3253t＞c突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种用于检测线粒体tRNAUu(UUR)3253T> C突变的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730 万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病 的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全 世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破 裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血 压约占所有高血压的90-95%。
[0003] 线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷 (ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有"细胞动力工厂"之称。除了为细胞供能 外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细 胞周期的能力。
[0004] 线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA基因突变是与原发性高 血压相关的突变热点区域，2009年GuanMX等人发现，位于线粒体tRNALeu(_基因4435A >G突变与原发性高血压相关（YuqiLiu，Min_XinGuanetal.Hypertention，2009;53: 1083-1090)，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNALeu(UUR)基因4435A>G可能影 响原发性高血压的发生发展（ZhongqiuLu，Min_XinGuanetal.EurJHumGenet，2011 ; 19 :1181-1186)〇
[0005]目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高， 操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段 长度多态性（PCR-RFLP)是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程 中影响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱（DHPLC)和基因芯片的应用为 点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检 测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简 易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。
【发明内容】
[0006] 本发明通过酶切法进行线粒体tRNA^(UUK)3253T>C突变检测，克服了现有方法耗 时长、操作难、成本高等缺点，提供线粒体tRNA^(UUR)3253T>C突变检测试剂盒，以及上述 方法或上述的试剂盒在检测。
[0007] 本发明采用的技术解决方案是：一种用于检测线粒体tRNAUu(UUR)3253T>C突变的 方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
[0008] (1)提取全基因组DNA:运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚-氯仿-异戊醇法，提取 全基因组DNA;
[0009] (2)特异性PCR扩增及酶切：根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对 引物3253F、3253R，该引物特异性的扩增含有3253位点的序列，然后利用专一性限制性内 切酶BstEII特异性的识别GGTNACC回文结构，3253位点碱基突变后，产生限制性内切酶 BstEII识别的回文结构，利用限制性内切酶BstEII识别的专一性，对样本的全基因组DNA 进行PCR扩增和酶切；
[0010] (3)将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切后产生的DNA片段大小不同， 检测线粒体tRNA^(UUR)基因3253位点是否发生突变。
[0011] 所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。
[0012] -种所述的用于检测线粒体tRNA^(UUR)3253T>C突变的方法的试剂盒，所述的试 剂盒包括提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴 性标准品。
[0013] 所述的取样本全基因组DNA的试剂包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-异戊醇混 合液和溶液II，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成分为氢氧化钠。
[0014] 所述的PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸 水。
[0015] 所述的酶切反应试剂包括限制性内切酶BstEII和酶切缓冲液。
[0016] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种一种用于检测线粒体tRNA^(UUK)3253T> C突变的试剂盒及其检测方法，本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续 实验研究，如血液样本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组 织可用于诱导多功能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源，本试剂盒借助特异性PCR技 术与专一性限制性内切酶BstEII特异性的识别GGTNACC回文结构的特点，每份DNA样本用 1对特异性引物进行PCR扩增，然后用专一性限制性内切酶BstEII进行1次酶切即可在几 小时内对线粒体tRNAUu(UUR)基因T3253C突变进行检测。另外值得一提的是，本试剂盒提供 的阳性标准品和阴性标准品可以对应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从而更直观、 更清晰的分析检测结果。
【附图说明】
[0017] 图1 :特异性条带扩增循环条件。
[0018] 图2 :突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物图（泳道8为Maker;泳道4、5、6、7 为突变样本酶切产物；泳道1、2、3分别为正常样本酶切产物）。
[0019] 图3:突变样本、对照样本测序验证酶切方法图。
【具体实施方式】
[0020] 1.DNA的提取：运用酚-氯仿-异戊醇法提取血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜 刮片或唾液的样本中的DNA。
[0021] 2.特异性引物设计及特异性条带PCR扩增：使用Primer5. 0软件根据人类线粒 体基因序列（NC_012920. 1)在3253前后设计上游引物3253F、下游引物3253R;采用上述引 物对包含3253的特异性条带进行扩增。
[0022] 3.专一性酶切及电泳鉴定：采用专一性限制性内切酶BstEII对上述特异性条带 进行酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定是否发生3253T>C突变。
[0023] 具体步骤如下：
[0024] 1.收集标本：在上述检测线粒体tRNAUu(_基因T3253C突变的方法中，可从细胞、 血液以及组织样本中快速提取全基因组DNA，针对采样方式、样本来源以及样本形式的不 同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，处理方法如下：
[0025] (1)收集样品前准备好灭菌的收集容器，每人251ml瓶子2瓶（内有5ml双抗）， 选择晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮肤部位，收集150-200ml尿液，将尿液转 移至50ml的离心管中，400g离心lOmin，弃上清，加10mlPBS，清洗一次，400g离心lOmin， 弃上清；
[0026] (2)指尖采血：用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用医用酒 精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2mm，立即出 针，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉 球压住伤口片刻。静脉采血：先用碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒 皮肤，待碘酊挥发后，再用医用酒精棉签以同样方法拭去碘迹，然后左手拇指固定静脉穿刺 部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头 与皮肤成30度角快速刺人皮肤，然后以5度角向前穿破静脉壁进人静脉腔，见回血后，将针 头顺势探人少许。取50~100μ1血液标本（如一滴血）或lcm2的血滤纸片放入1. 5ml Eppendorf管中，用PBS补至200μ1，室温静置10分钟；
[0027] (3)收集组织前，要让受检者了解研究内容，并自愿同意参加试验的原则并签订 《知情同意书》。先用医用酒精棉