专利名称：用线粒体翻译系统生产蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及重组核酸分子的蛋白表达，特别是涉及在体外培养的动物组织中通过用病毒感染该宿主组织或用在一种病毒基表达载体中的重组核酸转染该宿主组织，并利用在富含线粒体的组织中的翻译生产蛋白质，包括病毒蛋白。
先有技术描述从转染的核酸翻译蛋白通常是用存在于原核细胞或真核细胞中的通用翻译系统完成的(Sambrook等，Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY,1989)。在真核细胞中发现的线粒体有用于采用非通用遗传密码的内源线粒体DNA(mtDNA)表达的转录和翻译系统。然而，该线粒体翻译系统尚未用于翻译外源核酸。
线粒体是多层膜细胞器，它以协调程序生长和分裂，该协同作用需要来自细胞核中的遗传系统和包含在线粒体中的独立的遗传系统的作用(Alberts等，Molecular Biology of The Cell，第二版，第387-401页，Garland出版公司，纽约，NY)，大多数线粒体蛋白由核DNA编码，也就是说，在细胞溶质中转录、翻译并输送到线粒体中。相反，某些线粒体蛋白从mtDNA转录并用包括两种核糖体RNA和22种tRNA的线粒体系统在细胞器本内身翻译。将线粒体基因序列与编码蛋白的氨基酸序列比较显示，与在真核细胞和大多数原核细胞中所用的通用密码相比，线粒体中的遗传密码发生改变。例如在通用密码中UGA密码子是蛋白合成的终止密码子，而在线粒体中UGA编码色氨酸，在通用系统中密码子AGA和AGG编码精氨酸，但在哺乳类线粒体中是终止密码子。
重组DNA可用于生产被转运进线粒体的蛋白质。在一个表达系统中，用一个含线粒体黄素酶(MCAD)基因cDNA的表达载体转染猴肾细胞(COS-7细胞)(Jensen等，Biochim.et Biophys.Acta 1180:65-72,1992)。用转染细胞的转录和翻译系统转录RNA和产生蛋白质。该重组MCAD蛋白在线粒体细胞部分加工并浓缩，表明MCAD蛋白被转运到线粒体中，在那里从细胞溶质产生的蛋白中除去前导肽。
某些病毒的复制同细胞线粒体或在被感染细胞中发现的多层膜泡囊相关。在体外生长的并用甲型肝炎病毒(HAV)感染的猴肾细胞中，在含HAV抗原的膜结合的囊状包涵体中发现病毒状颗粒(Asher等，J.Virol.Meth.15:323-328,1987)。为塞姆利基森林病毒(SFV)的RNA合成所需的一种磷蛋白已被定位在SFV感染细胞和用编该磷蛋白的cDNA转染的COS细胞中的大囊状结构(Peranen,J.,J.Gen.Virol.72:195-199,1991)。
抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的核苷类似物也损害在长期暴露于药物后的线粒体功能，提示HBV和mtDNA有相似的DNA复制机制。类似物2’,3-’双脱氧-3-硫代胞苷、5-氟-2’,3’-双脱氧-3’-硫代胞苷和1-(2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(即Fialuridine)抑制HBV复制(Doong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8495-8499,1991；Colacmo等，Antimicrobial Agents and Chemother.38(9):1997-2002,1994)。其中，2’,3’-双脱氧-3-硫代胞苷的(+)-对映体已表现出在体外独立的线粒体中明显抑制mtDNA合成(Chang等，J.Biol.Chem.267(31):22414-22420,1992)。
在含大量线粒体的器官中，包括肝、胰腺和唾液腺中很容易发现HBV，但在几乎不含线粒体的HBV转染的细胞系中，HBV病毒颗粒和抗原很难检测到。此外，某些HBV抗原可能为病毒复制所需要，因为不制造HBVe蛋白(HBe)的细胞系也不产生Dane颗粒。这可能是因为在常规组织或细胞培养中线粒体常被损害，导致HBV在培养细胞中的生长受限制。在常规富含线粒体细胞的细胞培养中缺氧似乎是导致线粒体的破坏。在常规组织培养系统中已发现某些细胞系(例如修饰的成人肝细胞、肝胚细胞瘤细胞和胎儿肝细胞)产生HBe抗原(Gripon等，Virol.192:534-540,1993；Ochiya等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1875-1879,1989)。这类细胞系可能含足够的线粒体以允许用常规的组织培养方法产生HBe。
最近已构建了HBV转基因小鼠并用于检查HBV蛋白的装配、转运、分泌和其它功能特性(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995；Araki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:207-211,1989)。这种转基因小鼠中产生的HBe抗原可能由用于构建转基因的质粒或由进入线粒体的那些质粒产生的RNA造成的。质粒可能进入线粒体的可能性基于线粒体的膜结构与在某些条件下允许核酸通过的其它膜结构相似的事实。在末端含丰余大于基因组长度的HBV构建物的某些HBV转基因小鼠的肝和肾组织中已发现了高水平的HBV复制(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995)。
在产生病毒颗粒的人类、细胞系或转基因动物中积极复制的HBV也总是产生HBe(Chisari,F.V.,Hepatology 22:1316-1325,1996)。对完全功能的HBV的复制，通用翻译系统和线粒体翻译系统都需要。在肝细胞中，似乎用线粒体翻译系统比用通用翻译系统产生更多的HBV抗原，因为在培养的肝组织的线粒体部分中发现大多数可溶的HBV抗原。(Paik等，Abstract,Am.Assoc.for the Smdy of Liveer Diseases,1995)。然而，由于在常规组织培养系统中线粒体经常受损害，线粒体翻译系统对病毒装配和/或体内免疫反应的贡献已很难确定。这种与常规组织培养方法相关的线粒体损害也可解释为什么用细胞培养在体外很难繁殖HBV。
已公开了动态的器官培养系统，其中在控制条件下肝组织可维持大约24-48小时(Smith,P.F.等，Life Sci.36:1367,1985；S.S.Park,InjeMed.J.14(3):363-369,1993)。在鉴别潜在抗病毒剂的方法方面已经描述了体外胸腺器官培养的应用(公布的PCT申请WO9505453)。
本发明用一个生理培养系统(可从Leema Pharmed，南朝鲜，汉城得到)体外培养动物组织，用病毒(包括人类HBV或HCV)有效地感染该动物组织，以用一个真核细胞线粒体翻译系统生产病毒抗原。该系统也可用于生产其它非线粒体蛋白，通过用一种含重组DNA的人类肝炎病毒基载体转染培养细胞，可在线粒体中翻译这些蛋白。推荐的载体包含来自HBV的DNA和/或与HCV序列互补的DNA。
发明概述根据本发明，提供一种在培养的动物组织中生产病毒抗原的方法，包含如下步骤在体外培养中提供来自动物的器官组织作为宿主组织，其中该宿主组织富含线粒体；在体外用病毒感染该宿主组织；体外培养感染的宿主组织，以在该宿主组织中用线粒体翻译系统生产病毒蛋白；以及从感染的和培养的宿主组织中分离病毒蛋白。在该方法的一个实施方案中，从选自肝、肾、胰腺和唾液腺的器官组织分离宿主组织。在另一个实施方案中，该动物选自人、大鼠、小鼠、狗、鸡和蛙。在一个推荐实施方案中，该病毒是选自甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和脑炎病毒的一种人类病毒。在一个实施方案中，病毒抗原在宿主组织的线粒体中产生。在一个推荐实施方案中，该方法还包括将分离的病毒抗原导入一个动物以诱导免疫应答。在另一个推荐实施方案中，按照该方法生产适用于疫苗的病毒抗原。
根据本发明的另一方面，提供一种在培养的动物组织中生产蛋白质的方法，包含以下步骤在体外培养中提供来自动物的器官组织作为宿主组织，其中该宿主组织富含线粒体；体外用一个含病毒DNA和重组DNA的DNA载体转染该宿主组织；体外培养转染的宿主组织，以在宿主组织中用一个线粒体翻译系统生产由转染的DNA载体编码的蛋白质；以及从培养的和转染的宿主组织中分离由转染的DNA载体编码的蛋白。在该方法的一个实施方案中，从选自肝、肾、胰腺和唾液腺的器官组织分离宿主组织。在另一个实施方案中，该动物选自人、大鼠、小鼠、狗、鸡和蛙。在一个推荐实施方案中，该病毒DNA是人类乙肝病毒DNA。该方法还可以包括用一个辅助病毒感染或转染宿主组织的步骤。在一个实施方案中，在宿主组织的线粒体中生产蛋白。另一个实施方案是，按照该方法生产适用于疫苗的病毒抗原。推荐实施方案包括按照该本方法生产蛋白，其中该病毒DNA是人类乙肝病毒DNA，并且其中该DNA载体含有一个插入编码非结构病毒蛋白的人类病毒DNA序列中的重组DNA。
附图简述
图1表示组织样品体外自动培养装置。
图2图示一个HBV基表达载体。
本发明的详细描述本发明关于用常规重组DNA技术生产不易生产的天然蛋白和来自病毒的蛋白的方法，其中该病毒的病毒核酸含大量线粒体的细胞中进行体外翻译，而这些细胞被维持在一个自动动态培养系统中。
本发明可供体外维持的组织的杂交种病毒感染使用，以使从感染病毒中能生产蛋白质。这对于动物细胞中的人类病毒的翻译特别重要，但它对用人类或非人类病毒和人类或非人类组织作为宿主组织的细胞的任何杂交种感染也有用。例如可用人类HBV感染大鼠肝的切片并将该肝组织维持在体外使病毒抗原能表达的自动动态培养系统中。
用标准外科方法从诸如大鼠的动物中分离器官组织。一般该器官是已知线粒体丰富的一种器官，如肝、肾、胰腺和唾液腺。将该组织切成大约260μm厚2cm2大的切片，并通过将该组织切片与一种病毒(如HBV)在培养基中培养用该病毒感染。HBV是得自感染的人类病人中获得的活检肝组织。那些本领域技术人员会理解，也可用其它病毒如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、脑炎病毒和类似的动物病毒取代HBV。作为对照，在培养基中培养不暴露于该病毒的相同类型的动物组织切片。
在自动器官培养系统中培养感染的器官切片。参考图1，在这个培养系统中，在一个位于培养管12内的多孔容器11中培养组织切片10，培养管12是可旋转的(见箭头)，以允许当培养管12旋转时该组织被周期性地浸入组织培养基中。在培养试管12中的气体交换以有规律的时间间隔发生，其中气体混合物通过位于培养管12末端的端口13、16导入培养管。取出分析样品或导入培养基或其它试剂是通过位于培养管12壁中的样品端口14进入培养管12内完成的。通过将该培养系统置于培养箱中使它维持37℃恒温。
于37℃在修饰的Waymouth氏MB752/1培养基中，在pH7.0、1.6-2个大气压的5％CO2和95％O2的混合气体下培养该组织切片，虽然那些本领域技术人员将理解，也能等同地使用其它培养基和气体混合物。将该病毒感染组织培养通常大约1至48小时，最好培养大约24小时。
在培养阶段完成后，收集组织，用本领域众所周知的标准技术用来分析或制备蛋白质。例如，在感染组织中通过组织切片和用抗-HBsAg抗体染色用标准免疫化学方法对HBV蛋白进行监测。
通常，在不到24小时的培养后，在动物细胞中检测到病毒蛋白。感染的组织用抗-HBsAg抗体不均匀地染色，在该组织中线粒体丰富的区域与该组织的其它部分相比染色更强。对照组织只显示背景染色。
当用电子显微镜检查切片的病毒感染的动物组织时，检测到含病毒蛋白的多层膜线粒体状细胞器，表明病毒感染的效力与该动物组织中的线粒体浓度相关。因此，用HBV证实了人类病毒的杂交种病毒感染到动物组织中，因为组织用抗-HBsAg抗体免疫染色强显示，HBV能在具有足够的线粒体以使病毒能复制的动物器官中感染并复制。
用特异性地识别HBsAg和核心抗原的免疫化学鉴定出，通过电镜检查的用HBV感染后6至24小时的感染的大鼠肝组织，它含有含大量乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的具双层膜的细胞器。某些免疫染色结构类似破坏的线粒体的嵴截面。因为已知线粒体有独立于细胞质翻译系统的一个翻译系统，因此在线粒体状细胞器中存在HBsAg提示该蛋白质是由线粒体系统翻译。这种翻译将从HBV产生与用细胞胞浆中的通用密码使用系统翻译的相同RNA不同的分泌抗原。
从感染的大鼠组织分离的HBV蛋白用标准聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示出比通过标准重组DNA技术产生的HBV蛋白更复杂的病毒蛋白的特征轮廓。免疫染色结果提示，用本方法生产的HBV蛋白是用线粒体翻译系统翻译的，而不是用标准的细胞核糖体翻译系统翻译的。因此，用本方法生产的蛋白更象在正常感染中产生的病毒蛋白，因而具有如同感染中发生的抗原特性。用本方法生产的这类蛋白可用于在哺乳类中产生免疫应答，并且抗原决定簇与用依靠细胞的核糖体翻译的标准重组DNA技术产生的蛋白上的抗原决定簇相比，可能更近似于在感染中产生的那些抗原决定簇。
本发明也包括从含于一个病毒基载体中的克隆DNA生产蛋白质的方法，其中翻译发生在体外用该载体转染的线粒体丰富的动物细胞中，其中细胞在自动动态培养系统中维持。一个有效的HBV基表达系统用于生产依赖于在线粒体丰富组织中翻译的蛋白质。在本发明的该实施方案中，含插入HBV结构基因中的一个克隆的编码DNA序列的HBV基表达载体用于在用推荐的自动培养系统体外培养转染的动物器官组织中指导克隆DNA的基因表达。
双链HBV DNA(含“负”链和“正”链DNA序列)用于构建一个环状DNA载体，用标准分子生物学方法在其中可插入其它编码的DNA序列。该HBV基载体也含来自原核生物质粒、允许个载体在原核生物中复制以扩增DNA的序列。该载体含一个抗药性基因(如对潮霉素B的抗性)，以在转染细胞中提供一个选择性标记。插入的编码DNA序列插入一个在转染的动物细胞中对复制不需要的HBV结构基因。插入的编码DNA序列可以是另一病毒基因序列、真核生物基因、cDNA、通过聚合酶链反应扩增的DNA或合成的DNA序列，用切割和连接的标准分子生物学方法完成插入，以将插入的DNA置于允许来自HBV序列表达的适当框架和取向中。
因为在含末端丰余大于基因组长度的HBV构建物的某些转基因小鼠的肝和肾组织中已发现了HBV复制(Guidotti等，J.Vrol.69:6158-6169,1995)，这些结果提示该转基因构建物可能已对线粒体转染而不是对核转染。因此，含大于基因组长度的HBV的重组构建物可能对用本系统转染体外维持的组织也有用并且被认为功能上等同于此处讨论的用于本方法的构建物。
通过以下代表推荐实施方案的实施例能更好地理解本发明。
实施例1大鼠肾组织的体外HBV感染用乙醚普通麻醉一只混合饲养的白鼠并用本领域众所周知的方法用外科手术打开腹部区域。然后，在切开腔静脉以允许灌注后，将10ml冷的(大约4℃)Wisconsin溶液(Viaspan,DuPont)注射入主动脉。从无血区域取下肾并贮存在冷的Wisconsin溶液中(大约4℃)。制备肾组织切片(如大约260μm厚2cm2的片)并贮存在冷的培养基中。与得自感染病人活检肝组织的HBV一起培养组织切片。通过将来自有乙肝表面抗原的病人肝活检组织放在修饰的Waymouth氏MB752/1培养基中于37℃3小时制备HBV接种物；3小时后除去活检样品，然后在培养基中培养鼠器官组织切片。通常，活检组织与培养基之比是5-20克组织对10ml培养基。作为对照，在培养基中培养尚未暴露于人肝活检组织的鼠肾组织切片。
在图1所示的自动器官培养系统中培养感染的肾器官切片，其中器官组织切片10置于一个多孔容器11内，多孔容器11放在可旋转的培养管12内，培养管12至少有一个气体、培养基、生长因子等进入的入口13。多孔容器11由任何惰性材料组成，这些惰性材料包括但不限于塑料网、尼龙网或半透膜，但最好是正方形或长方形盒子形状、平均孔径大约为100-500μm的不锈钢网。培养管12包括一个可重新封口的取样口14，以取出组织培养基15的样品。取样口14也可用于注射培养基15、病毒颗粒、生长因子和其它培养试剂或物质以体外处理组织。当培养管12旋转时，器官组织10被周期性地浸入组织培养基15中。当培养管12旋转时多孔容器11的盒子形状促进样品的转动，而不是容器停留在一个位置而培养管围绕它转动。培养管12中的气体交换间歇性地发生，其中气体混合物被导入入口13，并且气体通过培养管12的出口16排出。培养管12维持在37℃恒温(如在未显示出的培养箱中)。在整个培养过程中最好自动进行该器官培养过程，以在相同的条件下维持细胞。
在37℃、pH7.0下，在修饰的Waymouth氏MB752/1培养基中，在1.6-2.0个大气压5％CO2和95％O2下培养该组织切片。由WaymouthMB 752/1粉末培养基(Gibco)、10％胎牛血清、2.2％碳酸氢钠、25mM D-葡萄糖、1μg/ml结晶牛锌胰岛素、含50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco)的抗菌素混合物以及蒸馏水制备该培养基。进行2.5分钟间隔的气体交换并通过转动图1所示的培养管，将组织每分钟浸入培养基中4.5次。
HBV-感染的肾组织通常培养1至48小时，最好是大约24小时。然后通过组织切片并用抗-HBsAg抗体(从SIGMA,St.Louis,MO购买)染色，将该组织用标准免疫化学方法处理，以确定在感染组织中HBV的存在。
通常，在不到24小时的培养后，在肾细胞中检测到HBsAg。感染的肾组织用抗-HBsAg抗体不均匀染色，与线粒体相对少的远端小管相比，线粒体丰富的近球小管显示出更强的染色。当用电子显微镜检查切片的HBV感染的鼠肾组织时，在近球小管中比在远端小管中检查到明显更高浓度的含HBsAg的多层膜线粒体状细胞器。因此，HBV感染的效率与动物组织中线粒体的浓度相关。这些结果也表明，与目前的杂交种病毒感染的概念相反，HBV可在有足够线粒体以允许HBV复制的动物器官中感染和复制。
除了大鼠肾组织，用以上描述的自动培系统已经成功培养了来自狗、小鼠、鸡和蛙的肝组织。那些本领域技术人员会理解，也可用HBV或其它人类或非人类病毒(如甲型肝炎和丙型肝炎病毒或脑炎病毒)感染这类动物组织，这些人类或非人类病毒感染线粒体丰富组织以允许病毒在该体外系统中复制。那些本领域技术人员会理解，这类动物组织也可以包括用人类病毒或动物病毒感染的人类组织。
实施例2将肝组织的HBV感染定位于线粒体细胞器基本上用实施例1中描述的取肾的方法从混合饲养的白鼠用外科方法取出肝组织。基本如实施例1所述，将肝组织切片并用HBV感染。然后在自动培养系统中培养感染的鼠肝组织24小时，并且用酶联免疫吸收剂分析检查该组织HBsAg和HBVe抗原(HBeAg)的存在，该酶联免疫吸收剂分析用本领域众所周知的技术识别抗原(即可得自Abbott实验室的HBV ELISA试剂盒)。感染的组织也用标准Southern印迹技术(基本如Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995中描述)，通过DNA杂交分析HBV DNA。
用标准细胞分级分离方法(基本如Jensen等，Biochim.et.Biopys.Acta 1180:65-72,1992中描述)，将感染的鼠肝首先分级分离为可溶胞质(细胞溶质)部分和含线粒体的沉淀。简短地说，将感染的组织切片在缓冲液(0.25M蔗糖、0.1mM EDTA和1mM Tris-HCL,pH7.4)中匀浆并以低速(700×g)离心，除去核和任何未破碎的细胞(核部分)。上清液以高速(12,000×g)离心分离线粒体部分(在沉淀中)和细胞溶质部分(在上清液中)。然后用检测这两种抗原的ELISA法测试核、线粒体和细胞溶质部分HBsAg和HBeAg的存在。
线粒体部分含有的HBsAg比在核或细胞溶质部分发现的HBsAg至少多10倍。HBeAg只在线粒体部分被检测到，而在核或细胞溶质部分中没有发现。这些结果表明，在鼠肝组织中HBV主要是在线粒体或分级在一起的线粒体状细胞器中复制，只有有限的HBV复制发生在细胞核。
用标准凝胶分离和DNA杂交技术，在线粒体部分发现由小于或等于2.1Kb的HBV DNA组成的复制复合体。在细胞溶质部分没有检测到HBV DNA，在核部分检测到少量(不到在线粒体部分发现的量的10％)。
实施例3从人血浆分离的HBsAg与由重组DNA生产的HBsAg的比较用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)比较自人血浆获得的疫苗中的HBsAg(得自南朝鲜Blue Cross的Hepavax)和用重组DNA技术制备的HBsAg(得自JEIL-JEDANG，南朝鲜，汉城)。将蛋白溶于含40mM Tris-HCl,pH6.8、1％SDS、0.35％β-巯基乙醇、5％甘油和溴酚蓝的缓冲液中，在用标准方法(Laemmli,U.K.,Nature 227:680-685,1970)在10％SDS-PAGE凝胶上分离前煮沸5分钟。电泳后，蛋白用众所周知的方法和抗-HBsAg抗体(得自SIGMA,St.Louis,MO)进行免疫分析印迹。
用重组DNA技术生产的HBsAg只显示23Kd的单条带，而从人血浆中分离的HBsAg显示出在从大约20KD至30KD的宽的拖尾带中广谱的表面抗原。这些结果提示与通过重组DNA技术生产的单一蛋白相比，许多天然产生的HBV抗原可能在线粒体中用核心抗原基因和线粒体特有的密码子选择生产。因为源于血浆的疫苗比通过重组DNA技术生产的疫苗通常更有效，这些结果也提示在感染期间产生的多种不同形式的HBV表面抗原可以单独或一起用作比通过重组DNA技术生产的单个HBV抗原更好的免疫原。
实施例4用线粒体翻译系统在线粒体中HBsAg的生产在哺乳动物线粒体的密码子选择系统中，密码子AGA和AGG作为终止翻译的终止密码子。核心HBsAg基因含AGA和AGG密码子，已经推测它们为将核心抗原蛋白加工为成熟HBsAg的切割位点。然而，当在哺乳动物线粒体中翻译时，核心HBsAg基因在AGA和AGG密码子自然终止。在线粒体的遗传密码子选择的基础上，在HBsAg基因中有几个其它预期的起始和终止密码子(总结于表1)。对编码称为前S1和前S2和核心抗原(HBcAg)的HBV蛋白基因已作出同样的确定，这些起始和终止密码子位点也显示在表1中(关于HBV蛋白的一般讨论，参见Lau和Wright,Lancet342:1335-1340,1993)。
基本如实施例2所述，用HBV感染鼠肝组织，体外培养感染的鼠肝组织12-48小时。培养后，收集感染的鼠组织并在含40mM Tris-HCl，pH6.8、1％SDS、0.35％β-巯基乙醇、5％甘油和溴酚蓝的缓冲液中裂解，将裂解液煮沸5分钟，用标准方法(Laemmli,U.K.,Nature227:680-685,1970)在10％SDS-PAGE上分离。为了比较，在SDS-PAGE凝胶的一个相邻泳道中包括用通过重组DNA技术制备的HBsAg作为对照。通过电泳分离后，蛋白用众所周知技术，用抗-HBsAg抗体进行免疫印迹和检测。
在体外生长的感染的鼠组织中生产的HBsAg与在HBV慢性感染的人的血浆中检测到的那些蛋白相似，含有大约20Kd至大约30Kd的蛋白。因此，在线粒体丰富组织中体外翻译HBV基因产生多种模拟在感染的人中天然产生的那些抗原的分泌抗原。相反，通过重组DNA技术生产的HBsAg表现出大约23Kd的单条带。将通过体外鼠肝的感染生产的多种HBsAg蛋白分离用作抗HBV感染的一种疫苗。
表1蛋白 大小 起始密码子终止密码子氨基酸号AUAAUGAUUAGAAGGHBsAg 226 28 1 21824 无19575 2262786103197198前S1 119 85 1 无 10411042114前S2 55 无 1 无 16 1848HBcAg 183 无 1 59 98 5610511212613315031在HBV的“adr”亚型中发现2在HBV的“adw”和“ayw”亚型中发现3这代表HBeAg的末端密码子；先前假设是血浆或胞质中的蛋白酶的切割位点。
实施例5在用HBV基表达载体转染的动物组织中蛋白的生产依靠在线粒体丰富组织中的翻译，同样可以使用一个有效的HBV-基表达系统生产蛋白质。也就是，在如实施例1和2公开的体外培养的转染的鼠器官组织中，可以用HBV基表达载体指导克隆DNA的基因表达。
HBV是一个有3200个碱基基因组的病毒DNA，其基因组由一条“负”链和一条较短的“正”链组成，它们一起形成编码结构蛋白和病毒复制所需蛋白的部分双链环状DNA(Lau和Wright,Lancet 342:1335-1340,1993)。
一个HBV-基载体含来自原核生物质粒pBR322的序列、HBV复制起点、一个截短的HBV聚合酶基因和一个抗药性基因(如一个在HSV胸苷激酶调节序列控制下的潮霉素B磷酸转移酶基因，提供对潮霉素B的抗性)。
参考图2，该HBV-基载体称为pHBVex，包括来自原核生物载体pBR322的DNA序列(标记为“pBR”)以允许在原核细胞(包括大肠杆菌)复制载体、当在大肠杆菌中表达时给予氨苄青霉素抗性的序列(标记为“AmpR”)；一个在HSV胸苷激酶启动子(标记为“HSV TK pro”)序列和终止序列(标记为“HSV TK”)控制下的潮酶素B磷酸转移酶基因(标记为“HYG”)，它使真核细胞表达对潮霉素B的抗性的；一个插入DNA序列(标记为“insDNA”)，它可以是编码在截短的HBV聚合酶基因(标记为“HBVp”)控制下的将被表达的蛋白质的基因组序列或cDNA序列。HBV聚合酶基因的截短和外源DNA的插入发生在复制和包装的末端蛋白和pre-S1基因起始之间的区域内。质粒的剩余部分由HBV“负”链DNA(标记为“HBV-”)和它的标准互补DNA序列组成，互补DNA序列由标准分子遗传学技术产生，这些技术包括反转录、由合成引物进行DNA聚合和将代表HBV“负”链的双链DNA连接到载体的剩余部分中(Sambrook等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第二版)，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。
在pHBVex载体中，采用将插入DNA置于允许来自HBV调节序列表达的适当框架和取向中的限制性内切酶消化和连接的标准分子生物学方法(Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manua第二版，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)，用一外源DNA序列(一个病毒基因的或真核细胞基因、cDNA或通过聚合酶链反应扩增的DNA)替代HBV聚合酶基因的编码序列部分。环内的箭头表示DNA序列的取向(转录的方向)。
在一个等同的pHBVex载体中的其它DNA序列(没有显示)可能包括得自其它原核生物载体、甲肝病毒、丙肝病毒或包括EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)和脑炎病毒在内的其它病毒的序列。那些本领域技术人员会理解，其它HBV-基表达载体可以作为等同物取代图示于图2的载体。例如，一个与pHBVex相似的但在载体中含一个丰余大于单个HBV基因组构建物载体对复制或基因表达可能是最适的，这类似在含丰余HBV构建物的转基因小鼠中得到的结果(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995)。那些本领域技术人员会进一步理解，用pHBVex载体或一个等同的载体转染也包括共转染或用一个辅助病毒感染，以促进或增强该载体DNA的复制或基因表达。
基本如实施例1和2中所述，从线粒体丰富的器官分离并制备用于体外培养的动物组织。用标准转染方法包括磷酸钙沉淀、将组织细胞与含pHBVex-insDNA构建物的细菌原生质体融合、用含pHBVex-insDNA序列的脂质体处理该组织、DEAE葡聚糖促进转染、电穿孔和DNA的微注射，将含插入DNA的pHBVex载体转染进线粒体丰富的组织。
基本如实施例1中所述，在自动系统中体外培养转染的组织切片，以允许由线粒体丰富组织中转染的DNA表达而产生蛋白。用包括亲和层析的多种标准方法的任何一种纯化该蛋白。用HBV基表达系统，可以生产出模拟那些在感染线粒体丰富组织的病毒(例如其它肝炎病毒或脑炎病毒)的天然感染期间产生的抗原的其它病毒抗原，以制备对这些病原体有效的疫苗。
实施例6在用HBV-基表达载体转染的动物组织中生产人类HCV抗原因为对获得足够的HCV抗原在动态组织培养系统中在动物组织中直接培养HCV可能仍是一个效率低的方法(如因为HCV复制相对地慢)，用基于另一病毒的载体对体外生产HCV抗原是一个有效的方案。pHBVex载体用于将人丙型肝炎病毒抗原的编码基因转染进入线粒体丰富的细胞，基本如实施例5中所述，用线粒体翻译系统生产天然抗原。因为丙型肝炎病毒是一种RNA病毒，用本领域众所周知的技术首先将编码丙型肝炎病毒表面抗原(HCsAg)的RNA序列反转录成一个cDNA(Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Larboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989)。用将载体DNA限制性消化和连接编码HCsAg双链cDNA(用合适限制性内切酶酶切位点或平端连接)的标准技术，将HCsAg cDNA插入pHBVex载体截短的HBV聚合酶基因中。用基本如实施例1、2和5中描述的方法，将pHBVex-HCsAg构建物转染进鼠肝组织的单独切片并体外培养24-48小时。在24-48小时的培养后，取出该组织，用包括亲和层析的标准蛋白纯化技术，用结合HCsAg蛋白的抗体纯化在转染的组织中产生的HCsAg蛋白。
本发明包括制备在线粒体丰富细胞中天然产生的蛋白(如在肝或胰中产生的蛋白)的一种有用的方法。本发明的翻译方法可用于生产在线粒体中翻译的天然非线粒体蛋白。这可能在生产具有如依赖线粒体翻译的加工或密码子识别的免疫原特性的蛋白中特别重要。也就是说，本发明对生产在线粒体中复制的病毒天然抗原、或那些用常规组织培养方法培养时复制太慢的病毒的天然抗原、或那些用常规重组DNA技术不能生产的病毒天然抗原是有用的。在一个体外系统中，需要生产来自传染因子，特别是人类传染因子的蛋白。最好是杂交种感染，因为它限制同种不希望有的产物污染所需产物的危险。例如，一种用不依赖人类细胞生长的人类传染因子感染的方法限制来自其它人类传染因子(如存在于人类组织中的HIV)的污染危险。同样地，需要一个有效地模拟人类感染以产生类似在人类感染期间产生的免疫原的体外系统，这些免疫原用常规用于由重组DNA生产蛋白的技术是不可能生产的。本发明提供一种用重组HBV基载体生产蛋白质的方法，该方法可用于在转染动物细胞的线粒体中指导生产其它非线粒体蛋白。本发明也使人们能在一个体外系统中生长病毒，这对发现新的预防疾病的疗法和改进人类由病毒感染引起的病理疾病的现行疗法是有用的。
权利要求书按照条约第19条的修改1．体外生产病毒抗原的方法，包括以下步骤提供得自非人类动物的大约2cm×2cm×260μm的器官组织切片作为在体外培养中的宿主组织，其中该宿主组织富含线粒体；在体外用病毒感染所述宿主组织；在一个体外动态器官培养系统中培养所述感染的宿主组织，该动态器官培养系统提供将所述感染的宿主组织周期性地浸入组织培养基中以及还提供气体交换；允许所述感染的组织维持在所述动态器官培养中足够的时间以产生病毒抗原；以及分离在体外产生的所述病毒抗原。
2．权利要求l的方法，其中该提供步骤用的宿主组织从肝、肾、胰腺或唾液腺的器官组织中分离。
3．权利要求1的方法，其中该提供步骤用的宿主组织从非人类动物即大鼠、小鼠、狗、鸡或蛙中分离。
4．权利要求l的方法，其中该感染步骤用的人类病毒选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和脑炎病毒。
5．权利要求1的方法，其中该允许步骤在所述宿主组织中的线粒体状细胞器中在大约24至大约48小时内产生病毒抗原。
6．权利要求1的方法，还包括将分离的病毒抗原导入动物以诱导免疫应答的步骤。
7．按照权利要求1方法生产的并适于在疫苗中使用的病毒抗原。
8．按照权利要求1方法生产的病毒抗原用于制备疫苗的用途。
9．体外生产病毒抗原的方法，包括以下步骤提供得自非人类动物的大约2cm×2cm×260μm的器官组织切片作为在体外培养中的宿主组织，其中所述宿主组织富含线粒体；
在体外用包含重组病毒DNA和允许重组病毒DNA表达的DNA序列的一种DNA载体转染所述宿主组织；在一个体外动态器官培养系统中培养所述转染的宿主组织，该动态器官培养系统提供将所述感染的宿主组织周期性地浸入组织培养基中以及还提供气体交换；允许所述感染的组织维持在所述动态器官培养中足够的时间以产生病毒抗原；以及分离在体外产生的所述病毒抗原。
10．权利要求9的方法，其中该提供步骤用的宿主组织从肝、肾、胰腺或唾液腺的器官组织中分离。
11．权利要求9的方法，其中该提供步骤用的宿主组织从非人类动物即大鼠、小鼠、狗、鸡或蛙中分离。
12．权利要求9的方法，其中该转染步骤用的重组病毒DNA得自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或其重组体中的核酸。
13．权利要求9的方法，其中该转染步骤用的重组病毒DNA得自乙型肝炎病毒中的核酸，并插入编码非结构病毒蛋白的人病毒DNA序列中。
14．权利要求9的方法，其中该允许步骤在所述宿主组织中的线粒体状细胞器中在大约24至大约48小时内产生病毒抗原。
15．权利要求9的方法，还包括用辅助病毒感染或转染所述宿主组织的步骤。
16．按照权利要求9方法生产的并适于在疫苗中使用的病毒抗原。
17．按照权利要求9方法生产的病毒抗原用于制备疫苗的用途。
权利要求
1．在培养的动物组织中生产病毒抗原的方法，包含以下步骤提供来自动物的器官组织作为在体外培养中的宿主组织，其中所述宿主组织富含线粒体；用病毒体外感染所述宿主组织；体外培养所述感染的宿主组织，以用所述宿主组织中的线粒体翻译系统生产病毒蛋白；以及从所述感染的和培养的宿主组织中分离病毒蛋白。
2．权利要求1的方法，其中所述宿主组织从选自肝、肾、胰腺和唾液腺的器官组织中分离。
3．权利要求1的方法，其中所述动物选自人、大鼠、小鼠、狗、鸡和蛙。
4．权利要求1的方法，其中所述病毒是选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒。丙型肝炎病毒和脑炎病毒的一种人类病毒。
5．权利要求1的方法，其中所述病毒抗原在所述宿主组织中的线粒体中生产。
6．权利要求1的方法，还包含将分离的病毒抗原导入动物以诱导免疫应答。
7．适于在按照权利要求1方法生产疫苗中使用的病毒抗原。
8．在培养的动物组织中生产蛋白的方法，包含以下步骤提供来自动物的器官组织作为在体外培养中的宿主组织，其中所述宿主组织富含线粒体；用含病毒DNA和重组DNA的一个DNA载体体外转染所述宿主组织；体外培养所述转染的宿主组织，以用所述宿主组织中的线粒体翻译系统生产由所述转染的DNA载体编码的蛋白；以及从所述培养的和转染的宿主组织中分离由所述转染的DNA载体编码的蛋白。
9．权利要求8的方法，其中所述宿主组织从选自肝、肾、胰腺和唾液腺的器官组织中分离。
10．权利要求1的方法，其中所述动物选自人、大鼠、小鼠、狗、鸡和蛙。
11．权利要求8的方法，其中所述病毒DNA是人乙型肝炎病毒DNA。
12．权利要求8的方法，还包含用一种辅助病毒感染或转染所述宿主组织的步骤。
13．权利要求8的方法，其中所述蛋白在所述宿主组织中的线粒体中生产。
14．适于在按照权利要求8的方法生产的疫苗中使用的蛋白。
15．权利要求14的方法，其中所述病毒DNA是人乙型肝炎病毒DNA。
16．权利要求14的蛋白，其中该DNA载体含有一重组DNA，后者插入非结构病毒蛋白的人类病毒DNA序列中。
全文摘要
公开了一种通过用病毒包括人乙型肝炎病毒(HBV)在内的一种病毒感染动物富含线粒体的器官组织并体外培养感染的组织,在体外生产病毒抗原的方法。公开了一种通过用重组HBV－基载体转染线粒体丰富的动物组织并在一个动态组织培养系统中培养转染的组织,在体外生产蛋白质的方法。
文档编号C12N15/86GK1217632SQ97191905
公开日1999年5月26日 申请日期1997年1月21日 优先权日1996年1月29日
发明者柏继兴 申请人:柏继兴