新型醛缩酶和取代α－酮酸的制备方法

专利名称：新型醛缩酶和取代α－酮酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及醛缩酶和取代α-酮酸的制备方法，更详细地说，涉及优选用于合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(以下成为IHOG)的醛缩酶，而所述IHOG可用作合成monatin的中间体，还涉及取代α-酮酸的制备方法。
背景技术：
具有下式(5)所示结构的monatin是从南非灌木的根中分离萃取出来的天然甜味氨基酸。它具有相当于蔗糖的数十倍至数千倍的强烈甜味，有望作为甜味剂使用。但是，monatin的有用性刚刚才被发现，尚未建立工业规模合成monatin的方法。
在所述情况下，本发明人开发出了使用可作为试剂购得的吲哚丙酮酸和丙酮酸合成monatin的新方法，该方法包括下述反应①和②。
①通过吲哚丙酮酸和丙酮酸(和/或草酰乙酸)的羟醛缩合反应合成前体酮酸(IHOG)的反应步骤；②使IHOG的2位氨基化的反应步骤。

关于上述monatin合成路径中①的羟醛缩合反应，至今未报道有使用微生物酶系由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前体酮酸(IHOG)的例子。
作为催化以2分子α-酮酸(或取代α-酮酸)为反应物的羟醛缩合反应的微生物酶，至今为止报道有两例来自于假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶和存在于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等中的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶。
据报道，前者的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶可催化由2分子丙酮酸生成4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸(4-HMG)的反应和由4-草酰柠苹酸生成1分子草酰乙酸和1分子丙酮酸的反应(KiyofumiMaruyama，Journal of Biochemistry，108，327-333(1990))。而后者的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶已知可催化由1分子乙醛酸和1分子丙酮酸生成4-羟基-2-氧代戊二酸(4HG)的反应。
但是，关于这些菌株对4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(以下称为PHOG)的分解活性、对由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成monatin的前体酮酸(IHOG)的活性，都完全没有任何报道和说明，也不清楚这些菌株所产生的醛缩酶是否可用于上述monatin的合成路径中。
本发明的目的在于提供可适合用于合成IHOG的醛缩酶和取代α-酮酸的制备方法，而所述IHOG可用作合成monatin的中间体。

发明内容
本发明人对上述问题进行了深入研究，结果发现某些微生物中存在可优选用于合成目标IHOG的醛缩酶，从而导致本发明的完成。
即，本发明如下所述。
下述(a)或(b)的DNA。
(a)包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的DNA；(b)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白。
下述(c)或(d)的DNA。
(c)编码包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白的DNA；(d)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
下述(e)或(f)的DNA。
(e)包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的DNA；(f)一种DNA，该DNA与包含和序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白。
下述(g)或(h)的DNA。
(g)编码包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白的DNA；(h)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
重组DNA，其特征在于由[1]-[4]中任一项的DNA与载体DNA连接得到。
通过[5]中所述重组DNA转化而成的细胞。
制备具有醛缩酶活性的蛋白的方法，其特征在于将[6]中所述细胞在培养基中进行培养，以及在培养基和/或细胞中累积具有醛缩酶活性的蛋白。
下述(i)或(j)的蛋白(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
下述(k)或(l)的蛋白(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
一种蛋白，其特征于(A)对吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸通过羟醛缩合生成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应具有催化活性，和/或对苯基丙酮酸与丙酮酸通过羟醛缩合生成4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应具有催化活性；(B)(A)中所述活性的最佳pH在33℃约为9；且(C)通过凝胶过滤法测定的分子量约为146kDa，通过SDS-PAGE法测定的每个亚基的分子量约为25kDa。
一种蛋白，其特征于(A)是具有醛缩酶活性的蛋白；(B)来自于假单胞菌属；(C)在pH6和6以上具有pH稳定性；(D)在70℃或以下具有温度稳定性；且(E)通过凝胶过滤法测定的分子量约为146kDa，通过SDS-PAGE法测定的每个亚基的分子量约为25kDa。
[11]所述的蛋白，其特征在于通过在酶反应体系中含有无机磷酸，上述醛缩酶活性得到提高。
具有醛缩酶活性的组合物，该组合物通过在培养基中培养假单胞菌属细菌，在培养基和/或细胞中累积下述(i)-(l)中任一项的蛋白，并对所述培养基和/或细胞进行纯化处理而得到(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是通过使下述通式(1) (通式(1)中，R1为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。R1还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。)所示取代α-酮酸与下述通式(2)
(通式(2)中，R2为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。R2还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。但通式(1)中R1为氢、甲基或羧基甲基时，R2不为氢。)所示取代α-酮酸反应，制备下述通式(3) (通式(3)中的R1和R2与通式(1)和(2)中的R1和R2表示相同含意。)所示取代α-酮酸的方法，其特征在于在催化该反应的蛋白存在下进行反应。
[14]所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R2为氢或羧基。
[15]所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R2为氢。
[14]所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R1为苄基或3-吲哚甲基，所述R2为氢或羧基。
一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是由吲哚-3-丙酮酸与草酰乙酸或丙酮酸制备下式(4) 所示取代α-酮酸的方法，其特征在于在催化该反应的蛋白存在下进行反应。
[14]-[18]中所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于催化所述反应的蛋白来自于选自假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)的微生物。
[19]中所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述微生物为腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、解韧带假单胞菌(Pseudomonasdesmolytica)、欧文氏菌(Erwinia sp.)、莱茵黄杆菌(Flavobacteriumrhenanum)或柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)。
[20]中所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述微生物为腐臭假单胞菌ATCC4683或晕斑假单胞菌AJ2791。
[14]-[21]中所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于催化所述反应的蛋白为下述(i)-(l)中任一项的蛋白。
(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是通过使下述通式(1’) (通式(1’)中，R1为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R3为氢或羧基。R1还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。)所示化合物与下述通式(2’) (通式(2’)中，R4为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。R4还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。)所示取代α-酮酸反应，制备下述通式(3’) (通式(3’)中的R1、R3和R4与通式(1’)和(2’)中的R1、R3和R4表示相同含意。)所示取代α-酮酸的方法，其特征在于在[8]或[9]任一项的蛋白存在下进行反应。
[23]中所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R4为氢或羧基。
附图简述

图1为制备本发明的醛缩酶的步骤流程图。
图2为来自于腐臭假单胞菌ATCC4683的醛缩酶(PtALD)相对于PHOG浓度的醛缩酶的活性测定结果图。
图3为PtALD相对于MgCl2浓度的醛缩酶活性的测定结果图。
图4为PtALD相对于KPi浓度的醛缩酶活性的测定结果图。
图5为PtALD的pH稳定性的测定结果图。
图6为PtALD的温度稳定性的测定结果图。
实施发明的最佳方式下面参照附图对本发明[I]醛缩酶和[II]使用醛缩酶制备取代α-酮酸的方法进行详细说明。
醛缩酶通过本发明人的研究，确认了假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属中存在可产生具有4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)分解活性的醛缩酶的菌株。
这些微生物所产生的醛缩酶催化分解1分子PHOG，生成1分子苯基丙酮酸和1分子丙酮酸的反应，本发明人由此认为该醛缩酶可催化由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。基于这一认识，本发明人为证实新型醛缩酶的存在，在从所述菌株的培养菌体提纯和分离醛缩酶的同时，发现该酶可通过吲哚丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)的羟醛缩合，合成IHOG。
本发明人还提纯了来自于腐臭假单胞菌ATCC4683的醛缩酶(以下有时简称为PtALD)，确定了该醛缩酶的氨基酸序列。而且，本发明人合成了由该醛缩酶的氨基酸序列推断而成的约30个碱基对的DNA分子，使用该DNA分子通过PCR分离获得了编码该醛缩酶的DNA片段，并用该DNA片段作为探针，从所述微生物的染色体文库成功分离出了编码PtALD的全长DNA。
通过上述方法鉴定的编码本发明PtALD的DNA表示在序列表的SEQ ID No.1中。序列表中SEQ ID No.2和3表示序列表中SEQ IDNo.1的核苷酸序列所编码的PtALD的氨基酸序列。序列表中SEQ IDNo.2是序列表中SEQ ID No.1所记载的核苷酸序列中碱基编号456-1118的核苷酸序列所编码的PtALD的氨基酸序列。序列表中SEQ IDNo.3是序列表中SEQ ID No.1所记载的核苷酸序列中碱基编号444-1118的核苷酸序列所编码的PtALD的氨基酸序列，相当于SEQ IDNo.2所记载的氨基酸序列中残基编号5-225的氨基酸序列。序列表中SEQ ID No.2和3所记载的PtALD都具有醛缩酶活性，可催化由1分子吲哚丙酮酸与1分子草酰乙酸(或丙酮酸)合成下式(4)所示4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。
本发明人还利用所获得的编码PtALD的DNA片段作为探针，从晕斑假单胞菌ATCC4683的染色体基因文库成功分离出了编码所述微生物的醛缩酶(以下有时简称为PcALD)的全长DNA。通过上述方法确定的编码本发明PcALD的DNA表示在序列表的SEQ ID No.15中。序列表中SEQ ID No.16表示序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列所编码的PcALD的氨基酸序列。序列表中SEQ ID No.16是序列表中SEQ ID No.15所记载的核苷酸序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列所编码的PcALD的氨基酸序列。序列表中SEQ ID No.16所记载的PcALD也具有醛缩酶活性，可催化由1分子吲哚丙酮酸与1分子草酰乙酸(或丙酮酸)合成下式(4)所示4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。
下面，按照(1)编码醛缩酶的DNA、(2)醛缩酶的性质、(3)醛缩酶的制备方法的顺序对本发明的醛缩酶进行详细说明。
(1)编码醛缩酶的DNA具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列的本发明醛缩酶基因是如上所述分离自腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的染色体DNA。序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列在氨基酸序列水平上与已知的来自于赭色假单胞菌(Pseudomonas ochracea)的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶(基因名proA)(Biosci.Biotechnol.Biochem.，65(12)，2701-2709(2001)Maruyama K.等)具有29％的同源性。
具有序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列的本发明醛缩酶基因是如上所述分离自晕斑假单胞菌AJ2791菌株的染色体DNA。序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列编码的氨基酸序列与已知的来自于赭色假单胞菌的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶(基因名proA)(Biosci.Biotechnol.Biochem.，65(12)，2701-2709(2001)Maruyama K.等)具有28％的同源性，与上述来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶具有41％的同源性。
这里，使用基因分析软件“Genetyx ver.6”(Genetyx公司)，以原始设定值为参数计算得到同源性分析的值。
下面对由醛缩酶产生菌获取编码醛缩酶的DNA的方法进行说明。
首先，确定提纯后的醛缩酶的氨基酸序列。这时可以使用Edman法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.4，227(1950))测定氨基酸序列。也可以使用Applied Biosystems公司制造的测序仪测定氨基酸序列。对于本发明的来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶，用蛋白酶进行有限水解后，通过反相HPLC分离肽片段。对这些片段中的2个进行内部氨基酸序列的测定，结果表明它们是序列表中SEQ IDNo.4和5所示的序列。
在确定氨基酸序列后，即可推断出编码该氨基酸序列的DNA的核苷酸序列。可采用通用密码子推导DNA的核苷酸序列。
在推导出的核苷酸序列基础上，合成约30个碱基对的DNA分子。合成该DNA分子的方法公开在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)上。还可用Applied Biosystems公司制造的合成仪合成该DNA分子。可在从产生醛缩酶的微生物染色体基因文库分离编码醛缩酶的全长DNA时，利用该DNA分子作为探针。或者，在通过PCR法扩增编码本发明醛缩酶的DNA时，利用其作为引物。只是，采用PCR法扩增的DNA不含有编码醛缩酶的全长DNA，所以用PCR扩增的DNA作为探针，从产生醛缩酶的微生物染色体基因文库分离出编码醛缩酶的全长DNA。
White，T.J.等在Trends Genet.5，185(1989)等中记载了PCR法的操作。Cold Spring Harbor出版社的第二版Molecular Cloning中记载了分离染色体DNA的方法和进一步用DNA分子作为探针从基因文库分离目标DNA分子的方法。
John Wiley & Sons，Inc.的A Practical Guide to Molecular Cloning(1985)中记载了分离出的编码醛缩酶的DNA核苷酸序列的测定方法。还可用Applied Biosystems公司制造的DNA测序仪测定核苷酸序列。编码来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶的DNA表示在序列表SEQ ID No.1中，编码来自于晕斑假单胞菌AJ2791菌株的醛缩酶的DNA表示在序列表SEQ ID No.15中。
另外，编码催化由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG反应的醛缩酶的DNA不仅仅是序列表中SEQ ID No.1和15所示的DNA。这是因为在可产生催化由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG反应的醛缩酶的假单胞菌属中，应当能观察到各个种和株的核苷酸序列存在差异。
本发明的DNA不只包括分离出的编码醛缩酶的DNA，在编码醛缩酶的情况下，对从产醛缩酶微生物的染色体DNA分离出的编码醛缩酶的DNA施加人工突变后得到的DNA，也是本发明的DNA。常用的施加人工突变的方法包括例如Method.in Enzymol.，154(1987)上记载的位点特异性突变导入法。
可与包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有醛缩酶活性的蛋白的DNA也是本发明的DNA。这里的“严格条件”是指所谓形成特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。该条件难以用数值明确地表征，不过可以举些例子高同源性的DNA相互之间，例如具有50％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上，特别优选95％或以上同源性的DNA相互之间杂交，而低同源性的DNA相互之间不杂交的条件；或者在通常DNA杂交的洗涤条件下，即在相当于37℃、0.1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更优选65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下进行杂交的条件。“醛缩酶活性”只要是由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的活性即可。只是，在与序列表中SEQ ID No.1核苷酸序列的互补核苷酸序列于严格条件下杂交的核苷酸序列情况下，在33℃、pH9的条件下最好保持具有序列表中SEQ ID No.2或3的氨基酸序列的蛋白的10％或以上，优选30％或以上，更优选50％或以上，进一步优选70％或以上的醛缩酶活性。
与包含序列表中SEQ ID No.15核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有醛缩酶活性的蛋白的DNA也是本发明的DNA。这里的“严格条件”是指所谓形成特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。该条件难以用数值明确地表征，不过可以举些例子高同源性的DNA相互之间，例如具有50％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上，特别优选95％或以上同源性的DNA相互之间杂交，而低同源性的DNA相互之间不杂交的条件；或者在通常DNA杂交的洗涤条件下，即在相当于37℃、0.1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更优选65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下进行杂交的条件。“醛缩酶活性”只要是由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的活性即可。只是，在与序列表中SEQ ID No.15核苷酸序列的互补核苷酸序列于严格条件下杂交的核苷酸序列情况下，在33℃、pH9的条件下最好保持具有序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白的10％或以上，优选30％或以上，更优选50％或以上，进一步优选70％或以上的醛缩酶活性。
而且，编码与序列表中SEQ ID No.1或15的DNA所编码的醛缩酶实质上相同的蛋白的DNA也是本发明的DNA。即下述(a)-(h)的DNA也是本发明的DNA(a)包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的DNA；(b)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白；(c)编码包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白的DNA；(d)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(e)包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的DNA；(f)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白；(g)编码包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白的DNA；(h)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
这里，“一个或多个”是指不明显损害氨基酸残基的蛋白立体构造或醛缩酶活性的范围，具体是1-50个，优选1-30个，更优选1-10个。“醛缩酶活性”如前所述，是指由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的活性。只是，在包含在序列表内SEQ ID No.2、3或16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列情况下，在33℃、pH9的条件下最好保持具有序列表中SEQ ID No.2、3或16的氨基酸序列的蛋白的10％或以上，优选30％或以上，更优选50％或以上，进一步优选70％或以上的醛缩酶活性。
(2)醛缩酶的性质下面，对提纯后的来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶(PtALD)和来自于晕斑假单胞菌AJ2791菌株的醛缩酶(PcALD)的性质进行说明。
本发明的PtALD如前所述的基因分离和分析所表明的那样，具有序列表中SEQ ID No.2或3的氨基酸序列。但是，本发明还包括具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2和3的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
本发明的PcALD如前所述的基因分离和分析所表明的那样，具有序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列。但是，本发明还包括具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
即，本发明的醛缩酶为下述(i)-(l)的蛋白。
(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
这里，“多个”和“醛缩酶活性”的定义与(1)编码醛缩酶的DNA项中的说明一样。
本发明的醛缩酶可催化通过吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的羟醛缩合反应合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。
对本发明醛缩酶的醛缩酶活性的测定，可通过用高效液相色谱(HPLC)测定由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)生成的IHOG量来进行。
具体地说，向含有100mM缓冲液、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM MgCl2、1％(v/v)甲苯的反应液中加入醛缩酶，将其在33℃振荡反应4小时，通过HPLC对生成的IHOG量进行定量，可估算出醛缩酶活性。
例如可利用GL Sciences Inc.制“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)通过HPLC分析对IHOG进行定量。下面给出分析条件的一个例子。
流动相40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液流速1毫升/分钟柱温40℃检测UV 210nm本发明的醛缩酶可催化由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的醛酸缩合合成IHOG的反应。作为催化以2分子α-酮酸(或取代α-酮酸)为反应物的羟醛缩合反应的微生物酶，至今为止报道有两例来自于假单胞菌属细菌的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶和存在于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等中的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶。但全然没有关于前者对PHOG或IHOG的作用的认识、报道等，完全不清楚是否有可能用该酶合成PHOG(和IHOG)。而且后者也未观察到PHOG分解活性，也不可能用该酶合成PHOG(和IHOG)。即，本发明的醛缩酶与至今为止所报道的醛缩酶不同，是具有下述特点的物质即可催化通过吲哚丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)的羟醛缩合合成IHOG的反应。
下面对研究提纯后的PtALD得到的酶学性质进行说明。
PtALD可催化由下述通式(1’) (通式(1’)中，R1为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R3为氢或羧基。R1还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。)所示化合物与下述通式(2’) (通式(2’)中，R4为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。R4还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。)所示取代α-酮酸生成下述通式(3’) (通式(3’)中的R1、R3和R4与通式(1’)和(2’)中的R1、R3和R4表示相同含意。)
所示取代α-酮酸的反应。因此，用本发明的PtALD由通式(1’)和通式(2’)化合物制备通式(3’)化合物的方法也属于本发明。这里，上述R4优选为氢或羧基。
PtALD的最佳pH在33℃约为9左右。本发明PtALD在pH6或以上具有pH稳定性，特别是在pH6-11的范围内具有高pH稳定性。本发明PtALD在70℃以下具有温度稳定性，特别是在20-60℃的范围内具有高温度稳定性。此外，本发明PtALD具有通过向酶反应体系中添加KPi等无机磷酸而提高醛缩酶活性的性质。
通过凝胶过滤法测定PtALD的分子量为约146kDa，通过SDS-PAGE法测定的分子量为约25kDa，由此推测PtALD具有六个分子量约为25kDa的亚基构成的六聚体结构。
(3)醛缩酶的制备方法接下来对本发明醛缩酶的制备方法进行说明。本发明醛缩酶的制备方法有两种(i)通过对产生醛缩酶的细菌进行微生物培养，形成并累积醛缩酶的方法；和(ii)用重组DNA技术制备产生醛缩酶的转化体，通过培养该转化体形成并累积醛缩酶的方法。
(i)通过微生物培养形成并累积醛缩酶的方法在通过对产生醛缩酶的微生物进行培养而形成并累积醛缩酶的方法中，作为醛缩酶获取源的微生物有假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属的微生物。
假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属中，只要是能产生对由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前体酮酸(IHOG)的反应具有催化作用的醛缩酶的微生物，则都可用于本发明，但是更优选腐臭假单胞菌ATCC4683、晕斑假单胞菌AJ2791、解韧带假单胞菌AJ1582、欧文氏菌AJ2917、柑橘黄单胞菌AJ2797、莱茵黄杆菌AJ2468。其中，特别优选腐臭假单胞菌ATCC4683、晕斑假单胞菌AJ2791。这些微生物的保藏地点如下所述。
(1)晕斑假单胞菌AJ2791菌株(i)保藏号FERM BP-8246(转自FERM P-18881)(ii)保藏日2002年6月10日(iii)保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(2)解韧带假单胞菌AJ1582菌株(i)保藏号FERM BP-8247(转自FERM P-18882)(ii)保藏日2002年6月10日(iii)保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(3)欧文氏菌AJ2917菌株(i)保藏号FERM BP-8245(转自FERM P-18880)(ii)保藏日2002年6月10日(iii)保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(4)莱茵黄杆菌AJ2468菌株(i)保藏号FERM BP-1862(ii)保藏日1985年9月30日(iii)保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(5)柑橘黄单胞菌AJ2797菌株(i)保藏号FERM BP-8250(转自FERM P-8462)(ii)保藏日1985年9月30日(iii)保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)作为醛缩酶获取源的微生物的培养方式可以采取液体培养、固体培养的任何方式，不过适于工业的方法是深部通气搅拌培养法。作为营养培养基的营养元素，可以使用通常用于微生物培养的碳源、氮源、无机盐和其它微量营养元素。只要是所用菌株能够利用的营养源，全都可以使用。
通气条件采用有氧条件。培养温度只要是菌株发育，能产生醛缩酶的温度范围即可。因此，虽然没有严格的条件，培养温度通常为10-50℃，优选30-40℃。培养时间随其它培养条件而变化。例如，微生物可培养至产生最大量醛缩酶的时间，通常为约5小时-7天，优选约10小时-3天左右。
培养后，通过离心分离(例如10,000×g、10分钟)收集菌体。由于醛缩酶大部分存在于菌体中，因此通过将菌体破碎或溶菌，使醛缩酶溶解。菌体破碎可以用超声波破碎、弗氏压碎器破碎、玻璃珠破碎等方法进行。在溶菌情况下，可以采用卵清溶菌酶、肽酶处理或者将这两种方法结合使用。
提纯由产生醛缩酶的微生物所产生的醛缩酶时，虽然可以用能溶解酶的溶液作为原料进行提纯，但如果存在未破碎或未溶菌残渣，则对可溶解液体再次进行离心分离操作，以除去沉淀的残余物，这对提纯有利。
醛缩酶的纯化可以采用通常用于纯化酶的所有方法，例如硫酸铵盐析法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、羟基磷灰石色谱法等。其结果是可以获得具有更高比活性的含醛缩酶级分。
(ii)利用重组DNA技术的制备方法下面对通过重组DNA技术制备醛缩酶的方法进行说明。已经知道有很多利用重组DNA技术制备酶、生理活性物质等有用蛋白的例子，通过使用重组DNA技术，可以大量生产天然微量存在的有用蛋白。
图1是本发明醛缩酶的制备步骤的流程图。
首先，制备编码本发明醛缩酶的DNA(步骤S1)。
随后，将制备的DNA与载体DNA连接，制成重组DNA(步骤S2)；用该重组DNA转化细胞制成转化体(步骤S3)。接着，在培养基中培养该转化体，在培养基和/或细胞中形成并累积醛缩酶(步骤S4)。
之后，进入步骤S5，通过回收、提纯该酶来制备纯化醛缩酶。
将步骤S5中生成的纯化醛缩酶或步骤S4中累积了醛缩酶的培养基和/或细胞用于羟醛缩合反应，可大量制备作为目标物质的取代α-酮酸(步骤S6)。
与载体DNA连接的DNA只要可以表达本发明的醛缩酶即可。
这里，作为与载体DNA连接的醛缩酶基因，可以使用下述(a)-(h)等(a)包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的DNA；(b)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白；(c)编码包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白的DNA；(d)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(e)包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的DNA；(f)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白；
(g)编码包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白的DNA；(h)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
用重组DNA技术大量生产蛋白时，优选该蛋白在生产该蛋白的转化体内缔合，形成蛋白的包函体。该表达生产方法的好处有保护目标蛋白不被存在于菌体内的蛋白酶消化、可通过破碎菌体后进行离心分离操作简便地提纯蛋白等。
这样获得的蛋白包函体可用蛋白变性剂溶解，经过主要是除去该变性剂的复性操作后，变成正确折叠的生理活性蛋白。例如人白细胞介素-2的活性恢复(日本特开昭61-257931号公报)等很多例子。
为了由蛋白包函体得到活性蛋白，需要进行溶解、活性恢复等一系列操作，与直接生产活性蛋白的情况相比，操作变得复杂了。但是，当在菌体内大量生产对菌体发育具有影响的蛋白时，通过在菌体内累积无活性的蛋白包函体，可抑制该影响。
大量生产包函体形式的目标蛋白的方法包括在强力启动子控制下单独表达目标蛋白的方法，还有与已知可大量表达的蛋白形成融合蛋白进行表达的方法。
而且，以融合蛋白形式表达后，为切割出目标蛋白，将限制性蛋白酶的识别序列排列在适当位置也是有效的。
用重组DNA技术大量生产蛋白时，可以用细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞等作为被转化的宿主细胞。开发了宿主-载体系的细菌有埃希氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、棒杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌等，优选使用大肠埃希氏菌。因为有很多关于用大肠杆菌大量生产蛋白的技术的论述。下面，对用转化后的大肠杆菌制备醛缩酶的方法进行说明。
可使用大肠杆菌中通常用于生产异源蛋白的启动子作为表达编码醛缩酶的DNA的启动子，例如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、PL启动子等强力启动子。
为生产融合蛋白包函体形式的醛缩酶，在醛缩酶基因的上游或下游，连接编码其它蛋白，优选亲水性肽的基因，形成融合蛋白基因。所述编码其它蛋白的基因只要是能使融合蛋白的累积量增加、提高变性和复性步骤后融合蛋白溶解性的基因即可，例如T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脱氢叶酸还原酶基因、干扰素γ基因、白细胞介素-2基因、凝乳酶原基因等。
将这些基因与编码醛缩酶的基因连接时，使密码子读框吻合。可以在适当的限制性内切酶部位连接，也可以利用适当序列的合成DNA。
为提高产量，优选在融合蛋白基因的下游连接作为转录终止序列的终止子。该终止子可以是T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素耐药基因终止子、大肠杆菌trpA基因终止子等。
用于将编码醛缩酶或醛缩酶与其它蛋白的融合蛋白的基因导入大肠杆菌的载体优选多拷贝载体，其例子有具有来自于Col E1的复制起点的质粒，例如pUC系质粒或pBR322系质粒或其衍生物。这里，“衍生物”是指通过碱基的置换、缺失、插入、添加或倒位等对质粒施加改变后的质粒。这里所说的改变包括用诱变剂或UV照射等进行的诱变处理或者经自发突变等导致的改变。
为筛选转化体，优选该载体具有氨苄青霉素抗性基因等标记。在市场上出售的这样的质粒有具备强力启动子的表达载体(pUC系(宝酒造(株)制)、pPROK系(Clontech制)和pKK233-2(Clontech制))。
按启动子、编码醛缩酶或醛缩酶与其它蛋白的融合蛋白的基因、终止子这一顺序连接的DNA片段与载体DNA连接，可获得重组DNA。
用该重组DNA转化大肠杆菌并对该大肠杆菌进行培养，可以表达生产醛缩酶或醛缩酶与其它蛋白的融合蛋白。被转化的宿主可以使用通常用于异源基因表达的菌株，特别优选大肠杆菌JM109(DE3)、JM109菌株。进行转化的方法和筛选转化体的方法在Cold SpringHarbor出版社的第二版Molecular Cloning(1989)上有记载。
以融合蛋白形式表达时，可以用凝血因子Xa、激肽释放酶等以醛缩酶内不存在的序列为识别序列的限制性蛋白酶来切下醛缩酶。
可以使用M9-酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等通常用于培养大肠杆菌的培养基作为生产培养基。培养条件、生产诱导条件可根据所用载体的标记、启动子、宿主菌的种类等进行适当选择。
回收醛缩酶或醛缩酶与其它蛋白的融合蛋白的方法有下述等方法。若将醛缩酶或其融合蛋白在菌体内溶解，则可以在回收菌体后将菌体破碎或进行溶菌，作为粗酶溶液使用。而且，还可以根据需要通过沉淀、过滤、柱层析等常规方法对醛缩酶或其融合蛋白进行提纯。这时也可以采用利用醛缩酶或其融合蛋白的抗体的提纯法。
形成蛋白包函体时，用变性剂将其溶解。可以与菌体蛋白一起溶解，但考虑到后面的提纯操作，优选取出包函体后将其溶解。从菌体回收包函体可以采用先有技术进行。例如，将菌体破坏，通过离心分离操作等回收包函体。溶解蛋白包函体的变性剂可以是盐酸胍(例如6M、pH5-8)或尿素(例如8M)等。
通过透析等手段除去这些变性剂，可以使其恢复为具有活性的蛋白。透析所用的透析溶液可以使用Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液等，浓度可以是20mM-0.5M，pH可以是5-8。
优选将复性步骤时的蛋白浓度控制在约500μg/ml左右或以下。为抑制复性后的醛缩酶进行自交联，优选透析温度在5℃或以下。除去变性剂的方法除了上述透析法外，还有稀释法、超滤法等，可望用所述任何方法使活性恢复。
当所述醛缩酶基因来自于假单胞菌属细菌时，作为一个优选的例子，可以以假单胞菌属细菌为宿主表达、生产该醛缩酶。关于这种情况下的宿主细胞的描述，例如有Shi-En Lu等报道在丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)中的重组表达法(FEMS Microbiology Letters210(2002)第115-121页)。还有Olsen，R.H.等报道的在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的重组表达法(Journal of Bacteriology，(1982)150，第60-69页)，以及Grapner，S.等报道的在施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的重组表达法(Biomol.Eng.，(2000)，17，第11-16页)。但作为用于表达醛缩酶的宿主细胞的假单胞菌属细菌并不限于所述这些细菌。
然后作为用于将醛缩酶基因导入假单胞菌属细菌的载体，可以使用具有在假单胞菌属细菌内发挥功能的复制起点的质粒。例如，EzaKalyaeva等报道了具有在绿脓假单胞菌中发挥功能的复制子TFK的质粒pKLH4.05。还可以使用可用于革兰氏阴性菌转化的广谱宿主载体。已知这些载体例如RK404(Ditta，G.等，Plasmid 13(1985)第149-153页)、RSF1010(Frey，J.等，Gene 24(1982)第289-296页)等可在假单胞菌属细菌中发挥功能。
使用序列表SEQ ID No.1所示DNA作为编码醛缩酶的DNA时，可生产具有SEQ ID No.2或3所示氨基酸序列的醛缩酶，而使用序列表SEQ ID No.15所示DNA时，可生产具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列的醛缩酶。
使用醛缩酶制备取代α-酮酸的方法下面对本发明取代α-酮酸的制备方法进行说明。本发明取代α-酮酸的制备方法是通过使下述通式(1) 所示取代α-酮酸与下述通式(2)
所示取代α-酮酸反应，制备下述通式(3) 所示取代α-酮酸的方法，其特征是在催化该反应的蛋白存在下实施反应。
通式(1)中，R1为碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。R1还可以被选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。优选R1为碳原子数4或以上、优选碳原子数6或以上的取代基，其中特别优选碳原子数最多至20的芳基或芳烷基(苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、萘基、蒽基、菲基等芳基；苄基、二苯甲基、苯乙烯基、苯乙基、三苯甲基或肉桂基等芳烷基)、碳原子数最多至11的含杂环烃基(呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、哌啶子基、吗啉代、吲哚基等杂环基；被这些杂环基取代的烷基)。R1特别优选为苄基或3-吲哚基甲基，最优选为3-吲哚基甲基。即，通式(1)的取代α-酮酸优选为苯基丙酮酸或吲哚丙酮酸，特别优选吲哚丙酮酸。
通式(2)中，R2为碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物。当R2含有芳环或杂环时，该芳环或杂环可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代。但通式(1)中R1为氢、甲基或羧基甲基时，R2不为氢。R2优选为氢或羧基，特别优选为氢。即，通式(2)的取代α-酮酸优选为草酰乙酸或丙酮酸，特别优选丙酮酸。
通式(3)中的R1和R2与通式(1)和(2)中的R1和R2表示相同含意。
本发明取代α-酮酸的制备方法中，最优选用吲哚丙酮酸作为通式(1)的取代α-酮酸，用丙酮酸作为通式(2)的取代α-酮酸，合成下式(4)所示IHOG。
催化该反应的蛋白只要是可催化通过上述通式(1)所示取代α-酮酸与上述通式(2)所示取代α-酮酸的羟醛缩合反应合成上述通式(3)所示取代α-酮酸的蛋白即可，对其没有特别限制。即，只要是能催化该反应的蛋白，则可以是来自于微生物的蛋白，也可以是通过化学合成法合成的蛋白。
这样的蛋白优选在[I]醛缩酶项中说明的醛缩酶。这种情况下，可以使用培养假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属中能产生可催化该反应的蛋白(醛缩酶)的菌体而得到的醛缩酶；也可以用(2)重组DNA技术制备能产生可催化该反应的蛋白的转化体，使用培养该转化体而得到的醛缩酶。
催化该反应的蛋白只要是可催化合成上述通式(3)所示取代α-酮酸的反应，则可以以任何形式添加到反应体系中。即，可以以单纯蛋白的形式向反应体系中添加催化该反应的蛋白，也可以以含有催化该反应的蛋白(醛缩酶)的具有醛缩酶活性的组合物形式添加到反应体系中。
这里，“具有醛缩酶活性的组合物”只需要含有催化该反应的蛋白(醛缩酶)，具体而言包括培养物、培养基(从培养基中除去菌体后的物质)、菌体(包括培养菌体、洗净菌体任何形式)、将菌体破碎或溶菌后的菌体处理物、对上述培养基和/或细胞进行纯化处理得到的具有醛缩酶活性的组合物(粗酶溶液、纯化酶)等。例如，当用产生醛缩酶的微生物或由重组DNA转化而成的细胞制备取代α-酮酸时，可以一边培养，一边向培养液中添加直接底物，也可以使用从培养基分离得到的菌体、洗净菌体等。可以直接使用将菌体破碎或溶菌后的菌体物理物，也可以从该菌体处理物回收醛缩酶，以粗酶溶液形式使用，还可以将酶提纯后使用。即，只要是具有醛缩酶活性的部分，不管是什么形态，都可以用于本发明取代α-酮酸的制备方法中。
用醛缩酶或具有醛缩酶活性的组合物进行羟醛缩合反应时，可以将含有上述通式(1)所示取代α-酮酸、上述通式(2)所示取代α-酮酸、催化该反应的蛋白或含醛缩酶组合物的反应液调节至20-50℃的适当温度，在保持pH6-12的情况下将反应液静置、振荡或搅拌30分钟至5天。
向该反应液中添加Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+等二价阳离子，可以提高反应速度。从成本方面考虑，优选使用Mg2+。
将这些二价阳离子添加到反应液中时，只要不阻碍反应，可以使用任何盐，优选使用MgCl2、MgSO4、MnSO4等。只要本领域技术人员，则经过简单的预备测试，就都可确定这些二价阳离子的添加浓度，可以添加0.01mM-10mM，优选0.1mM-5mM，更优选0.1mM-1mM。
下面给出实施本发明取代α-酮酸的制备方法时反应条件的一个优选实例，向含有100mM缓冲液、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM MgCl2、1％(v/v)甲苯的反应液中，加入作为酶源的表达醛缩酶的大肠杆菌的洗净菌体，使其达到10％(w/v)，在33℃振荡4小时使其反应，可得到4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。
所生成的通式(3)所示取代α-酮酸可通过公知方法分离提纯。例如，使其与离子交换树脂接触以吸附碱性氨基酸，将其洗脱后进行结晶的方法，或者洗脱后用活性炭等进行脱色过滤、结晶的方法等。
通过使用本发明取代α-酮酸的制备方法，可以由吲哚丙酮酸和草酰乙酸(或丙酮酸)生成monatin的前体酮酸(IHOG)。IHOG通过2位氨基化可得到monatin，所以可在monatin合成中用作中间体。
实施例下面给出实施例，对本发明进行更具体的说明，但本发明并不仅限于这些实施例。实施例中，用作底物的IHOG和PHOG是通过参考例1和2中记载的方法合成的。
实施例1[I]PHOG醛缩酶活性菌的筛选用4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)作为底物，筛选醛缩酶活性菌株。
在肉汤平板培养基(荣研化学)上接种受试微生物(细菌、酵母)，在30℃培养24小时。然后将其接种到含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富马酸、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl胨、0.3g/dl硫酸铵、0.3g/dlK2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、0.05g/dl MgSO4·7H2O、0.25g/dl邻苯二甲酸钠、2g/dl琼脂粉末(pH6.5)的平板上，在30℃培养24小时。将所得菌体接种到含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM PHOG、1mMMgCl2、5mM磷酸钾溶液(KPi)、1％(v/v)甲苯的反应液中，使湿菌体重量为约1％(w/v)。使其在30℃反应24小时。通过使用乳酸脱氢酶(LDH)的酶法测定该反应液中的游离丙酮酸浓度。向含有100mMTris-HCl(pH8.0)、1.5mM NADH、5mM MgCl2、25U/ml LDH的200μL反应液中加入10μL样品，在30℃温育10分钟。测定反应后在340nm的吸光度，由NADH的减少量确定样品中的丙酮酸量。
将生成的苯基丙酮酸通过用GL Sciences公司制“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)的HPLC分析进行定量。分析条件如下所示。
流动相20％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液流速1毫升/分钟柱温40℃
检测UV 210nm通过本条件，PHOG在约9.8分钟、苯基丙酮酸在约12分钟的保留时间处洗脱，分别对其进行了定量。
从受试菌体添加区通过PHOG产生的丙酮酸或苯基丙酮酸量减去对照区(菌体无添加区)的产量，将所得值作为通过醛缩酶产生的量。结果发现表1所示菌株具有以PHOG为底物的醛缩酶活性。
表1 PHOG醛缩酶活性菌株的筛选结果菌株 丙酮酸(mM) 苯基丙酮酸(mM)腐臭假单胞菌ATCC4683 34.9 35.0晕斑假单胞菌AJ2791 33.6 33.9解韧带假单胞菌AJ1582 1.1 2.9欧文氏菌AJ2917 0.8 3.0莱茵黄杆菌CCM298 AJ2468 3.0 6.1柑橘黄单胞菌AJ2797 1.0 3.2选取腐臭假单胞菌ATCC4683，研究由苯基丙酮酸和草酰乙酸或丙酮酸合成PHOG的反应。在含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM苯基丙酮酸、1mM MgCl2、5mM KPi、100mM草酰乙酸或丙酮酸、1％(w/w)甲苯的反应液中，接种腐臭假单胞菌ATCC4683(AJ2212)菌体，使最终浓度达到约1％(w/v)，在30℃反应16小时。反应结束后，通过HPLC确定生成的PHOG量。由苯基丙酮酸和草酰乙酸或丙酮酸生成的PHOG的量如表2所示。
表2 由苯基丙酮酸和草酰乙酸和/或丙酮酸合成PHOG的量

由表2可知，在菌体添加区可确认PHOG产量增加，苯基丙酮酸+草酰乙酸和苯基丙酮酸+丙酮酸的任何组合，都可通过该醛缩酶的作用使其产生PHOG。
提纯来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的IHOG醛缩酶如下所述由腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的可溶性部分提纯IHOG醛缩酶。在下述条件下测定以PHOG为底物的醛缩酶分解活性。
反应条件50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM PHOG、0.2mMNADH、0.2mM KPi、1mM MgCl2、16U/ml乳酸脱氢酶、3μL酶/600μL反应液，在30℃测定340nm的吸光度。
(1)制备可溶性部分取1接种环在肉汤平板培养基上30℃培养24小时后的腐臭假单胞菌ATCC4683菌体，接种到装有50ml酶生产培养基(含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富马酸、0.5g/dl硫酸铵、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dlKH2PO4、0.05g/dl MgSO4·7H2O、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl胨、0.25g/dl邻苯二甲酸钠、0.005％Antifoam A(Sigma公司制)，用KOH调节至pH6.5)的500ml容量瓶中，在30℃振荡培养24小时。将0.5ml该培养液接种到40个装有50ml酶生产培养基的500ml容量瓶中，在30℃振荡培养24小时。通过离心分离从所得培养液收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH7.6))中，洗净后，再次进行离心分离，收集菌体。将所得洗净菌体悬浮于200ml缓冲液A中，在4℃超声波破碎30分钟。将破碎液离心分离(×8000rpm、10分钟×2次)，除去菌体残渣，再次进行超速离心分离(×50000rpm、30分钟)，所得上清液即为可溶性部分。
(2)阴离子交换层析Q-Sepharose FF将80ml上述可溶性部分装入用缓冲液A平衡后的阴离子交换层析柱Q-Sepharose FF 26/10(Pharmacia，CV＝20ml)，使其吸附到载体上。用缓冲液A洗去未吸附到载体上的蛋白(非吸附蛋白)，然后从0M到0.7M线性改变KCl浓度(总共140ml)，洗脱吸附的蛋白。检测各洗脱级分的PHOG醛缩酶活性，在相当于约0.5M的级分中检测到PHOG醛缩酶活性峰。反复实施2次同样的层析操作。
(3)疏水层析Phenyl Sepharose HP HR 16/10将检测了醛缩酶活性的溶液在4℃对缓冲液B(50mM Tris-HCl(pH7.6)、1M硫酸铵、pH7.6)透析过夜，用0.45μm滤器过滤。将所得滤液装入用缓冲液B平衡的疏水性层析柱Phenyl Sepharose HPHR 16/10(Pharmacia)。通过该操作使醛缩酶吸附到载体上。
用缓冲液B洗去未吸附到载体上的非吸附蛋白，然后从1M到0M线性改变硫酸铵浓度，洗脱醛缩酶。检测所得各洗脱级分的醛缩酶活性，在硫酸铵浓度约为0.2M的洗脱级分可检测到醛缩酶活性。
(4)凝胶过滤层析Sphadex 200 HP 16/60分别收集含有醛缩酶的级分，用缓冲液A进行透析，用0.45μm的滤器过滤。将所得滤液用超滤膜Centriprep 10进行浓缩。将所得浓缩液装入用缓冲液C(20mM Tris-HCl(pH.6)，0.1M KCl)平衡的凝胶过滤层析柱Sephadex 200 HP 16/60(Pharmacia)，以1毫升/分钟的流速洗脱。通过该操作，醛缩酶洗脱到66-71ml的级分中。由活性峰的洗脱位置，估算出该醛缩酶的分子量约为146kDa。
(5)阴离子交换层析Mono Q HR5/5用0.45μm的滤器过滤所得级分。将此时得到的滤液装入用缓冲液A平衡的阴离子交换层析柱Mono-Q HR5/5(Pharmacia)。通过该操作使醛缩酶吸附到载体上。用缓冲液A洗去非吸附蛋白，然后从0M到700mM线性改变KCl浓度，洗脱蛋白(总计24ml)。检测各洗脱级分的醛缩酶活性，在KCl浓度为约0.4M的洗脱位置可检测到醛缩酶活性。
(6)羟基磷灰石层析CHT-II将所得级分在4℃用缓冲液D(10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0))透析过夜，用0.45μm的滤器过滤。将此时所得的滤液装入用缓冲液D平衡的羟基磷灰石层析柱CHT-II 5ml(BioRad公司制)。通过该操作，醛缩酶未吸附到载体上，可与吸附蛋白分离。
将通过上述柱层析提纯的级分装入SDS-PAGE，结果在相当于约25kDa的位置检测到大致单一的带。通过凝胶过滤层析测定的分子量约为146kDa，由此可推断该醛缩酶形成了六聚物。纯化表如表3所示。
表3 来自于腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的IHOG醛缩酶的提纯表
IHOG醛缩酶内部氨基酸序列的确定将一份约2μg的纯化醛缩酶装入SDS-PAGE，然后用胰蛋白酶处理SDS-PAGE中的样品(pH8.5，35℃，20小时)，装入反相HPLC，分离出肽片段。在分离出的各部分中，检测出其中两部分分别具有如下所述包含20个残基、12个残基的氨基酸序列(序列编号4、5)。
表4 确定的内部氨基酸序列
来自腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的IHOG醛缩酶基因的克隆(1)染色体DNA的制备用50ml肉汤培养基将腐臭假单胞菌ATCC4683株在30℃培养过夜(预培养)。用5ml该培养液接种于50ml新鲜肉汤培养基进行本培养。培养至对数生长后期，然后离心分离(12000×g，4℃，15分钟)50ml培养液，收集菌体。用该菌体通过既定方法制备染色体DNA。
(2)通过PCR获取内部序列在已确定的IHOG醛缩酶内部氨基酸序列的基础上，合成下面的混合引物(SEQ ID No.6、7)。
表5 在内部氨基酸序列基础上设计、合成的混合引物

用合成的混合引物，以腐臭假单胞菌ATCC4683的染色体DNA为模板，通过PCR进行扩增。PCR反应用PCR ThermalPERSONEL(TaKaRa公司制)进行，以下述条件进行30个循环。
94℃ 30秒55℃ 30秒72℃ 1分钟将PCR产物装入琼脂糖凝胶电泳，检测出扩增了约500bp的片段。将该DNA片段克隆到pUC18上并测定核苷酸序列，由所得DNA片段推测出的氨基酸序列与IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列一致，可确认获得了目标醛缩酶基因。
(3)通过菌落杂交获取全长基因使用经PCR扩增的DNA片段，通过DNA杂交分析和菌落杂交获取全长基因。使用DIG High Prime(Roche Diagnostics K.K.公司制)，如说明书所述在37℃下温育过夜，标记探针，从而制得DNA探针。DNA杂交分析是根据说明书将1μg染色体DNA用各种限制酶完全消化，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，再印迹到尼龙膜上，并如下所述进行操作。杂交是用DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics K.K.)进行，在50℃预杂交1小时，然后加入探针，使其杂交过夜。用DIG NucleotideDetection Kit检测带。结果，检测出了与该PCR片段探针强杂交的约4kbp的PstI片段。然后，通过菌落杂交获得该PstI片段。将20μg染色体DNA用PstI处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收到约4kbp大小的片段。将其与pUC118连接，在大肠杆菌JM109中制作文库。将菌落转移到尼龙膜滤器(Hybond-N，Amersham)上，进行碱变性、中和、固定化处理。用DIG Easy Hyb进行杂交。将滤器浸在缓冲液中，在42℃预杂交1小时。之后，加入制成的标记探针，在42℃杂交16小时。用SSC洗净后，用DIG Nucleotide Detection Kit(RocheDiagnostics K.K.)检测与探针杂交的菌落。结果，获得了与探针强杂交的克隆。
测定从获得的克隆中回收的质粒DNA的核苷酸序列，确定其具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。发现了678bp的orf，该orf含有与所确定的内部氨基酸序列相对应的核苷酸序列(SEQ ID No.1中编号507-566和编号1046-1082)，从而获得了目标醛缩酶的全长。
(4)IHOG醛缩酶在大肠杆菌中的表达(其一)使用BamHI/HindIII消化用表6所示引物(SEQ ID No.8和9)从腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA扩增得到的片段，插入到pUC18的BamHI/HindIII位点，以构建质粒pUCALD。将构建成的表达质粒导入大肠杆菌JM109中，将转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃振荡过夜(预培养)。将预培养液以1％接种于50ml的LB培养基中，在37℃进行本培养。培养开始约2小时后加入IPTG，使最终浓度达到1mM，再培养3小时。培养结束后，收集菌体，进行洗涤，悬浮于1ml的20mM Tris-HCl(pH7.6)，用Multi-BeadsShocker(安井器械公司制造)将菌体破碎。将破碎液以15000rpm离心分离10分钟，上清液即为粗酶溶液。
表6 引物SEQ ID No.8 ALD-5’Bam(5’-GCC GGA TCC ACA AGG GTT CAG TCA TTC ATG G-3’)SEQ ID No.9 ALD-3’Hind(5’-CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C-3’)用该粗酶溶液测定以PHOG为底物的醛缩酶活性，导入了pUC18的大肠杆菌(对照品)中未检测到PHOG醛缩酶活性，而导入pUCADL的菌株中则检测到了0.81U/mg蛋白的PHOG醛缩酶活性。这表明该基因编码目标醛缩酶。
用表达醛缩酶的菌株由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)用[IV]中制成的表达醛缩酶的大肠杆菌的洗净菌体作为酶源，由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。采用GL Sciences公司制造的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)，通过HPLC分析对IHOG进行定量。分析条件如下所述。
流动相40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液流速1毫升/分钟柱温40℃检测UV 210nm向含有100mM缓冲液(Tris-HCl 8.0、9.0或甘氨酸-NaOH 10.0)、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM MgCl2、1％(v/v)甲苯的反应液中加入表达醛缩酶的大肠杆菌的洗净菌体，使其达到10％(w/v)，在33℃振荡反应4小时。适当稀释酶反应液，对生成的IHOG进行定量。
表7 通过醛缩酶生成的IHOG量pH醛缩酶 IHOG(mM)8 +9.28 -0.429 +12.19 -1.610+10.710-5.4结果，在表达醛缩酶的大肠杆菌添加区中IHOG的产量增加，可通过该醛缩酶形成IHOG。
实施例2 IHOG醛缩酶在大肠杆菌中的高水平表达(其二)(1)构建含有trp启动子和rrnB终止子的质粒pTrp4对大肠杆菌W3110染色体DNA上的trp操纵子的启动区，以表8所示寡核苷酸为引物，通过PCR(SEQ ID No.10和11的组合)扩增目标基因区，并将所得DNA片段连接到pGEM-Teasy载体(Promega)上。用该连接物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中选择具有目标质粒的菌株，所述目标质粒中trp启动子以与lac启动子相反的方向插入。然后将含有用Eco0109I/EcoRI处理该质粒所得的trp启动子的DNA片段与用Eco0109I/EcoRI处理pUC19(Takara制)所得的产物连接。用该连接物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中选择具有目标质粒的菌株，将质粒命名为pTrp1。接着用HindIII/HincII处理pKK223-3(Amersham Pharmacia制)，将所得含有rrnB终止子的DNA片段与pTrp1的HindIII/PvuII处理物连接。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中选择具有目标质粒的菌株，将质粒命名为pTrp2。然后以pTrp2为模板，以表中所示寡核苷酸为引物(SEQ ID No.10和12的组合)，通过PCR扩增trp启动区。用Eco0109I/NdeI处理该DNA片段，与pTrp2的Eco0109I/NdeI处理物连接。用该连接物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中选择具有目标质粒的菌株，将该质粒命名为pTrp4。
表8 引物SEQ ID No.10 5’端 GTATCACGAGGCCCTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATCEco0109ISEQ ID No.11 3’端 TTCGGGGATTCCATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCNdeISEQ ID No.12 3’端 GGGGGGGGCATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTGNdeI(2)表达醛缩酶基因的质粒ptrpALD1、ptrpALD2的构建和在大肠杆菌中的表达使用NdeI/HindIII消化用表9所示引物(SEQ ID No.9和13)由腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA扩增得到的片段，消化产物插入到pTrp4的NdeI/HindIII位点，以构建质粒ptrpALD1。该质粒以SEQID No.1的核苷酸序列中编号444的ATG为起始密码子，表达包含翻译所得SEQ ID No.3的氨基酸序列的醛缩酶基因。并使用NdeI/HindIII消化用引物(SEQ ID No.9和14)由腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA扩增得到的片段，消化产物插入到pTrp4的NdeI/HindIII位点，以构建质粒ptrpALD2。该质粒以SEQ ID No.1的核苷酸序列中编号456的ATG为起始密码子，表达包含翻译所得SEQID No.2的氨基酸序列的醛缩酶基因。分别将构建成的表达质粒导入大肠杆菌JM109中，将转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃振荡培养过夜(预培养)。将预培养液以1％接种于50ml的LB培养基中，在37℃进行本培养。培养开始约2小时后加入IPTG，使最终浓度达到1mM，再培养3小时。培养结束后，收集菌体，进行洗涤，悬浮于1ml的20mM Tris-HCl(pH7.6)中，用Multi-BeadsShocker(安井器械公司制造)将菌体破碎。将破碎液以15000rpm离心分离10分钟，上清液即为粗酶溶液。
表9 引物SEQ ID No.9 ALD-3’Hind(5’-CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C-3’)SEQ ID No.13 ALD-5’Nde-1(5’-GGT TCA GTC ACA TAT GGA GGT CGC TAT GTC-3’)SEQ ID No.14 ALD-5’Nde-2(5’-ATG AGG GTC CAT TAG TCA TTG CCC GGT TCA CGC-3’)用该粗酶溶液测定以PHOG为底物的醛缩酶活性，导入了pTrp4的大肠杆菌(对照品)中未检测到PHOG醛缩酶活性，而导入ptrpADL1的菌株中则检测到了16.1U/mg蛋白的PHOG醛缩酶活性，导入ptrpADL2的菌株中则检测到了36.0U/mg蛋白的PHOG醛缩酶活性。这表明使用含有SEQ ID No.2或3的氨基酸序列的醛缩酶，都具有醛缩酶活性。
实施例3来自晕斑假单胞菌AJ2791菌株的IHOG醛缩酶的克隆(1)染色体DNA的制备用50ml肉汤培养基将晕斑假单胞菌AJ2791菌株在30℃培养过夜(预培养)。用5ml该培养液接种于50ml肉汤培养基进行本培养。培养至对数生长后期，然后离心分离(12000×g，4℃，15分钟)50ml培养液，收集菌体。用该菌体通过方法制备染色体DNA。
(2)通过DNA分析和菌落杂交获取全长基因来自晕斑假单胞菌AJ2791菌株的IHOG醛缩酶(以下称为PcALD)基因的克隆，以来自腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的IHOG醛缩酶基因为探针通过DNA杂交分析和菌落杂交进行。使用表9所示引物ALD-5’Nde-1(SEQ ID No.13)和ALD-3’Hind(SEQ ID No.9)，由腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA通过PCR扩增IHOG醛缩酶基因全长。使用扩增后的DNA片段作为探针，通过DNA分析和菌落杂交获取全长基因。使用DIG High Prime(Roche Diagnostics K.K.公司制)，如说明书所述在37℃下温育过夜，标记探针，从而制得DNA探针。DNA杂交分析是根据说明书将1μg晕斑假单胞菌AJ2791菌株染色体DNA用各种限制酶完全消化，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，再印迹到尼龙膜上，并如下所述进行操作。杂交是用DIG EasyHyb(Roche Diagnostics K.K.)进行，在37℃预杂交1小时，然后加入探针，使其在37℃杂交过夜。膜用2×SSC在室温下洗涤2次，每次5分钟，然后用0.1×SSC在37℃洗涤2次，每次15分钟。用DIGNucleotide Detection Kit检测带。结果，检测出了与探针杂交的约2.2kbp的PstI/HindIII片段。然后，通过菌落杂交获得该PstI/HindIII片段。将20μg染色体DNA用PstI/HindIII处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收到约2.2kbp大小的片段。将其与经PstI/HindIII处理的pUC18连接，在大肠杆菌JM109中制作文库。将菌落转移到尼龙膜滤器(Hybond-N，Amersham公司制)上，进行碱变性、中和、固定化处理。用DIG Easy Hyb进行杂交。将尼龙膜滤器浸在缓冲液中，在37℃预杂交1小时。之后，加入制成的标记探针，在37℃杂交16小时。将尼龙膜滤器用2×SSC在室温下洗涤2次，每次5分钟，然后用0.1×SSC在37℃洗涤2次，每次15分钟。用DIG NucleotideDetection Kit(Roche Diagnostics K.K.)检测与探针杂交的菌落。结果，获得了与探针杂交的克隆。
测定从阳性克隆回收的质粒DNA的核苷酸序列，发现了744bp的orf，获得了目标醛缩酶的全长。将构建成的插入PcALD基因的质粒命名为pUCPcALD。
将pUCPcALD导入大肠杆菌JM109中，将转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(LB-amp培养基)中于37℃振荡培养过夜(预培养)。将预培养液以1％接种于50ml的新鲜LB培养基中，在37℃进行本培养。培养开始约2小时后加入IPTG，使最终浓度达到1mM，再培养3小时。培养结束后，收集菌体，进行洗涤，悬浮于1ml的20mM Tris-HCl(pH7.6)中，用Multi-Beads Shocker(安并器械公司制造)将菌体破碎。将破碎液以15000rpm离心分离10分钟，上清液即为粗酶溶液。
用该粗酶溶液测定以PHOG为底物的醛缩酶活性，导入了pUC18的大肠杆菌(对照品)中未检测到PHOG醛缩酶活性，而导入pUCADL的菌株中则检测到了39.3U/mg蛋白的PHOG醛缩酶活性。这表明该基因编码目标醛缩酶。
实施例4提纯来自腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶的重组酶如下所述，从高表达来自腐臭假单胞菌ATCC4683菌株的醛缩酶(以下称为PtALD)的大肠杆菌的可溶性部分纯化重组PtALD。醛缩酶活性测定通过在下述条件下测定以PHOG为底物的醛缩酶分解活性来进行。
反应条件50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM PHOG、0.2mM NAD、0.2mM KPi、1mM MgCl2、16U/ml乳酸脱氢酶、3μL酶/600μL反应液，在30℃测定340nm的吸光度。
(1)制备可溶性部分取1接种环在LB-amp平板培养基上于37℃培养16小时后的大肠杆菌JM109/ptrpALD2菌体，接种到装有3ml LB-amp培养基的试管中，在37℃振荡培养16小时。将0.5ml该培养液接种到10个装有50ml LB-amp培养基的500ml容量瓶中，在37℃振荡培养16小时。通过离心分离从所得培养液收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mMHepes-KOH(pH7.6))中，洗净后，再次进行离心分离，收集菌体。将所得洗净菌体悬浮于25ml缓冲液A中，在4℃进行30分钟超声波破碎。将破碎液离心分离(×8000rpm、10分钟×2次)，除去菌体残渣，所得上清液为粗提取部分。
(2)阴离子交换层析Q-Sepharose FF将23ml上述粗提取部分装入用缓冲液A平衡的阴离子交换层析柱Q-Sepharose FF 26/10(Pharmacia，CV＝20ml)，使其吸附到载体上。用缓冲液A洗去未吸附到载体上的蛋白(非吸附蛋白)，然后从0M到0.7M线性改变KCl浓度(总共140ml)，洗脱吸附的蛋白。检测各洗脱级分的PHOG醛缩酶活性，在相当于约0.5M的级分中检测到PHOG醛缩酶活性峰。
(3)疏水层析Phenyl Sepharose HP HR 16/10将检测到醛缩酶活性的溶液在4℃用缓冲液B(20mMHepes-KOH(pH7.6)、1M硫酸铵、pH7.6)透析过夜，将以10000rpm离心分离10分钟后的上清液用0.45μm滤器过滤。将所得滤液装入用缓冲液B平衡的疏水层析柱Phenyl Sepharose HP HR 16/10(Pharmacia)。通过该操作使醛缩酶吸附到载体上。
用缓冲液B洗去未吸附到载体上的非吸附蛋白，然后从1M到0M线性改变硫酸铵浓度，洗脱醛缩酶。检测所得各洗脱级分的醛缩酶活性，在硫酸铵浓度约为0.2M的洗脱位置可检测到醛缩酶活性。
将通过上述柱层析操作提纯的级分装入SDS-PAGE，结果在相当于约25kDa的位置经CBB染色检测到单一的带。将所得重组PtALD溶液用缓冲液A在4℃透析过夜。通过上述操作，获得17ml 350U/ml的PtALD溶液。
实施例5提纯来自晕斑假单胞菌AJ2791菌株的醛缩酶的重组酶从高表达来自晕斑假单胞菌AJ2791的醛缩酶(PcALD)的大肠杆菌的可溶性部分提纯重组PcALD。
取1接种环在LB-amp平板培养基上于37℃培养16小时后的大肠杆菌JM109/pUCPcALD菌体，接种到装有3ml LB-amp培养基的试管中，在37℃振荡培养16小时。将0.5ml该培养液接种到7个装有50ml LB-amp培养基(+0.1mM IPTG)的500ml容量瓶中，在37℃振荡培养16小时。通过离心分离从所得培养液收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mM Hepes-KOH(pH7.6))中，洗净后，再次进行离心分离，收集菌体。将所得洗净菌体悬浮于30ml缓冲液A中，在4℃进行30分钟超声波破碎。将破碎液离心分离(×8000rpm、10分钟×2次)，除去菌体残渣，所得上清液为粗提取部分。
将所得粗提取部分通过与实施例4中提纯重组PtALD相同的方法进行柱层析纯化。将通过Q-Sepharose、Phenyl Superose两阶段层析操作提纯后的级分装入SDS-PAGE，结果在相当于约25kDa的位置经CBB染色检测到单一的带。将所得重组PcALD溶液用缓冲液A在4℃透析过夜。通过上述操作，获得10ml 108U/ml的PcALD溶液。
实施例6用PtALD、PcALD由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)用实施例4和实施例5中制成的PtALD、PcALD作为酶源，由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。采用GL Sciences公司制造的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)，通过HPLC分析对IHOG进行定量。分析条件如下所述。
流动相40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液流速1毫升/分钟柱温40℃检测UV 210nm向含有100mM Hepes-KOH(pH8.5)、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM至5mM MgCl2的反应液中分别加入PtALD、PcALD，使其分别达到1.8U/ml、0.8U/ml，在33℃反应4小时。适当稀释酶反应液，对生成的IHOG进行定量。结果，可通过该醛缩酶形成IHOG。
表10MgCl2(mM) IHOG(mM)1 4.9PcALD5 5.41 11.4PtALD5 10.5
实施例7用PtALD合成各种取代α-酮酸用实施例4中制备的PtALD，测定丙酮酸与表11中给出的各种底物的羟醛缩合活性。配制含有100mM甘氨酸-NaOH(pH9)、50mM底物、250mM丙酮酸钠、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALD的反应液，在33℃温育2小时。将所得反应液用截留分子量(molecular cutoff)为10000的超滤膜Microcon 10(Amicon)进行超滤。将2μl滤液稀释于200μl的50％乙腈/0.1％氨水溶液，进行ESI-MS分析。
结果，检测出了表12中所示底物的相应m/z值的峰，表明生成了目标丙酮酸的羟醛缩合物。
表11 用PtALD进行的丙酮酸与各种底物的羟醛缩合底物 底物 羟醛缩合物 精确MS [M-H]-(计算值) (测定值)吲哚-3-丙酮酸 291.1 290.2β-羟基丙酮酸 192.03 191.192-丁酮酸190.05 189.193-甲基-2-氧代丁酸 204.06 203.08α-酮戊二酸 234.04 233.45丙酮酸 176.03 175.2D-阿拉伯糖 238.07 237.15L-甘露糖 268.08 267.72
表12 用PtALD进行的丙酮酸与各种底物的羟醛缩合(表11的续)底物 底物 羟醛缩合物 准确的MS [M-H]-(计算值) (测定值)L-核糖 238.07237.05N-乙酰基-L-甘露糖胺 309.27308.48实施例8 PtALD在酶学上的各种性质用实施例4中制备的PtALD研究下面给出的项目。
基本测定条件50mM Hepes-KOH(pH8.0)、2mM PHOG、5mMMgCl2、3mM KPB(pH8)、16U/ml乳酸脱氢酶，在30℃测定340nm的吸光度。
(1)以PHOG为底物的动力学常数由图2-4所示结果，分别确定Vmax(对于PHOG)＝91.7μmol/min/mg、Km(对于PHOG)＝0.10mM、Km(对于MgCl2)＝0.019mM、Ka(对于KPi)＝0.95mM。另外，加入1mM MgCl2后的醛缩酶活性比无添加区上升了2.7倍，加入5mM KPB后的活性比无添加区的活性上升了2倍。
(2)pH稳定性在pH3-11的范围内测定pH稳定性。测定所用的缓冲液如下所述乙酸钠缓冲液(pH3、4、5、6)、磷酸钾缓冲液(pH6、6.5、7、7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH7、7.5、8、8.5)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9、9.5、10)、CAPS-NaOH缓冲液(pH10、10.5、11)。将PtALD在100mM的各缓冲溶液中于37℃温育30分钟，在基本测定条件下测定残存活性。结果如图5所示。
(3)温度稳定性在25℃-70℃，将PtALD在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和100mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0)中温育30分钟，然后在基本测定条件下测定残存活性。结果如图6所示。
实施例9用PtALD合成取代α-酮酸用实施例4中制备的PtALD，测定乙醛与α-丁酮酸的羟醛缩合活性。配制含有100mM甘氨酸-NaOH(pH9)、50mM乙醛、250mM α-丁酮酸、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALD的反应液，在33℃温育16小时。将所得反应液用截留分子量为10000的超滤膜Microcon10(Amicon)进行超滤。将10μl滤液稀释于200μl的50％乙腈/0.1％氨水溶液，进行ESI-MS分析。
结果，预计产物的准确分子量(计算值)为146.06，与此相对，检测出了对应于[M+H]的m/z值的峰(m/z＝+146.8)，由此确认通过下述反应合成了羟醛缩合物。
乙醛 α-丁酮酸参考例1 4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-酮戊二酸(IHOG)的合成向溶解了18.91g(286.5mmol、含量为85％重量)氢氧化钾的64.45ml水溶液中，加入7.50g(35.8mmol、含量为97.0％重量)吲哚-3-丙酮酸和14.18g(107.4mmol)草酰乙酸并使其溶解。将该混合溶液在35℃搅拌24小时。
再加入40.0ml 3N盐酸进行中和(pH＝7.0)，得到153.5g中和反应液。该中和反应液中含有5.55g 4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-酮戊二酸，收率为53.3％(对吲哚丙酮酸而言)。
向该中和反应液中加入水，使体积为168ml，使其装入充填了840ml合成吸附剂(三菱化学制的DIAION-SP207)的树脂塔(直径4.8cm)。再以23.5ml/min的流速通入纯水，收集1.73-2.55(L/L-R)产物，以收率54.7％(相对于投入树脂中的量)获得含有3.04g高纯度4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-酮戊二酸。
(NMR测定)1H-NMR(400MHz，D2O)3.03(d，1H，J＝14.6Hz)，3.11(d，1H，J＝14.6Hz)，3.21(d，1H，J＝18.1Hz)，3.40(d，1H，J＝18.1Hz)，7.06-7.15(m，3H)，7.39(d，1H，J＝7.8Hz)，7.66(d，1H，J＝7.8Hz).
13C-NMR(100MHz，D2O)35.43，47.91，77.28，109.49，112.05，119.44，119.67，121.91，125.42，128.41，136.21，169.78，181.43，203.58参考例2 4-苯基甲基-4-羟基-2-酮戊二酸(PHOG)的合成向溶解了13.8g氢氧化钾(纯度85％)的25ml水中加入5.0g(30.5mmol)苯基丙酮酸、12.1g(91.4mmol)草酰乙酸，使其在室温下反应72小时。用浓盐酸将反应液的pH值调节至2.2，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水洗涤有机层，经无水硫酸镁干燥，然后浓缩得到残余物。将残余物在乙酸乙酯和甲苯中进行重结晶，得到2.8g(11.3mmol)4-苯基甲基-4-羟基-2-酮戊二酸结晶。
(NMR测定)1H NMR(D2O)δ2.48(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.60(d，J＝l4.4Hz，0.18H)，2.85-3.30(m，3.64H)，7.17-7.36(m，5H)(分子量测定)ESI-MS计算值C12H12O6＝252.23，分析值251.22(MH-)产业实用性本发明的醛缩酶是催化吲哚丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)的羟醛缩合反应的新型醛缩酶，适合用于合成可用作monatin合成中间体的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。
序列表<110>味之素株式会社<120>新型醛缩酶<130>PAMA-15135<140>
<141>
<150>JP2002-245980<151>2002-08-26<150>JP2003-171299<151>2003-06-16<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1296<212>DNA<213>腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)
<220>
<221>发明人杉山雅一；渡部乙比古<220>
<221>CDS<222>(456)..(1118)<223>醛缩酶1<220>
<221>CDS<222>(444)..(1118)<223>醛缩酶2<400>1gtacaccgtc ctgactcagg gcgcgctcgg cacgggttga tctatgagcg ctgtttgccc 60agaatgacgt cggggtcacg tacgatcaaa gcaactacct gatcgcccag tgggcctgac 120ctgtccggtg tcggcatcag ctacctgcct cgccaagtgt ctctcgccat tggtggacca 180gggtcgggct actagtcatc gaaaccgagc ctgcgctgcc tcccatccaa tacatcgccg 240tacaccgcgc cgatcgtctt cagggcctca gcgtcgaggt tgcacgtctg gcagctcgtt 300gctgtgattt cagccgcatg gtgtggtaac acaggcgctg gatacgagaa aaaaagcgat 360gtattttcat agataaatat cgctaatagt gccaagcgac ctttcttact atgaacgcat 420agcccacaag ggttcagtca ttc atg gag gtc gct atg tca ttg ccc ggt tca 473Met Glu Val Ala Met Ser Leu Pro Gly Ser15 10
cgc atc tac cct tct ccg ccc cag gca cca cgc tca ctg ctg gac gcg 521Arg Ile Tyr Pro Ser Pro Pro Gln Ala Pro Arg Ser Leu Leu Asp Ala15 20 25ttt cag aac gta gtg acg ccg cat atc agt gat aac ctc ggg cgt cac 569Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser Asp Asn Leu Gly Arg His30 35 40atc ggt gcc cgg ggg ctg acg cgc tat aac cac acc ggc aaa ctg gtg 617Ile Gly Ala Arg Gly Leu Thr Arg Tyr Asn His Thr Gly Lys Leu Val45 50 55ggc acc gcc ctg acg gtg aag act cgc ccc ggc gac aac ctc tac atc 665Gly Thr Ala Leu Thr Val Lys Thr Arg Pro Gly Asp Asn Leu Tyr Ile60 65 70tac aaa gca ctg acg ctg atc gaa ccc gga cac gtg ctg gtg atc gac 713Tyr Lys Ala Leu Thr Leu Ile Glu Pro Gly His Val Leu Val Ile Asp75 80 85 90gct cag ggt gac gcg acc aac gcg gtc att ggt gag ctg atc aag ctc 761Ala Gln Gly Asp Ala Thr Asn Ala Val Ile Gly Glu Leu Ile Lys Leu95 100 105tac gcg cag caa cgt ggc tgt gtc ggc ttc gtc gtc gac ggc gcc atc 809Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Cys Val Gly Phe Val Val Asp Gly Ala Ile110 115 120cgc gat gtc gcc agt ttt gaa gat acg cct tgc tat gcc cgt agc gtg 857Arg Asp Val Ala Ser Phe Glu Asp Thr Pro Cys Tyr Ala Arg Ser Val125 130 135gtg cat tgc ggt ccc tac aaa agc ggc cca ggg gaa atc aat gtc ccg 905
Val His Cys Gly Pro Tyr Lys Ser Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro140 145 150gtg tca atc ggc ggg atg atc atc aat ccg ggc gac atc att gtc ggt 953Val Ser Ile Gly Gly Met Ile Ile Asn Pro Gly Asp Ile Ile Val Gly155 160 165 170gac gag gat ggg ctg gtt gcc ttc tcg ccc gac cat gcc gag cag gtg 1001Asp Glu Asp Gly Leu Val Ala Phe Ser Pro Asp His Ala Glu Gln Val175 180 185ttg gtc aag gcg cga gag cat gac gcg cat gaa cag cag gtc aaa gcc 1049Leu Val Lys Ala Arg Glu His Asp Ala His Glu Gln Gln Val Lys Ala190 195 200gaa atc gcc act ggc gcc atc gat cag tca tgg ctg gac aaa gtg ctg 1097Glu Ile Ala Thr Gly Ala Ile Asp Gln Ser Trp Leu Asp Lys Val Leu205 210 215gaa aag gct ggc ctg gcg aac tgaaaaacac tgtgtaatcg ccttgctgca1148Glu Lys Ala Gly Leu Ala Asn220 225gcgacattgc tgtcggacag gatgatctga cgcttcagtt acgcgttctt gggtgcaccg 1208cgccacgtca ggaagtggct gctgccgcat gcaggtgaca tgtcatgtac catggcagca 1268gcacgtgaca tgcacgatgt gctcacgc1296<210>2<211>225<212>PRT
<213>腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)<400>2Met Glu Val Ala Met Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ile Tyr Pro Ser Pro1 5 10 15Pro Gln Ala Pro Arg Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr20 25 30Pro His Ile Ser Asp Asn Leu Gly Arg His Ile Gly Ala Arg Gly Leu35 40 45Thr Arg Tyr Asn His Thr Gly Lys Leu yal Gly Thr Ala Leu Thr Val50 55 60Lys Thr Arg Pro Gly Asp Asn Leu Tyr Ile Tyr Lys Ala Leu Thr Leu65 70 75 80Ile Glu Pro Gly His Val Leu Val Ile Asp Ala Gln Gly Asp Ala Thr85 90 95Asn Ala Val Ile Gly Glu Leu Ile Lys Leu Tyr Ala Gln Gln Arg Gly100 105 110Cys Val Gly Phe Val Val Asp Gly Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Phe115 120 125Glu Asp Thr Pro Cys Tyr Ala Arg Ser Val Val His Cys Gly Pro Tyr130 135 140Lys Ser Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro Val Ser Ile Gly Gly Met145 150 155 160Ile Ile Asn Pro Gly Asp Ile Ile Val Gly Asp Glu Asp Gly Leu Val165 170 175
Ala Phe Ser Pro Asp His Ala Glu Gln Val Leu Val Lys Ala Arg Glu180 185 190His Asp Ala His Glu Gln Gln Val Lys Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala195 200 205Ile Asp Gln Ser Trp Leu Asp Lys Val Leu Glu Lys Ala Gly Leu Ala210 215 220Asn225<210>3<211>221<212>PRT<213>腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)<400>3Met Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ile Tyr Pro Ser Pro Pro Gln Ala Pro1 5 10 15Arg Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser20 25 30Asp Asn Leu Gly Arg His Ile Gly Ala Arg Gly Leu Thr Arg Tyr Asn35 40 45His Thr Gly Lys Leu Val Gly Thr Ala Leu Thr Val Lys Thr Arg Pro50 55 60Gly Asp Asn Leu Tyr Ile Tyr Lys Ala Leu Thr Leu Ile Glu Pro Gly
65 70 75 80His Val Leu Val Ile Asp Ala Gln Gly Asp Ala Thr Asn Ala Val Ile85 90 95Gly Glu Leu Ile Lys Leu Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Cys Val Gly Phe100 105 110Val Val Asp Gly Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Phe Glu Asp Thr Pro115 120 125Cys Tyr Ala Arg Ser Val Val His Cys Gly Pro Tyr Lys Ser Gly Pro130 135 140Gly Glu Ile Asn Val Pro Val Ser Ile Gly Gly Met Ile Ile Asn Pro145 150 155 160Gly Asp Ile Ile Val Gly Asp Glu Asp Gly Leu Val Ala Phe Ser Pro165 170 175Asp His Ala Glu Gln Val Leu Val Lys Ala Arg Glu His Asp Ala His180 185 190Glu Gln Gln Val Lys Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala Ile Asp Gln Ser195 200 205Trp Leu Asp Lys Val Leu Glu Lys Ala Gly Leu Ala Asn210 215 220<210>4<211>20<212>PRT
<213>腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)<400>4Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser Asp1 5 10 15Asn Leu Gly Arg20<210>5<211>12<212>PRT<213>腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)<400>5Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala Leu Asp Gln Ser Trp1 5 10<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物1<400>6ttycaraayg tsgtsacscc sc 22<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物2<400>7tgrtcratng cnccsgtngc ratytcngc 29<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述ALD-5′Bam<400>8gccggatcca caagggttca gtcattcatg g31<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述ALD-5′Hind<400>9ccgaagcttt cagttcgcca ggccagcc28<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物3
<400>10gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物4<400>11ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40<210>12<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物5
<400>12ggggggggca tatgcgacct ccttattacg tgaacttg 38<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述ALD-5′Nde1<400>13ggttcagtca catatggagg tcgctatgtc 30<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述ALD-5′Nde2<400>14
atggaggtcc attagtcatt gcccggttca cgc 33<210>15<211>1176<212>DNA<213>晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)<220>
<221>CDS<222>(398)..(1141)<223>PcALD<400>15gtcgtaaccc acaccgtgct tggcaatgat cttcagattg cctgaggcct ggatcatgtc 60cttggtcagc ttgccttggc gcacgatgat cgcgtgaggt tgttcgtcgc ggattattgc 120agtcagctct tcggcgggca tgtagggcgt ggtggggatg atggtaatgc cttgagatgc 180ggcgtaggcc atcgcatcgg ctgccagttc ggggcctgtc agcaggatct tccgattcat 240gatcgatacc ttgtttttat agaggtcgtg tgcggcgtcg agaagacatc tgcacctggc 300tgaaccctac cataatgaaa tgtcgttgca atatagatga attgataatc ttgatgagtg 360gtttttattt gggtatccgc ctattgatcc tgttaaa atg aaa tgt cat tct gtt 415Met Lys Cys His Ser Val1 5att tgg ttt agt gcc tgg ccg cat cca ata att tca aga gag aaa agc 463Ile Trp Phe Ser Ala Trp Pro His Pro Ile Ile Ser Arg Glu Lys Ser
10 15 20cac atg acg atc gga ttc aga gtt ctc agt gca gcc cgc aaa gtc agc 511His Met Thr Ile Gly Phe Arg Val Leu Ser Ala Ala Arg Lys Val Ser25 30 35ccg gaa tgg gtc gcc cgc tac cgc gat gtt ccg gtg gcc aat gtc agt 559Pro Glu Trp Val Ala Arg Tyr Arg Asp Val Pro Val Ala Asn Val Ser40 45 50gac tcg atg aac cgg atg acc gct ggc ggg tcc agg ctg cgc ccc atg 607Asp Ser Met Asn Arg Met Thr Ala Gly Gly Ser Arg Leu Arg Pro Met55 60 65 70cac cgt gcg ggc gtt ctc gcc ggg ccg gcc ttg acg gtc aag gcc cgt 655His Arg Ala Gly Val Leu Ala Gly Pro Ala Leu Thr Val Lys Ala Arg75 80 85ccg ggt gac aac ctg atg ctg cat tac gct att gat att gct cag ccg 703Pro Gly Asp Asn Leu Met Leu His Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Gln Pro90 95 100ggc gac gtg att gtg gtg gat gcc ggg ggc gac ctg act aac gcg ctg 751Gly Asp Val Ile Val Val Asp Ala Gly Gly Asp Leu Thr Asn Ala Leu105 110 115att ggc gaa atg atg gtg gct tat gct gta aaa cgt ggt gtg gct ggc 799Ile Gly Glu Met Met Val Ala Tyr Ala Val Lys Arg Gly Val Ala Gly120 125 130atc gtc atc aac ggc gcc atc cgt gat gcc gcc agc atc ggt gca ggc 847Ile Val Ile Asn Gly Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ser Ile Gly Ala Gly135 140 145 150
gac ttc ccg atg ttt gca gcc ggt gta tcg cat cgg ggt cct tat aaa 895Asp Phe Pro Met Phe Ala Ala Gly Val Ser His Arg Gly Pro Tyr Lys155 160 165gac ggg cca ggc gaa atc aat gtc ccg atc gcc atc gac ggc atg gtc 943Asp Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro Ile Ala Ile Asp Gly Met Val170 175 180atc gag gcg ggg gat ctg gtg ata ggc gat gac gac ggc ttg ctg tgt 991Ile Glu Ala Gly Asp Leu Val Ile Gly Asp Asp Asp Gly Leu Leu Cys185 190 195gtc cct tac gac cag gtt gca gag gtg tat gac cgg gca gca gcc aag 1039Val Pro Tyr Asp Gln Val Ala Glu Val Tyr Asp Arg Ala Ala Ala Lys200 205 210cat cat gca gag caa aag caa ctg gag cag atc gcc aag ggc gaa aat 1087His His Ala Glu Gln Lys Gln Leu Glu Gln Ile Ala Lys Gly Glu Asn215 220 225 230gat cgc tcc tgg gta ctt gaa tca ttg aag aaa aaa ggc tgc cag ctt 1135Asp Arg Ser Trp Val Leu Glu Ser Leu Lys Lys Lys Gly Cys Gln Leu235 240 245cca gaa tgagctggtg taatcgtgcc tttcgcgcac gatct1176Pro Glu<210>16<211>248<212>PRT
<213>晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)<400>16Met Lys Cys His Ser Val Ile Trp Phe Ser Ala Trp Pro His Pro Ile1 5 10 15Ile Ser Arg Glu Lys Ser His Met Thr Ile Gly Phe Arg Val Leu Ser20 25 30Ala Ala Arg Lys Val Ser Pro Glu Trp Val Ala Arg Tyr Arg Asp Val35 40 45Pro Val Ala Asn Val Ser Asp Ser Met Asn Arg Met Thr Ala Gly Gly50 55 60Ser Arg Leu Arg Pro Met His Arg Ala Gly Val Leu Ala Gly Pro Ala65 70 75 80Leu Thr Val Lys Ala Arg Pro Gly Asp Asn Leu Met Leu His Tyr Ala85 90 95Ile Asp Ile Ala Gln Pro Gly Asp Val Ile Val Val Asp Ala Gly Gly100 105 110Asp Leu Thr Asn Ala Leu Ile Gly Glu Met Met Val Ala Tyr Ala Val115 120 125Lys Arg Gly Val Ala Gly Ile Val Ile Asn Gly Ala Ile Arg Asp Ala130 135 140Ala Ser Ile Gly Ala Gly Asp Phe Pro Met Phe Ala Ala Gly Val Ser145 150 155 160His Arg Gly Pro Tyr Lys Asp Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro Ile165 170 175
Ala Ile Asp Gly Met Val Ile Glu Ala Gly Asp Leu Val Ile Gly Asp180 185 190Asp Asp Gly Leu Leu Cys Val Pro Tyr Asp Gln Val Ala Glu Val Tyr195 200 205Asp Arg Ala Ala Ala Lys His His Ala Glu Gln Lys Gln Leu Glu Gln210 215 220Ile Ala Lys Gly Glu Asn Asp Arg Ser Trp Val Leu Glu Ser Leu Lys225 230 235 240Lys Lys Gly Cys Gln Leu Pro Glu24权利要求
1.下述(a)或(b)的DNA(a)包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的DNA；(b)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列或同一序列中碱基编号444-1118或碱基编号456-1118的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白。
2.下述(c)或(d)的DNA(c)编码包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白的DNA；(d)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
3.下述(e)或(f)的DNA(e)包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的DNA；(f)一种DNA，该DNA与包含序列表中SEQ ID No.15的核苷酸序列或同一序列中碱基编号398-1141的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白。
4.下述(g)或(h)的DNA(g)编码包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白的DNA；(h)一种编码具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白的DNA，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
5.重组DNA，其特征在于由权利要求1-4中任一项的DNA与载体DNA连接得到。
6.用权利要求5所述的重组DNA转化而成的细胞。
7.制备具有醛缩酶活性的蛋白的方法，其特征在于将权利要求6中所述细胞在培养基中进行培养，在培养基和/或细胞中累积具有醛缩酶活性的蛋白。
8.下述(i)或(j)的蛋白(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
9.下述(k)或(l)的蛋白(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
10.一种蛋白，其特征在于(A)对吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸通过羟醛缩合生成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应具有催化活性，和/或对苯基丙酮酸与丙酮酸通过羟醛缩合生成4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应具有催化活性；(B)(A)中所述活性的最佳pH在33℃约为9；且(C)通过凝胶过滤法测定的分子量约为146kDa，通过SDS-PAGE法测定的每个亚基的分子量约为25kDa。
11.一种蛋白，其特征在于(A)是具有醛缩酶活性的蛋白；(B)来自于假单胞菌属(Pseudomonas)；(C)在pH6和6以上具有pH稳定性；(D)在70℃或70℃以下具有温度稳定性；且(E)通过凝胶过滤法测定的分子量约为146kDa，通过SDS-PAGE法测定的每个亚基的分子量约为25kDa。
12.权利要求11所述的蛋白，其特征在于通过使酶反应体系中含有无机磷酸，提高上述醛缩酶活性。
13.具有醛缩酶活性的组合物，该组合物通过在培养基中培养假单胞菌属细菌，在培养基和/或细胞中累积下述(i)-(l)中任一项的蛋白，并对所述培养基和/或细胞进行纯化处理而得到(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
14.一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是通过使下述通式(1)所示取代α-酮酸与下述通式(2)所示取代α-酮酸反应，制备下述通式(3)所示取代α-酮酸的方法， 通式(1)中，R1为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R1还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代； 通式(2)中，R2为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R2还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代，但通式(1)中R1为氢、甲基或羧基甲基时，R2不为氢； 通式(3)中的R1和R2与通式(1)和(2)中的R1和R2表示相同含意；所述方法的特征在于在催化该反应的蛋白存在下进行反应。
15.权利要求14所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R2为氢或羧基。
16.权利要求15所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R2为氢。
17.权利要求14所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R1为苄基或3-吲哚基甲基，所述R2为氢或羧基。
18.一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是由吲哚-3-丙酮酸与草酰乙酸或丙酮酸制备下式(4) 所示取代α-酮酸的方法，其特征在于在催化该反应的蛋白存在下进行反应。
19.权利要求14-18中任一项所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于催化所述反应的蛋白来自于选自假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)的微生物。
20.权利要求19所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述微生物为腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、解韧带假单胞菌(Pseudomonasdesmolytica)、欧文氏菌(Erwinia sp.)、莱茵黄杆菌(Flavobacteriumrhenanum)或柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)。
21.权利要求20所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述微生物为腐臭假单胞菌ATCC4683或晕斑假单胞菌AJ2791。
22.权利要求14-21中任一项所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于催化所述反应的蛋白为下述(i)-(l)中任一项的蛋白(i)包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列的蛋白；(j)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.2的氨基酸序列或同一序列中残基编号5-225的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列；(k)包含序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列的蛋白；(l)具有下述氨基酸序列且具有醛缩酶活性的蛋白，所述氨基酸序列包含在序列表内SEQ ID No.16的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加或倒位一个或多个氨基酸残基的序列。
23.一种制备取代α-酮酸的方法，该方法是通过使下述通式(1’)所示化合物与下述通式(2’)所示取代α-酮酸反应，制备下述通式(3’)所示取代α-酮酸的方法， 通式(1’)中，R1为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R3为氢或羧基，R1还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代； 通式(2’)中，R4为氢、碳原子数1-8的烷基、碳原子数1-8的烷氧基、碳原子数2-9的羧基烷基、碳原子数最多至20的芳基或芳烷基、碳原子数最多至11的含杂环烃基、羟基或其酯衍生物，R4还可以被至少一种选自卤原子、羟基、碳原子数最多至3的烷基、碳原子数最多至3的烷氧基和氨基的取代基所取代； 通式(3’)中的R1、R3和R4与通式(1’)和(2’)中的R1、R3和R4表示相同含意；所述方法的特征在于在权利要求8或9任一项所述的蛋白存在下进行反应。
24.权利要求23所述的取代α-酮酸的制备方法，其特征在于所述R4为氢或羧基。
全文摘要
通过使用来自假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属的新型醛缩酶，可以由吲哚丙酮酸和丙酮酸(和/或草酰乙酸)合成4－(吲哚－3－基甲基)－4－羟基－2－氧代戊二酸，该4－(吲哚－3－基甲基)－4－羟基－2－氧代戊二酸可用作合成monatin的中间体。
文档编号C12P21/06GK1678742SQ03819899
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月26日 优先权日2002年8月26日
发明者杉山雅一, 渡部乙比古 申请人:味之素株式会社