至少100μl血浆。用EDTA制备血浆样品，在-80℃保存待分析。
权利要求
1.含抗体互补决定区CDR编码序列的多肽，所述序列选自SEQID NO.39至SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.33。
2.权利要求1的多肽，其中的多肽是抗体和/或抗体片段。
3.权利要求1或2的多肽，其中的抗体和/或抗体片段包含选自下列的序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.19至SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.33。
4.权利要求2或3的多肽，其中所述抗体选自人IgA、人IgD、人IgE、人IgG和人IgM；具体而言是人IgG或人IgM，更具体而言是人IgG1、人IgG2a、人IgG2b、人IgG3和人IgG4。
5.权利要求1至4任一项的多肽，其中所述多肽用可检测的标记物标记；具体而言其中所述可检测标记选自放射性同位素、酶、荧光团和生色团。
6.包含依照权利要求1至5任一项中的多肽的生物缀合物。
7.编码依照权利要求1至5任一项中的肽或多肽的分离核酸分子。
8.权利要求7的分离核酸分子，其中包含(a)选自以下序列的核酸序列SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.38；(b)在严谨条件下与a)中任一序列杂交的核酸序列。
9.包含依照权利要求7或8的核酸的载体。
10.包含且能够表达依照权利要求7或8的核酸和/或依照权利要求9的载体的宿主细胞。
11.依照权利要求1至5任一项的多肽和/或权利要求6的生物缀合物，依照权利要求7或8的核酸序列，依照权利要求9的载体和/或依照权利要求10的宿主细胞，用作药物治疗增殖性病症或疾病。
12.诊断试剂盒，其包含依照权利要求1至5任一项的多肽、依照权利要求6的生物缀合物、依照权利要求7或8的核酸序列和/或依照权利要求9的载体和容器。
13.包含依照权利要求1至5任一项的多肽和/或依照权利要求6的生物缀合物、依照权利要求7或8的核酸序列和/或依照权利要求9的载体和药用可接受载体的组合物。
14.依照权利要求1至5任一项的多肽和/或依照权利要求6的生物缀合物、依照权利要求7或8的核酸序列和/或依照权利要求9的载体和/或依照权利要求10的宿主细胞用作MCAM(黑素瘤细胞粘附分子)抑制剂制备用于预防和/或治疗增殖性病症或疾病的药物中的用途，其中所涉及肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭和/或转移潜能取决于对MCAM功能的抑制作用。
15.依照权利要求14的用途，其中另外的和/或可选择的MCAM抑制剂选自化合物、抗体、抗体片段和抗独特型抗体。
16.依照权利要求1至5的多肽和/或依照权利要求6的生物缀合物在鉴定特异结合人MCAM的分子中的用途。
17.测定天然存在的侵袭性癌细胞的侵袭力对MCAM功能的依赖性的离体方法，包括以下步骤(a)使癌细胞接触依照权利要求1至8中任一项的分子，除了SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.17之外；(b)在适于所述癌细胞生长的条件下使所述癌细胞接触凝胶样基质；并(c)测定所述癌细胞通过凝胶样基质的迁移。
18.鉴定特异结合MCAM细胞外区域的依照权利要求1至5的多肽、依照权利要求6的生物缀合物、抗体或抗体片段和/或依照权利要求7或8的核酸序列的方法，其中所述多肽、生物缀合物、抗体或抗体片段和/或核酸序列能抑制肉瘤细胞的侵袭力，所述方法包括以下步骤(a)使抗体或抗体片段的噬菌体文库与侵袭性的肉瘤细胞接触；(b)分离所述细胞；(c)去除与所述细胞非特异结合和/或不与所述细胞结合的噬菌体；(d)洗脱与所述细胞结合的噬菌体；并任选地(e)测定由所述的被洗脱噬菌体展示的抗体或抗体片段的特性。
19.预防或治疗患者中增殖性病症或疾病、转移和/或癌症的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的依照权利要求1至5的多肽、依照权利要求6的生物缀合物、依照权利要求7或8的核酸序列、依照权利要求9的载体、依照权利要求10的宿主细胞、依照权利要求13的组合物和/或依照权利要求14或15制备的药物，抑制MCAM介导的增殖、粘附、侵袭和/或转移潜能。
全文摘要
本发明涉及抑制天然存在的肿瘤细胞中MCAM功能的多肽以及它们和抑制MCAM功能的其它分子在治疗癌症，尤其是降低特异癌症细胞侵袭力、增殖、粘附和/或转移潜能方面的用途。此外，还提供了可以确定天然存在的肿瘤细胞的侵袭力、粘附、增殖和/或其转移的潜能是否取决于功能性MCAM的方法。最后，还提供了用以鉴定能抑制肿瘤细胞侵袭、增殖或粘附的抗体或抗体片段的方法。
文档编号C12N15/10GK1675244SQ03819157
公开日2005年9月28日 申请日期2003年7月15日 优先权日2002年7月15日
发明者C·M·翁格尔, C·策厄特迈尔, C·托雷拉, J·尼韦纳, B·阿伦斯, G·贝斯特 申请人:克斯里恩医药股份公司