专利名称：用于预防和治疗过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的含软枣猕猴桃及其相关种的提取物的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及软枣猕猴桃(Actinidia arguta)及其相关种的提取物和包含该提取物的组合物，该组合物具有预防和治疗过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的活性。
背景技术：
本发明涉及一种包含药草提取物(herb extract)的组合物，其具有抗过敏和抗炎活性，具体地说，涉及一种包含耐寒猕猴桃(hardy kiwifruit)提取物的组合物，该组合物用于预防和治疗过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
过敏性疾病，例如过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、遗传性过敏皮炎、食物过敏和风疹，在许多国家中给占人口总数20％的人群带来痛苦，并且疾病流行的程度在逐渐增加(Wuthrich B.，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，90，pp3-10，1989)。
免疫球蛋白E(IgE)介导过敏性疾病，同时已证明II型T辅助(Th2)细胞、肥大细胞和嗜曙红细胞在该过程中扮演重要的角色(Maggi E.，Immunotechnology，3，pp233-244，1998；Pawankar R.，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.，1，pp3-6，2001；Vercelli D.，Clin.Allergy Immunol.，16，pp179-196，2002)。
如果没有寄生虫感染或其它刺激物，正常地，IgE是在人类血清以及几种试验动物中均被发现的大量免疫球蛋白同种型(isotype)之一(Maggi E.，Immunotechnology，3，pp233-244，1998；Coffman RL and Carty J.，J.Immunotechnology，136，pp949-954，1986)。根据“Th2假设”，在免疫条件下可促使IgE生成，在该条件下，占优势的是由Th2细胞和例如IL-4、IL-5和IL-13的相关细胞因子介导的体液免疫(Maggi E.，Immunotechnology，3，pp233-244，1998)。关于过敏性疾病发展的现有观点是遗传和环境因素相互作用，通过在天然T细胞中Stat6介导的信号传导通道和例如c-Maf、GATA3、NIP45和NFATc的特定转录因子的活化作用，导致IL-4的生成，最终导致过敏原特异性T辅助2 CD4+细胞的生成。一旦生成，过敏原活化的Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13。IL-4和IL-5通过B细胞诱导IgE和IgG1的生成，还诱导对骨髓中嗜曙红细胞的产生并补充入发炎组织的刺激作用(Erb K.J.；Immunol.Today，20，pp317-322，1999；Rothenberg ME.，N.Engl.J.Med.，338，pp1592-1600，1998)。IL-13是与IL-4紧密联系的细胞因子，其与IL-4受体α链结合，不依赖IL-4、IgE或嗜曙红细胞而诱导过敏表现型(Wills-Karp M.，et al.，Science，282，pp2258-2261，1998；Grunig G.，et al.，Science，282，pp2261-2263，1998)。
循环IgE与IgE受体的两个异构体(isoform)结合高亲和力的IgE受体(FcεRI)出现在肥大细胞和嗜碱细胞的表面上，低亲和力的IgE受体(FcεRII或CD23)出现在淋巴细胞、嗜曙红细胞、血小板和巨噬细胞的表面。据认为，控制变应性紊乱(allergic disorder)发病机理的最重要的因素是在遇到过敏原及随之发生的肥大细胞脱粒之后，IgE受体在肥大细胞上的交叉链接。由肥大细胞释放的分子包括组胺、肝磷脂、蛋白酶和自由基，这些分子调节着各种生物效应，包括血管舒张、肠和/或支气管平滑肌收缩、粘液分泌和局部蛋白水解。在最初的肥大细胞即时反应之后6～24小时，出现嗜曙红细胞、嗜碱细胞和淋巴细胞的流入。该晚期应答能够导致持续暴露于抗原的慢性组织炎症。
用于治疗过敏性疾病的常规药物包括抗组胺剂、甾体或非甾体抗炎药和白细胞三烯拮抗剂。这些药物主要对有症状的作用有效，而不能够提供像关于过敏性疾病的基础治疗这样被需要的治疗，例如减轻过度的体液免疫或抑制IgE的生成。通过嵌合抗IgE抗体(CGP-51901)和重组人源化单克隆抗体(rhuMAB-E25)的临床试验证明了关于降低血清IgE水平可以改善过敏症状的假说(Fahy JV et al.，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.，155，pp1828-1834，1997)。在美国专利No.6,369,091和美国专利申请No.20020041885中已分别记述了抑制IgE合成和分泌的二酰基苯并咪唑类似物和细菌多糖。
用于过敏症基础治疗的唯一方法是开展免疫疗法或脱敏疗法。免疫疗法是治疗方法，其通过长期给予过敏患者剂量逐渐加大的精制过敏原，降低对过敏源的超敏性，改善过敏症状。在1911年采用免疫疗法后，其通过使用抗原特异性IgE抗体，已被用于治疗例如过敏性鼻炎、哮喘、蜜蜂中毒等的过敏性疾病。还未清楚的发现降低超敏性的主要机制，但已知的是增加IgG浓度的同时减少IgE的浓度会诱发正常的免疫反应。
软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、木天蓼(A.polygama)和狗枣猕猴桃(A.kolomikta)属于猕猴桃科，分布于西伯利亚、中国的北部地区、韩国的北部和南部。已报道属于猕猴桃科的30多个种。其中，中华猕猴桃(A.chinensis)或美味猕猴桃(A.delicious)的果实已被命名为猕猴桃(kiwi)；软枣猕猴桃及其它同属的果实可用作中药的原料，名为“mihudo”，无毒性，用以治疗肝病、胃肠疾病和泌尿生殖器结石(Seoul National University Natural ProductsScience，Tradi-Medi Data Base，dongbang media Co.Ltd.1999)。然而，尚没有关于使用猕猴桃属的果实治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的报道或暗示。
同时，已集中努力研究有效的抗过敏和抗炎的天然产品。
韩国专利申请No.92-11752公开了一种抗炎、抗过敏和抗风湿的药物，该药物包含双黄酮类化合物(biflavonoid)，例如从金银花(Lonicera japonica.)分离出来的4’-O-甲基金连木黄酮，其显示不同的过敏或炎症治疗活性。韩国专利申请No.100744公开了抗炎、抗过敏和抗风湿药物，其包含从银杏叶子中分离出来的几种双黄酮类化合物的混合物。已报道包含毛梗豨莶(Siegesbeckia glabrescens)的几个东方药处方具有减少IgE的活性(Kim H.Met al.，Phytother.Res.，15，pp572-576，2001)。此外，已发现许多药草为组胺释放抑制剂和抗炎药物的丰富来源。
然而，上述任何文献均未报道或公开关于耐寒猕猴桃的抗过敏和抗炎作用。
为了在中草药中开发抗过敏和抗炎药物，本发明的发明人已集中开展了体内和体外试验，该试验是关于耐寒猕猴桃提取物对人血清中Th1/Th2细胞因子和IgE、IgG亚型改变的作用，以及关于该提取物对从小鼠腹膜肥大细胞中释放组胺的试验和大鼠足肿胀试验的作用。
发明的公开本发明提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的有效量的耐寒猕猴桃提取物，通过减少炎症反应、抑制组胺从肥大细胞中释放、以及通过提高血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平和降低血清中Th2细胞因子和IgE的水平，来治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明还提供了上述提取物在制备治疗和预防哺乳动物或人类的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的药物组合物中的应用。
本发明还提供了一种保健食品或食品添加剂，其包含上述提取物，通过减少炎症反应，抑制组胺从肥大细胞中释放、以及通过增加血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，和减少血清中Th2细胞因子和IgE的水平，来预防或缓解过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明还提供了一种饲料或饲料添加剂，其包含上述提取物，通过减少炎症反应，抑制组胺从肥大细胞中释放，以及通过提高血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，和降低血清中Th2细胞因子和IgE的水平，来治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明还提供了一种化妆品组合物，其包含上述提取物，通过减少炎症反应，抑制组胺从肥大细胞中释放，以及通过提高血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，和降低血清中Th2细胞因子和IgE的水平，来治疗、预防和改善过敏性皮肤疾病和非过敏性炎性皮肤疾病。
因此，本发明的一个目的在于提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的耐寒猕猴桃的粗提取物(crude exact)或非极性溶剂可溶的提取物(non-polarsoluble extract)，用于治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明的一个目的在于提供耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶提取物的一种应用，其可用于制备治疗和预防人或哺乳动物的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的治疗药剂。
本发明的一个目的在于提供一种治疗或预防哺乳动物的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的方法，其包括给予所述哺乳动物治疗有效量的耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶的提取物，和药学上可接受的载体。
本发明的另一个目的在于提供一种保健食品或食品添加剂，其包含上述提取物和饮食学上可接受的添加剂，以预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明的还一个目的在于提供一种动物饲料或饲料添加剂，其包含作为治疗必要组分的提取物，用于治疗、预防和改善过敏性疾病和非过敏性皮肤炎性疾病。
本发明的还一个目的在于提供一种化妆品组合物，其包含上述提取物，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
上述过敏性疾病或过敏性皮肤疾病包括过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、特异性皮炎、传染性皮炎、风疹、昆虫过敏、食物过敏和药物过敏。
上述非过敏性皮肤炎性疾病包括由例如丘疹、痤疮等引起的各种皮肤疾患。
上述化妆品组合物，其包含耐寒猕猴桃提取物，具有对皮肤炎症的预防和改善活性。
上述药物组合物，其用于过敏性疾病的治疗和预防，可以被用于提高过敏免疫疗法功效的目的。
因此，本发明还提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶的提取物，用于过敏免疫疗法的辅助治疗。
同时，本发明还提供了一种药物组合物，其包含有效量的耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶的提取物，用于治疗和预防非过敏性炎性疾病。
上述非过敏性炎性疾病包括各种皮炎、全身性红斑狼疮(SLE)、视网膜炎症、胃炎、视网膜病、肝炎、肠炎、胰腺炎、肾炎等等。
上述耐寒猕猴桃可以包括软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃、木天蓼或/和相同属的植物，可以使用其果实、茎、根。
可以通过使用水、例如甲醇、乙醇等的低级醇、或它们的混合物，获得上述耐寒猕猴桃的粗提取物，优选的，获得蒸馏水或70％醇可溶的提取物；可以通过使用非极性溶剂，例如己烷、乙酸乙酯或二氯甲烷溶剂，获得上述非极性溶剂可溶的提取物。
基于组合物的总重量，本发明的药物组合物可以包含以重量计，约0.01到50％的上述提取物。
基于组合物的总重量，本发明的保健食品包含以重量计，0.01到80％的上述提取物，优选1到50％。
可以将上述保健食品包含在保健食品、保健饮料等中，而且可以将其用作为粉剂、颗粒剂、片剂、咀嚼片，胶囊，饮料等使用。
可以按照下述优选实施方式从耐寒猕猴桃制备一种本发明的提取物。
以下，详细描述本发明。
可以按照下述步骤详细制备本发明的耐寒猕猴桃提取物。
可以按照下述方法制备本发明的耐寒猕猴桃粗提取物；干燥并粉碎耐寒猕猴桃；将粉碎的耐寒猕猴桃与5到25倍，优选的，大约10倍体积的蒸馏水、例如甲醇、乙醇、丁醇等的低级醇、或它们的混合物相混合，优选的，为水或70％乙醇；将该溶液用温度范围为20到100℃的热水处理，优选的，为60到100℃，周期范围为1到24小时，通过用热水、冷水、回流提取或超声波降解提取的提取方法，连续提取1到5次，优选2到3次；过滤渣滓以获得上清液，在20到100℃的温度范围内用旋转蒸发仪浓缩，优选为50到70℃；然后用真空冷冻干燥、热空气干燥或喷雾干燥进行干燥以获得耐寒猕猴桃的干燥粗提取物粉末，其可溶于水、低级醇、或它们的混合物。
在-20℃贮存上述耐寒猕猴桃的粗提取物，通过溶入蒸馏水中调节至一定浓度，作为样品来使用。
另外，可以通过下述步骤制备本发明的非极性溶剂可溶的提取物；将通过上述步骤制备的粗提取物混悬于水中，然后与1到100倍，优选1到5倍体积的非极性溶剂，例如乙酸乙酯、氯仿、己烷等混合，收集非极性溶剂可溶层，以获得本发明的非极性溶剂可溶的提取物。
并且，可以根据本技术领域熟知的方法，例如，在文献(Harbome J.B.，A guide to modern techniques of plant analysis，3rd Ed.pp6-7，1998)中公开的方法，修改上述步骤，或附加进一步的分部分离(fractionate)或分离(isolate)步骤，以获得更有效的部分或化合物。
为了研究通过上述步骤制备的耐寒猕猴桃提取物的抗过敏和抗炎活性，开展了体内和体外试验，例如测定血清中Th1/Th2细胞因子和IgE、IgG亚型的水平的ELISA方法，检验本发明提取物作用的从肥大细胞中释放组胺的抑制试验和抗炎化验，然后证实本发明的提取物表现出极好的抗过敏和抗炎效果。
明确的，过敏原特异性IgE的减少和过敏原特异性IgG2a的增加一直为免疫治疗领域的主要目的和目前唯一的过敏性疾病的基础治疗，因此，通过上述试验，证明了如果将耐寒猕猴桃作为过敏免疫疗法的辅助手段用于免疫治疗，它可以提高治疗功效。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含按照上述制备方法制备的耐寒猕猴桃提取物，该提取物作为活性成分可用于治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本发明的另一方面是提供一种治疗和预防方法，其包括对包括人类在内的哺乳动物的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病给予一种药物组合物，其包含通过上述制备方法制备的提取物。
基于该组合物的总重量，用于治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的组合物可以包含以重量计，0.01～50％的上述提取物。
另外，按照本技术领域熟知的常用方法，本发明的提取物可以包含常规的载体、辅剂或稀释剂。
以下，下述制剂方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝不是限制本发明。
可以将根据本发明的组合物提供为药物组合物，其包含药学上可接受的载体、辅剂或稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、白明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚烯吡酮、水、甲羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙羟基苯甲酸酯(propylhydroxy benzoate)、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，所述制剂可包含填充剂、分散剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等等。可以通过使用本技术领域熟知的任何方法制备本发明的组合物，以便在将其给予患者后，提供活性成分的速释、缓释或延迟释放。
例如，可以将本发明的组合物溶入油类、丙二醇或其它通常使用的溶剂中以制备注射剂。载体的合适例子包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、豆蔻酸异丙酯等等，但并不限于它们。对于透皮给药，可以将本发明的组合物制备成软膏剂和乳膏剂的形式。
可以将包含本发明组合物的药物制剂制备成任何形式，例如口服药物剂型(粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水溶液剂、糖浆剂、酏剂、丸剂、粉末剂、香粉、颗粒剂)，或局部给药制剂(乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶、香膏、片、糊、喷雾液、气溶胶等等)，或可注射制剂(溶液、悬浮液、乳剂)。
在药物剂型中，本发明的组合物可以被以它们的药学上可接受的盐形式使用，也可以被单独或以适当的结合方式使用，还可以与其它药用活性化合物结合使用。
本发明提取物或组合物的合适剂量的改变取决于患者的病情和体重、严重程度、药物剂型、给药途径和疗程，本领域的技术人员可以选择该合适的剂量。然而，为了取得令人满意的效果，通常建议给予的剂量范围为以重量/天计，10g/kg以内的本发明提取物或化合物，优选的，为1到3g/kg。该剂量可以每天给予一次，也可以分成每天几次给予。至于组合物，基于组合物的总重量，本发明提取物的量应当为以重量计，0.01到95％之间，优选的，为0.5到80％。
可以通过不同的途径，将本发明的药物组合物给予例如哺乳动物(大鼠、小鼠、家畜或人类)的受试动物。所有的给药方式均是预期的，例如，可以通过口腔、直肠给药或通过静脉内、肌内、皮下、皮内、膜内、硬膜外或侧脑室注射(intracerebroventricular injection)给药。
同时，本发明提供了一种用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的保健食品饮料组合物，其添加以重量计0.01到20％的耐寒猕猴桃、以重量计0.001到5％的氨基酸、以重量计0.001到2％的维生素、以重量计0.001到20％的糖、以重量计0.001到10％的有机酸、适量的甜味剂和调味剂。
上述耐寒猕猴桃的提取物可以被添加在食品和饮料中，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
为了开发保健食品，举例来说，包含上述本发明提取物的可添加食品的例子为各种食品、饮料、口香糖、维生素复合剂、健康改善食品(healthimproving food)等等，可被作为粉末、颗粒、片剂、咀嚼片、胶囊和饮料等来使用。
同时，通过包含在儿童和婴儿食品，例如改良奶粉、用于生长阶段的改良奶粉、用于生长阶段的改良食品中，本发明的提取物将能够预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
可以将上述组合物添加到食品、添加剂或饮料中。其中，在食品或饮料中，对于保健食品组合物，上述提取物的量通常可以在食品总重量的约0.1到95w/w％的范围内，优选食品总重量的1到80w/w％；每100ml保健饮料组合物中，上述组合物的量通常可以在1到30g的范围内，优选3到10g。
如果本发明的保健饮料组合物包含在所需比例之内的作为必要组分的上述提取物，则其没有特别限定其它液体组分，其中，其它组分可以为各种除臭剂或天然碳水化合物等，例如常规饮料。前述天然碳水化合物的例子为单糖，例如葡萄糖、果糖等；双糖，例如麦芽糖、蔗糖等；常规糖(conventionalsugar)，例如糊精、环糊精；以及糖醇，例如木糖醇、赤藓醇等等。作为除了前述除臭剂以外的其它除臭剂，例如taumatin的天然除臭剂，例如levaudiosideA、甘草甜素等的甜叶菊提取物，例如糖精、天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯等的合成除臭剂，可以是很好用的。在每100ml本发明的饮料组合物中，上述天然碳水化合物的量通常在大约1到20克的范围内，优选5到12g。
除了上述组分外的其它组分是多种营养剂、维生素、矿物质或电解质、合成调味剂、用于干酪巧克力等的着色剂和改良剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质粘合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳化剂等等。除了上述提及的组分外的其它组分可以是用于制备天然果汁的果汁、果汁饮料和蔬菜饮料，其中可以单独应用或联合应用该组分。该组分的比例不是这么重要的，但是每100w/w％本发明的组合物中，其范围通常是大约从0到20w/w％。其中包含上述提取物的可添加食品的例子为各种食品、饮料、口香糖、维生素复合剂、健康改善食品等等。
另外，本发明的组合物可以包含一种或一种以上的有机酸，例如柠檬酸、反丁烯二酸、己二酸、乳酸、苹果酸；磷酸盐，例如磷酸酯(phosphate)、磷酸钠、磷酸钾、磷酸、聚磷酸盐；天然抗氧剂，例如多酚、儿茶素、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等。
耐寒猕猴桃的上述提取物可以是20到90％的高浓缩液体、粉末或颗粒。
相似的，另外，耐寒猕猴桃的上述提取物可以包含一种或一种以上的乳糖、干酪素、葡萄糖、右旋糖、蔗糖和山梨醇。
同样，在本发明中，还提供了一种食品添加剂的应用方法，食品添加剂为例如杀菌剂、香料、调味料、多种营养剂、维生素、矿物质或电介质、合成调味剂、用于干酪巧克力等的着色剂和改良剂，果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质粘合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳化剂等；或例如作为食品原料的必要组分。
其中，可以通过沉积、喷雾或混合将食品添加剂添加入到食品中。添加剂的比例不是这么重要的，但是在每100w/w％本组合物中，添加剂的含量通常在约0.01到20w/w％的范围内。包含上述提取物的可添加食品的例子如上所述。
其中，可以将食品添加剂添加到一种或一种以上的食品中，例如水果、蔬菜、食物脱水食品或例如水果、蔬菜的切片产品(cutting product)；水果汁、蔬菜汁或它们的混合汁；包含酸性饮料的饮料；甜食，例如小甜饼、冰糖、饴糖、口香糖；面包；冰淇淋、茶、例如酵母乳的发酵牛奶；乳制品、调味品，酒精饮料、罐头、瓶装食品(in-bottles)、面条、加工畜产品、加工海产品、发酵食品、豆类食品、谷类食品、加工肉类、甘草或果皮。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种饲料或饲料添加剂，其本质上包含通过上述制备方法制备的所述提取物，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性疾病。
基于饲料的总干重，上述食品添加剂的特征为以重量计每千克干饲料中的混合量为5到100g。
此外，本发明提供了一种包含上述饲料添加剂的饲料组合物。
同时，本发明也提供了一种包含有效量的耐寒猕猴桃粗提取物或非极性溶剂可溶提取物的化妆品组合物，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
本化妆品组合物提供了包含基于组合物的总重量，以重量计0.01到30％上述提取物的化妆品组合物，优选的，为0.01到5％，用于治疗、预防和改善过敏性皮肤疾病和非过敏性皮肤炎性疾病。
其它组分可以是本领域熟知的常规化妆品组合物的成分的混合物。
可以将包含上述组合物的化妆品制剂制备成任何形式，例如护肤品、外用化妆液、乳膏、香精、收缩水、乳液、面膜、胶浆(soup)、洗发精、染发水、洁面乳、沐浴液(body washing solution)、洗涤液、护理品、凝胶、芳香制剂、喷雾液，等等。
本发明的化妆品组合物可以包含补充添加剂，其选自水溶性维生素、脂溶性维生素、肽聚合物、多糖聚合物、神经鞘脂类和海草提取物。
优选的水溶性维生素是任何可以与化妆品混合的维生素，然而，优选下列多种维生素，例如维生素B1、B2、B6、吡哆醇、盐酸吡哆醇、维生素B12、泛酸、烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素C、维生素H等；及它们的盐，例如硫胺素盐酸盐、抗坏血酸钠盐等或它们的衍生物，例如抗坏血酸-2-膦酸的钠盐、抗坏血酸-2-膦酸的镁盐。通过常规方法，例如微生物转化法、从微生物培养物中纯化的方法、酶催法或化学合成方法，能够获得上述维生素。
优选的脂溶性维生素是任何可以与化妆品混合的维生素，然而，更优选下列包含在本发明实施例中的多种脂溶性维生素，例如维生素A、D2、D3、E(dl-α-生育酚、d-α-生育酚、d-δ-生育酚)及其衍生物，例如棕榈酸抗坏血酸(palmiticacid ascorbate)、硬脂酸抗坏血酸、二棕榈酸抗坏血酸、乙酸-dl-α-生育酚、烟酸dl-α-生育酚维生素E、dl-泛酰醇、泛酰乙醚等。通过常规方法例如微生物转化法、从微生物培养物中纯化的方法、酶催法或化学合成法，能够得到上述维生素。
优选的肽聚合物是任何可以与化妆品混合的肽聚合物，然而，更优选包含在本发明实施例中的肽聚合物，如胶原质、水解胶原质、白明胶、弹性蛋白、水解白明胶、角蛋白等。
优选的多糖聚合物是任何可以与化妆品混合的多糖聚合物，然而，更优选羟乙基纤维素、黄原胶、透明质酸钠、硫酸软骨素或它们的盐(钠盐等)等等。例如，从哺乳动物或鱼中，可以通过正常的纯化得到硫酸软骨素及其盐等。
优选的神经鞘脂类是任何可以与化妆品混合的鞘脂类，然而，优选神经酰胺、鞘氨醇(sphingosin)、鞘脂多糖(sphingo-lipopolysaccharide)，等等。从哺乳动物、鱼类、甲壳类动物、酵母或植物等中采用常规方法可以得到鞘脂类。
优选的海草提取物是任何可以与化妆品混合的海草提取物，然而，优选褐藻类、红藻类、绿藻类等的提取物或纯化角藻胶、藻酸、及从其分离出的精氨酸(arginic acid)钠、精氨酸钾。从海草中采用常规方法可以纯化得到藻类提取物。
如果必要，本发明的化妆品组合物可以连同上述必要成分，与同常规化妆品组合物相联系的其它成分联合使用。
优选的上述其它成分可以包括油类成分、湿润剂、润滑剂、表面活性剂、有机或无机染料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧剂、植物提取物、pH调节剂、醇类、色素、香料、清凉剂、血液循环促进剂、止汗剂、蒸馏水等。
优选的油类成分可以包括酯油、烃油、硅油、氟化油、动物油、植物油等等。
优选的上述酯油可以包括甘油基三-2-乙基己酸，鲸蜡基2-乙基己酸、异丙基肉豆蔻酸、丁基肉豆蔻酸、异丙基棕榈酸、乙基硬脂酸、辛基棕榈酸、异鲸蜡基异硬脂酸、丁基硬脂酸、乙基亚油酸、异丙基亚油酸、乙基油酸、异鲸蜡基肉豆蔻酸、异硬脂酰肉豆蔻酸、异硬脂酰棕榈酸、辛十二基肉豆蔻酸、异鲸蜡基异硬脂酸、二乙基癸二酸(diethyl sebacic acid)、异丙基己二酸、异烷基新戊酸(isoalkyl neopetanoic acid)、甘油基三(癸酰、癸酸)、三甲基丙烷三-2-乙基己酸、三甲基丙烷三异硬脂酸、季戊四醇四-2乙基己酸、鲸蜡基辛酸、癸基月桂酸、己基月桂酸、癸基肉豆蔻酸、肉豆蔻酰肉豆蔻酸、鲸蜡基肉豆蔻酸、硬脂酰硬脂酸、癸基油酸、鲸蜡基亚油酸(cetyl licinoleic acid)、异硬脂酰月桂酸、异三癸基肉豆蔻酸、异鲸蜡基棕榈酸、辛基硬脂酸、异鲸蜡基硬脂酸、异癸基油酸、辛十二基油酸、辛十二基亚油酸、异丙基异硬脂酸、十六十八混合醇2-乙基己酸(cetostearyl 2-ethyl hexanoic acid)、硬脂酰2-乙基己酸、己基异硬脂酸、乙二醇二辛酸、乙二醇二油酸、丙二醇二癸酸、丙二醇二(癸酰、癸酸)、丙二醇二辛酸、新戊二醇二癸酸、新戊二醇二辛酸、甘油三辛酸、甘油三十一酸、甘油三异棕榈酸、甘油三异硬脂酸、辛十二烷基新戊酸、异硬脂酰辛酸、辛基异壬酸、己基癸基新癸酸、辛基十二烷基新癸酸、异十六烷基异硬脂酸、异硬脂酰异硬脂酸、辛癸基异硬脂酸、聚甘油石竹酸酯、聚甘油异硬脂酸酯、三异鲸蜡基柠檬酸、三异烷基柠檬酸、三异辛基柠檬酸、月桂基乳酸、十四基乳酸、十六基乳酸、辛癸基乳酸、三乙基乳酸、乙酰基三乙基柠檬酸、乙酰基三丁基柠檬酸、三辛基柠檬酸、双异硬脂酰马来酸、双2-乙己基羟基硬脂酸、2-乙己基琥珀酸、双异丁基己二酸、双异丙基癸二酸、二辛基癸二酸、胆甾醇基硬脂酸、胆甾醇基异硬脂酸、胆甾醇羟基硬脂酸、胆甾醇羟基硬脂酸、胆甾醇基油酸、二氢胆甾醇基油酸、硬脂酰异硬脂酸、硬脂酰油酸、鲸蜡基12-硬脂酰羟基硬脂酸、硬脂酰基12-硬脂酰羟基硬脂酸、异硬脂酰基12-硬脂酰羟基硬脂酸。
优选的上述烃油可以包括角鲨烯、液体石蜡、α-烯烃低聚物、石蜡、液体异链烷烃、地蜡、石蜡、液体异链烷烃、聚丁烯、微晶蜡、凡士林，等等。
优选的硅油可以包括聚甲基硅酮、甲苯基硅酮、甲基环聚硅氧烷、八甲基聚硅氧烷，十甲基聚硅氧烷，十二甲基环硅氧烷，二甲基硅氧烷-甲基十六基氧化硅氧烷共聚物，二甲基硅氧烷-甲基硬脂酰环氧乙烷(dimethyl siloxane-methylstearoxyloxane)共聚物，烷基改性硅油，氨基改性硅油等等。
优选的氟化油可以包括全氟代聚醚(perfluoropolyether)，等等。
优选的动物油或植物油可以包括鳄梨油、杏仁油、橄榄油、芝麻油、米壳油、红花油、豆油、玉米油、菜油、扁桃苷油、棕榈仁油、棕榈油、蓖麻油、向日葵油、果实种子油、棉籽油、棕榈油、椰子油、小麦胚芽油、稻米胚芽油、牛油果油、月见草油、澳大利亚坚果油(macadamia nut oil)、medo home oil、蛋黄油、羊毛脂、大麻籽油、貂油、奶油、orange roughy oil、霍霍巴油(jojoba oil)、液体羊毛脂、氢化蓖麻油，等等。
优选的保湿剂可以包括水溶性低分子保湿剂，亲脂性低分子保湿剂、水溶性聚合物和脂溶性聚合物。
特别是，优选的水溶性低分子保湿剂可以包括2-羟软木三萜酮、谷氨酰胺、山梨醇、甘露醇、吡咯烷酮-羧酸钠、丙三醇、丙二醇、1，3-丁二醇、乙二醇、聚乙二醇(聚合指数＞2)、聚丙二醇(聚合指数＞2)、乳酸、乳酸盐等等。
优选的脂溶性低分子保湿剂可以包括胆固醇、胆甾醇酯等等。
优选的水溶性聚合物可以包括羧乙烯基聚合物、聚天门冬氨酸盐、黄蓍胶、黄原胶、HMC(羟甲基纤维素)、HEC(羟乙基纤维素)、HPC(羟丙基纤维素)、羧甲基纤维素、水溶性甲壳质、壳聚糖、糊精等等。
优选的脂溶性聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮-二十碳烯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮-十六碳烯共聚物、硝化纤维、糊精脂肪酸酯、硅酮聚合物等等。
优选的润滑剂可以包括长链酰基谷氨酸胆甾醇酯、胆甾醇羟基硬脂酸、12-羟基硬脂酸、松香酸、羊毛脂脂肪酸胆甾醇酯等等。
优选的表面活性剂可以包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂(ambivalent surfactant)、等等。
特别是，优选的非离子表面活性剂可以包括自乳化单硬脂酸甘油、丙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯(POE)山梨糖醇酐脂肪酸酯、POE脱水山梨醇脂肪酸酯、POE甘油脂肪酸酯、POE烷基醚、POE脂肪酸酯、POE氢化蓖麻油、POE蓖麻油、POE-POP共聚物、POE-POP烷基醚、聚醚改性硅酮、月桂酸链烷醇胺、烷基氧化胺、加氢大豆磷脂等等。
优选的阴离子表面活性剂可以包括脂肪酸皂、α-酰基磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基烯丙基磺酸(alkyl ally sulfonic acid)、烷基萘磺酸盐、烷基磺酸盐、POE烷基醚硫酸盐、烷基酰胺硫酸盐、烷基磷酸盐、POE烷基磷酸盐、烷基酰胺磷酸盐、烷酰基烷基牛磺酸盐(alkyloylalkyl taurine salt)、N-酰基氨基酸盐、POE烷基醚羧酸盐、烷磺基琥珀酸盐、烷磺基乙酸盐、酰化可水解的胶原肽盐、全氟代烷基磷酸酯，等等。
优选的阳离子表面活性剂可以包括烷基三甲基氯化铵、硬脂酰三甲基氯化铵、硬脂酰三甲基溴化铵、硬脂酰三甲基氯化铵(stearyltrimethyl ammoniumchloride)、二硬脂酰二甲基氯化铵、硬脂酰二甲苄基氯化铵、二十二烷基三甲基溴化铵(behenyltrimethyl ammonium bromide)、洁尔灭、二乙胺基乙酰胺硬脂酸、二甲胺基丙酰胺硬脂酸、羊毛脂衍生物季铵，等等。
优选的两性离子表面活性剂可以包括羧基甜菜碱型、酰胺甜菜碱(amidebetaine)型、羟基磺基甜菜碱型、磷酸甜菜碱(phosphpbetaine)型、氨基羧酸、咪唑啉衍生物型、氨基胺型(amide amine type)，等等。
优选的有机和无机染料可以包括作为无机染料的无机硅酸、无水硅酸、硅酸镁、滑石、绢云母、云母、高岭土、三氧化二铁、粘土(clay)、膨润土(bentonite)、钛薄膜云母(titan film mica)、氧化氯铋、氧化锆、氧化镁、氧化锌、氧化钛、氧化铝、硫酸钙、硫酸钡、硫酸镁、碳酸钙、碳酸镁、氧化亚铁，三氧化二铬、氢氧化铬、炉甘石、炭黑和它们的复合物；作为有机染料的聚酰胺、聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、乙烯基树脂、尿素树脂、石炭酸树脂、氟化树脂、硅树脂、丙烯基树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、聚碳酸酯树脂、二乙烯苯-苯乙烯共聚物、丝粉(silk powder)、纤维素、CI色素黄、CI色素橙，和它们的复合物等等。
优选的有机粉末可以包括金属皂，例如硬脂酸钙；烷基金属膦酸盐，例如棕榈酸钠锌、月桂酸锌、月桂酸钙；酰基氨基酸多价金属盐，例如N-月桂酰-β-丙氨酸钙、N-月桂酰-β-丙氨酸锌、N-月桂酰-甘氨酸钙等等；氨基磺酸多价金属盐，例如N-月桂酰-氨基乙磺酸钙、N-棕榈酰-氨基乙磺酸钙；N-酰基碱性氨基酸，例如Nε-月桂酰-L-赖氨酸、Nε-棕榈酰-赖氨酸、Nα-棕榈酰-钨胺酸、Nα-月桂酰精氨酸、硬化羊毛脂脂肪酸酰基精氨酸等等；N-酰基多肽，例如N-月桂酰甘氨酰甘氨酸；α-氨基脂肪酸，例如α-氨基辛酸、α-氨基月桂酸等等；聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、二乙烯基苯-苯乙烯共聚物、四氟乙烯等等。
优选的紫外线吸收剂可以包括对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸戊酯、对氨基苯甲酸辛酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酸苯酯、水杨酸辛酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁苯酯、水杨酸高夢(homomentyl)酯、苄基肉桂酸、对甲氧基2-乙氧基乙基肉桂酸、对甲氧基辛基肉桂酸、二对甲氧基单-2-乙基己烷甘油基肉桂酸、对甲氧基异丙基肉桂酸、二异丙基-肉桂酸二异丙酯混合物、咪唑丙烯酸、乙基咪唑丙烯酸、羟甲氧基二苯甲酮、羟甲氧基二苯甲酮磺酸及其盐、二羟基甲氧基二苯甲酮、二羟基甲氧基二苯甲酮二磺酸钠、二羟基二苯甲酮、四羟基二苯甲酮、4-特丁基-4’-甲氧基连苯酰甲烷、2，4，6-三苯胺-p-(碳羧-2’-乙己基-1’-氧代)-1，3，5-三氮杂苯、2-(2-羟基-5-甲苯基)苯并三唑，等等。
优选的防腐剂可以包括扁柏酚、三氯酸、三氯对羟基联苯醚、双氯苯双胍己烷葡萄糖酸盐、苯氧乙醇、间苯二酚、异丙基甲酚、甘菊环烃、水杨酸、吡咯硫酮锌(zinc pirythione)、盐酸苯甲烷铵(benzalkonium HCl)、光敏剂301、单硝基愈创木酚钠、十一碳烯酸等等。
优选的抗氧剂可以包括特丁4羟基大茴香醚、没食子酸丙酯、山梨酸，等等。
优选的pH调节剂可以包括柠檬酸、柠檬酸钠、苹果酸、苹果酸钠、反丁烯二酸、反丁烯二酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠等等。
优选的醇类可以包括鲸蜡醇等。
此外，在本发明的目的和效果的范围内不限制可添加入上述组分的其它成分及其量，然而，优选的，在整个组合物中，其它成分的量在0.01至5％的范围内，更优选的，为0.01到3％。
本发明的化妆品组合物可以被调配为溶液、乳浊液、粘性混合物等等。
可以通过在文献中公开的常规方法得到(Matsumoto Mithio，Manual for thedevelopment of transdermal applied preparation.Seisi Press，1st Ed.，1985)上述成分，例如水溶性维生素、脂溶性维生素、肽聚合物、多糖聚合物、鞘脂类、海草提取物和可添加的成分，如果必须，可以将它们添加到上述其它成分中。
另外，本发明也提供了一种化妆品添加剂，其包含上述作为必要组分的提取物，用于过敏性疾病和非过敏性疾病的预防或改善。
上述化妆品添加剂可以用于添加到现有的化妆品和洗涤液中，以预防、改善或治疗过敏性疾病和非过敏性皮肤疾病。
此外，可以将上述化妆品添加剂用于乳膏、外用化妆液、按摩面膜(messagepack)、沐浴液、胶浆、洗发精等等。
因此，本发明的提取物没有毒性和副作用；其可以被安全的使用。
在本发明的组合物、应用和制备之内，可以作各种修改和变更，而不会偏离本发明的精神或范围，这对于本领域技术人员将是显而易见的。
在下面的实施例中将更明确的解释本发明。然而，应该理解的是，这些实施例并不会以任何方式限制本发明。
附图的简要说明从下述与附图相结合的详细描述中，可以更清楚的理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中
图1a为耐寒猕猴桃的提取物和部分的TLC照片；图1b为[1]亚部分的2D-TLC照片；图1c为[2]亚部分的2D-TLC照片；图2a为关于皮肤搔痒症状的结果，其是在给予具有遗传性过敏皮炎的Nc/Nga小鼠耐寒猕猴桃提取物后12周进行调查的；图2b为关于皮肤搔痒症状的结果，其是在给予具有遗传性过敏皮炎的Nc/Nga小鼠耐寒猕猴桃提取物后14周进行调查的。
实现本发明的最佳方式下面的实施例和实验例是为了进一步阐明本发明，而并非限制其范围。
实施例1耐寒猕猴桃提取物的制备1-1耐寒猕猴桃水提取物的制备分别取100g干燥耐寒猕猴桃和耐寒猕猴桃(软枣猕猴桃)的干燥茎、狗枣猕猴桃和木天蓼的干燥果实(购于汉城的Kyung-dong市场)，粉碎、与1升蒸馏水混合，在90～95℃回流提取3个小时，共三次，用滤纸过滤提取物，在55～65℃用旋转蒸发仪(N-1000，Eyela Co.Japan)减压浓缩，用冷冻干燥机干燥，获得15.6g的干燥果实提取物、10.4g的干燥猕猴桃茎(软枣猕猴桃)提取物、16.2g的干燥狗枣猕猴桃果实提取物和17.0g的干燥木天蓼果实提取物。将该干燥粉末溶于蒸馏水中(100mg/ml)。
1-2耐寒猕猴桃水-醇可溶的提取物的制备除了使用不同比例的水-醇溶剂混合物，例如30％、50％和70％乙醇溶剂作为提取溶剂外，所有步骤均与实施例1-1相同。结果，在溶剂混合物的每个配比下，得到11g～13g的耐寒猕猴桃干燥粉末，将该干燥粉末溶于蒸馏水中(100mg/ml)。
实施例2极性溶剂和非极性溶剂可溶的耐寒猕猴桃提取物的制备通过下述步骤分部分离实施例1-1中制备的水提取物。
2-1氯仿可溶部分(fraction)的制备在分液漏斗中，向5g在实施例2-1中得到的耐寒猕猴桃提取物中加入50ml蒸馏水，再向其中加入50ml氯仿，剧烈摇动，分成氯仿可溶层和水可溶层。
2-2乙酸乙酯可溶的部分的制备将上述在实施例2-1中得到的水可溶层与50ml乙酸乙酯混合，然后分成乙酸乙酯可溶层和水可溶层。
用旋转蒸发仪浓缩上述氯仿可溶层、乙酸乙酯可溶层和水可溶层，用冷冻干燥机干燥，分别得到0.34g氯仿可溶部分的粉末、0.05g乙酸乙酯可溶部分的粉末和4.61g水可溶部分的粉末。
实施例3用硅胶柱色谱法对耐寒猕猴桃提取物的分部分离将2,784mg实施例2-2中的乙酸乙酯可溶部分进一步通过硅胶色谱柱(Daiso gel IR-60-W-4063mm)。展开剂以氯仿∶甲醇∶水([1]90∶11∶1，[2]60∶10∶1，[3]60∶20∶2)溶剂混合物开始，以甲醇[4]结束，洗脱速度为300ml/hr，得到四个亚部分([1]2，381mg，[2]135mg，[3]148mg，[4]98mg)。
上述水提取物、乙酸乙酯可溶部分和四个亚部分均经由TLC(TLC板Merck Co.Ltd.，展开剂氯仿∶甲醇∶水＝9∶5∶1)，其结果见图1a。如图1a所示，流道(lane)1是水提取物，流道2是乙酸乙酯可溶部分，流道3是[4]亚部分，流道4是[3]亚部分，流道5是[2]次亚部分，流道6是[1]亚部分。
上述[1]和[2]亚部分经由2D-TLC，使用氯仿∶甲醇∶水(9∶5∶1)溶剂混合物作为第一展开剂，氯仿∶丙酮∶水(3∶8∶0.5)溶剂混合物作为第二展开剂(见图1b和图1c)。
实验实施例1耐寒猕猴桃提取物对U266B1细胞系中IgE生成的抑制作用1-1耐寒猕猴桃提取物对IgE生成的作用为了确认耐寒猕猴桃提取物对IgE生成的抑制作用，使用了U266B1细胞(成淋巴细胞瘤细胞系)。U266B1是人类B细胞的细胞系，其产生IgE。
在37℃，5％CO2环境下，在含RPMI-1640培养基(15％FBS，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1mM丙酮酸钠，50μg链霉素和100U/ml青霉素)的24孔培养板中，培养U266B1细胞(美国典型培养物收藏中心，ATCC，马纳萨斯，VA)。将细胞调整为浓度2×105个细胞/孔，并用脂多糖(LPS，2μg/ml)和100μg/ml在实施例1-1和1-2中制备的耐寒猕猴桃提取物处理。对照用2μM地塞米松或培养基(RPMI-1640)处理。处理后，将细胞培养7天，用ELISA kit(PharMingen；San Diego，CA)测量培养基中IgE的浓度。
如表1所示，耐寒猕猴桃、狗枣猕猴桃和木天蓼的所有水提取物对IgE的生成表现出与地塞米松(对照)同样的抑制作用。同时，耐寒猕猴桃的70％乙醇提取物在所有三种发明的耐寒猕猴桃醇提取物中表现出最强的活性。耐寒猕猴桃茎提取物表现出与上述那些耐寒猕猴桃提取物相似的作用。
表1
1-2耐寒猕猴桃的乙酸乙酯可溶部分对IgE生成的作用为了比较对U266B1细胞中IgE生成的抑制作用，将在上述实施例2中制备的氯仿可溶部分、乙酸乙酯可溶部分和水可溶部分，经由在上述实验实施例1-1中公开的相同实验进行处理。
用氯仿可溶部分、乙酸乙酯可溶部分和水可溶部分处理U266B1细胞系(以30μg/ml)。
如表2所示，乙酸乙酯部分对IgE的生成表现出比地塞米松(对照)更强的抑制作用。
表2
1-3硅胶柱色谱部分对IgE生成的作用将在实施例3制备的硅胶柱色谱部分[1]、[2]、[3]和[4]经由与实验实施例1-1相同的实验处理，以比较对U266B1细胞中IgE生成的抑制作用。
用硅胶柱色谱部分[1]、[2]、[3]和[4]处理U266B1细胞系(以10μg/ml)。
作为表3的结果，硅胶柱色谱部分[1]、[2]表现出对IgE生成的抑制活性。
表3
实验实施例2耐寒猕猴桃提取物在卵清蛋白致敏小鼠模型中的抗过敏作用2-1卵清蛋白致敏小鼠模型的建立卵清蛋白致敏的小鼠模型通常被用作过敏症的动物模型。雌性BALB/c小鼠，6个星期大(汉城大学动物实验中心)，适应环境7天。在出生后7个星期时，将100μl乳液注射入小鼠的腹腔中，该乳液是将25μg卵清蛋白(鸡卵白蛋白，未加工级V，Sigma Co.，Ltd.)与2.25mg氢氧化铝(ImujectAlum，Pierce Co.，Ltd.)混合，14天后，为了加速模型的形成再次注射该乳液。
然后，将30只小鼠分成3组，每组分别口服实施例1-1的耐寒猕猴桃水提取物(300μg/小鼠/天)，地塞米松(10μg/小鼠/天)，或饮用水(100μg/小鼠/天)，共11天。在第25天时，处死小鼠，收集血清和脾。
2-2血清中卵清蛋白特异性IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b的浓度分析在实施例2-1收集的血清中，应用酶联免疫(ELISA)试剂盒(PharMingen Co.，Ltd)检测卵清蛋白特异性IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b的血清浓度。
如表4所示，它表明每个卵清蛋白致敏小鼠的抗体相对于正常小鼠抗体的相对浓度。在给予耐寒猕猴桃水提取物的小鼠中，卵清蛋白特异性IgE水平降低到1/3之下，IgG1的水平显著降低。在给予地塞米松的小鼠中，IgE和IgG1的水平具有相似的降低。
与细胞免疫性联系的IgG2a水平，在给予耐寒猕猴桃水提取物的小鼠中提高超过两倍，然而，在给予地塞米松的小鼠中并没有增加。
这表明耐寒猕猴桃提取物通过减少诱导过敏症状的IgE，同时增加与正常免疫相联系的IgG2a，可以改善基础过敏体质。还清楚的是，由于对过敏原特异性IgE的减少和对过敏原特异性IgG2a的增加一直是在免疫治疗领域的主要目的，因此，当将耐寒猕猴桃当作过敏免疫治疗助剂用于免疫治疗中时，它可以提高治疗效果。
表4
2-3对脾细胞细胞因子的表达分析为了分析给予耐寒猕猴桃提取物的小鼠脾细胞的细胞因子的表达，按照如下步骤从在实施例2-1中制备的脾脏中制备脾细胞。
在无菌条件下，将每份准备好的脾细胞汇聚和匀质化。
用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞，通过尼龙筛(60μm孔径)过滤以除去大的凝块，离心(1500rpm，5mins)以分离沉淀的细胞，然后将细胞加入用10％FBS补充的RPMI-1640培养基中。
将按照上述方法制备的脾细胞接种在24孔板上(5×106个细胞/毫升/孔)，用100μg/ml卵清蛋白处理，在37℃，包含5％CO2的空气中孵育3天。当培养结束后，收集培养溶液，然后用商用ELISA试剂盒检测与过敏症相关的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-12和干扰素-γ)的浓度。
如表5所示，给予耐寒猕猴桃提取物的小鼠脾细胞中，IL4和IL-5(它们归结为诱导过敏症的Th2细胞因子)的水平降低，IL-12和干扰素-γ(它们归结为抑制过敏症的Th1细胞因子)的水平升高。至于地塞米松处理的小鼠，Th1和Th2细胞因子均减少。
表5
经证实的，耐寒猕猴桃提取物可以通过特异的增加Th1细胞因子以及减少Th2细胞因子来防止和改善过敏性疾病，而地塞米松抑制整个免疫系统。
实验实施例3人类PBMC中Th1/Th2的下调用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)从具有高基础IgE血清水平的过敏患者的全血中制备人外围血单核细胞(PBMCs)，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基培养。用耐寒猕猴桃提取物(100μg/ml)和植物血细胞凝集素(PHA，5μg/ml)一起处理PBMCs，在5％CO2，37℃培养，PHA是一种通常使用的具有免疫刺激作用的外源凝集素。四十八小时后，用ELISA检测在细胞培养上清液中IL-5、IL-13、IL-10和干扰素-γ的水平。
表6表明耐寒猕猴桃提取物显著降低Th2细胞因子的血清水平IL-5和IL-13的水平分别降低了52％和47％，但是一种Th1细胞因子——干扰素-γ的血清水平增加了3.2倍。这个结果显示耐寒猕猴桃提取物可以提高Th1细胞因子的水平，同时降低Th2细胞因子的水平。以前已报道过，Th2细胞因子的下调作用可以有助于IgE的合成和过敏炎症的缓和。
表6
实验实施例4人血清IgE水平的降低为了检验耐寒猕猴桃提取物是否可降低人血清IgE水平，在超过21天的周期中，每日经口给予两位过敏患者(分别为患有过敏性鼻炎和过敏性皮炎的患者K和E，他们表现出高的IgE基础血清水平)耐寒猕猴桃提取物(干重1g)，每两个星期用ELISA法检测他们的IgE血清水平。
实验结果表明两位患者的IgE血清水平在42天后持续降低了2/3，在实验期间患者E的皮炎症状也有所改善(见表7)。
表7
实验实施例5对从小鼠腹膜肥大细胞中组胺释放的抑制作用从肥大细胞中组胺的释放是过敏反应的主要原因之一。因此，通过从肥大细胞中的组胺释放来检验耐寒猕猴桃提取物的作用。
用醚麻醉每只小鼠，将含0.1％白明胶的20ml Tyrode缓冲液B(NaCl、葡萄糖、NaHCO3、KCl、NaH2PO4)注射入腹膜腔；然后轻柔按摩腹部大约90秒。小心打开腹膜腔，用巴氏德吸液管吸取包含腹膜细胞的液体。然后在室温下以150×g将腹膜细胞沉积10分钟，在Tyrode缓冲液B中重新混悬。按照文献(Yurt et al.，J Exp Med.，1；146(5)，pp1405-19，1977)所述，从小鼠腹膜细胞的主组分中分离出肥大细胞。将悬浮于1ml Tyrode缓冲液B中的腹膜细胞层化在2ml 0.225g/ml的碘葡酰胺(密度1.120g/ml)上，并在室温下以400×g离心15分钟。吸取和弃去残留在缓冲液-碘葡酰胺分界面上的细胞；将沉淀物(pellet)中的细胞洗涤，在1ml含钙的Tyrode缓冲液A中重新悬浮。将脾细胞接种在每孔中有0.4ml培养基的24孔培养板(2×105个细胞/孔)中。在37℃将细胞整夜孵育，用0.5μg/ml抗脱氧核糖核蛋白24-牛血清白蛋白IgE(anti-DNP24-BSA IgE)致敏。在用IgE致敏细胞后，除去培养基，将细胞用0.5ml哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液洗涤两次；在37℃，或者用200μl PIPES缓冲液(作为对照)、色甘酸(10-4M)，或者用耐寒猕猴桃提取物(100μg/ml)预培养10分钟。用作为抗原的20g/ml DNP24-BSA刺激肥大细胞30分钟，用ELISA(ALerCHEK)检测释放入介质的组胺。按照下式1可计算对组胺释放的抑制作用。
抑制百分数＝100×(A-B)/(A-C)
所生产的LNG在低温腔室中贮存和该系统通过使用多组分致冷剂体系被冷却至-80℃和用液氮冷却至-161℃。该低温腔室维持在与闪蒸器相同的压力下直至达到平衡条件为止，这样能够产生对于给定的组成范围而言的蒸汽-液体平衡相位图。
通过使用简单的容积校正来测量在闪蒸器和低温腔室的每一个之内的液面。在蓝宝石池内的液面也能够由肉眼透过该池的透明壁来观察。
该系统的温度通过使用在每一个腔室内部的温度传感器来监测，其中第三个温度传感器用于监测在低温腔室和闪蒸器周围的空气浴。压力传感器位于空气浴的外部，并在低温腔室和闪蒸器的每一个的入口和出口。多口取样阀为低温腔室和闪蒸器的每一个所配备，以便在需要时对样品进行在线的气相色谱分析。
该系统通过使用磁力运转的涡流来搅拌，直至观察到二氧化碳的固体分离为止。该涡流促使较大密度的二氧化碳固体重力分离到腔室的底部。产生涡流的效果是将容器内的所形成固体带向该容器的壁，在这里让它们向下迁移到容器的底部。该涡流能够通过搅拌器由机械方式或通过在容器的底部包括旋液分离器来产生。
在第一系列的试验中，具有如表1中所列出的已知组成的天然气经由控制阀被引入到蓝宝石池中。
表1.原料气体*的GC分析
*(气体包括ppm级的硫醇)
为了实验，将15只Nc/Nga小鼠(出生后7个星期，雌性)分成3组，适应新环境1周。自出生后8周起，作为治疗组，经口给予在实施例1-1中制备的耐寒猕猴桃提取物(300μg/小鼠/天)；作为对照组，经口给予地塞米松(10μg/小鼠/天)或饮用水(100μg/小鼠/天)，给药周期均为8周。为了比较皮炎症状的进展，当小鼠长到12和14个星期大时，测定小鼠的搔痒频率(在20分钟的观察期间用于搔痒的时间)。将16个星期大的小鼠处死，用ELISA法检测血清中IgE、IgG1和IgG2a的水平的量。同时，为了比较Th1/Th2细胞因子的生成，从每只小鼠中用常规方法制备脾细胞，转移入24孔板(5×106个细胞/毫升/孔)中，用刀豆素A(ConA，1μg/ml)培养3天，然后用ELISA方法检测IL-4、IL-5、IL-12和干扰素-γ的水平。
已证实的，当测定搔痒的频率时，耐寒猕猴桃提取物像甾体消炎剂地塞米松一样抑制搔痒症状(见图2a出生后12周的结果，图2b出生后14周的结果)。
表10表明给予耐寒猕猴桃提取物的小鼠的IgE血清水平显著的降低。
在表11中，在脾细胞中，IL-4和IL-5的生成减少，干扰素-γ和IL-12的生成明显增多，该脾细胞是从给予耐寒猕猴桃提取物的小鼠中制备得到。耐寒猕猴桃提取物改善搔痒症状，降低血清中IgE的浓度，抑制经由脾细胞的Th2细胞因子的生成(与地塞米松相似)，但不象地塞米松，耐寒猕猴桃明显提高了IL-12和干扰素-γ的水平，其已被熟知可以有助于过敏性疾病的缓解。
表10
表11
实验实施例8毒性实验为了检定耐寒猕猴桃提取物的毒性，完成了关于小鼠的重复毒性实验。
将10只雌性Balb/c小鼠分为2组，以150mg/kg给予小鼠本发明的耐寒猕猴桃提取物(150mg/kg)，共4周，向对照组给予水。观察4周内的毒性症状，例如体重的改变、血液分析和组织检验。
作为实验的结果，在给予150mg/kg本发明耐寒猕猴桃的大鼠中，没有死亡的例子；在体重的增加、饲料的热量摄取、血液分析和组织检验等方面均没有显著的异常。根据上述结果，证明耐寒猕猴桃是安全的。
(1)重量和行为观察没有观察到重量或行为的不寻常的改变。
(2)血液学分析在白血球、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、红血球、血红蛋白或血小板的数量方面，没有观察到异常的症状。
(3)血清生化实验在血清的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、胆红素、肌酸酐、葡萄糖、胆固醇、矿物质、白蛋白、尿素氮(BUN)、脂肪酶或淀粉酶的水平方面，没有观察到异常的症状。
(4)组织学实验在肾、脾、肝或胸腺的组织中没有观察到异常的症状。
以下，将描述制剂方法和赋形剂的种类，但本发明并不限于此。如下，描述具有代表性的制备实施例。
注射剂的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 50mg间位二亚硫酸钠 3.0mg对羟基苯甲酸甲酯 0.8mg对羟基苯甲酸丙酯 0.1mg注射用蒸馏水 适量注射剂的制备方法如下按照常规方法混合上述组分，并取2毫升，然后采用常规注射剂制备方法将所有组分填充入2毫升安瓿中，消毒。
片剂的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 50mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸镁2mg通过混合上述组分和压片来制备片剂。
胶囊剂的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg滑石粉 2mg硬脂酸镁适量胶囊剂的制备方法如下混合上述组分并将其填入到按照常规白明胶制备方法得到的白明胶胶囊中。
液体制剂的制备耐寒猕猴桃的70％乙醇提取物 100mg蔗糖 20g果糖 20g柠檬香料 适量蒸馏水 100ml液体制剂的制备方法如下按照常规溶液剂制备方法将上述组分混合，然后填充入100ml棕色瓶中，消毒。
保健食品的制备实施例的1耐寒猕猴桃水提取物 1000mg维生素复合物20g维生素A醋酸盐 70μg维生素E 1.0mg维生素B10.13mg维生素B20.15mg维生素B60.5mg维生素B120.2μg维生素C 10mg生物素 10μg烟酰胺(Amide nicotinic acid)1.7mg叶酸50μg泛酸钙 0.5mg无机盐混合物适量硫酸亚铁1.75mg氧化锌 0.82mg碳酸镁 25.3mg磷酸二氢钾 15mg磷酸二钙55mg柠檬酸钾90mg碳酸钙 100mg氯化镁 24.8mg可以在许多方面改变上述维生素和矿物质混合物。这样的改变不被视为脱离本发明的精神和范围。
保健饮料的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 1000mg柠檬酸 100mg低聚糖 100g
杏浓缩物2g牛磺酸 1g蒸馏水 900ml保健饮料的制备方法如下按照常规的保健饮料制备方法溶解活性组分，混合，在85℃搅拌1小时，过滤，然后将所有组分填充入2000ml的安瓿中，消毒。
润肤液的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 1.00(％)甘油3.00乙醇1.00丙二醇 0.10香料微量蒸馏水 加至100％润肤液的制备方法如下按照常规化妆液的制备方法溶解活性组分。
外用化妆液的制备方法实施例1的耐寒猕猴桃水提取物3.00(％)L-抗坏血酸-2-磷酸镁1.00可溶性胶原质(1％溶液) 1.00柠檬酸钠 0.10柠檬酸 0.051，3-丁二醇3.00蒸馏水 加至100％外用化妆液的制备方法如下按照常规化妆液的制备方法溶解活性组分。
乳膏的制备方法实施例1的耐寒猕猴桃水提取物3.00(％)聚乙烯乙二醇单硬脂酸酯 2.00单硬脂酸甘油酯 1.00鲸蜡醇 4.00角鲨烯 6.00三2-甘油乙基己酸 6.00
鞘糖脂1.001，3-丁二醇 7.00蒸馏水加至100％面膜的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物 5.00(％)聚乙烯醇 13.00L-抗坏血酸-2-磷酸镁 1.00月桂酰羟基脯氨酸 1.00可溶性胶原质(1％溶液) 2.001，3-丁二醇 3.00乙醇 5.00蒸馏水加至100％面膜的制备方法如下按照常规面膜的制备方法溶解活性组分。
美容液的制备实施例1的耐寒猕猴桃水提取物2.00(％)羟乙烯基纤维素(2％溶液)12.00黄原胶(2％溶液)2.001，3-丁二醇3.00浓缩甘油 4.00透明质酸钠 5.00蒸馏水 加至100％美容液的制备方法如下按照常规美容液的制备方法溶解活性组分。
很明显的，可以在许多方面改变如上所述的本发明。这样的改变并不被视为脱离本发明的精神和范围，所有这样的修改，对本领域的技术人员是显而易见的，应当将其包括在下述权利要求的范围之内。
工业应用性如本发明所述，通过本发明的制备方法制备的耐寒猕猴桃提取物提高了血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，降低了血清中Th2细胞因子和IgE的水平，抑制了从肥大细胞中的组胺释放，还抑制了炎症反应。根据此，可以将耐寒猕猴桃用于药物组合物，以治疗和预防过敏性疾病，例如过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、遗传性过敏性皮炎、食物过敏和风疹，和非过敏性炎性疾病。
此外，可以将耐寒猕猴桃提取物用于保健食品，以治疗和预防过敏性疾病，例如过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、遗传性过敏性皮炎、食物过敏和风疹，和非过敏性炎性疾病。
权利要求
1.一种药物组合物，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶的提取物，用于预防和治疗过敏性疾病或非过敏性炎性疾病。
2.一种药物组合物，其包含作为活性成分的耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂可溶的提取物，用于过敏免疫疗法的辅助治疗。
3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述耐寒猕猴桃选自软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃和木天蓼。
4.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述耐寒猕猴桃是它的果实、茎或根的任何一种。
5.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述粗提取物在极性溶剂中可溶，所述极性溶剂选自蒸馏水、低级醇类、或它们的混合物。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中，所述粗提取物在蒸馏水或70％乙醇中可溶。
7.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述非极性溶剂是乙酸乙酯。
8.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，基于组合物的总重量，以重量计，提取物的量在0.01至50％的范围内。
9.权利要求1所述的药物组合物，其中，所述过敏性疾病包括过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、遗传性过敏性皮炎、传染性皮炎、风疹、昆虫过敏、食物过敏和药物过敏。
10.根据权利要求1至9之一所述的药物组合物，其中，所述药物组合物以片、粉末、胶囊、液体、混悬液、颗粒或糖浆的形式提供。
11.上述提取物在制备治疗和预防哺乳动物或人的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病的药物组合物中的应用。
12.一种保健食品，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物或非极性溶剂提取物，以及饮食学上可接受的添加剂，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
13.权利要求12所述的保健食品，其中，所述耐寒猕猴桃选自软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃和木天蓼。
14.权利要求12所述的保健食品，其中，所述耐寒猕猴桃是果实、茎或根。
15.权利要求12所述的保健食品，其中，所述过敏性疾病包括过敏性反应、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、遗传性过敏性皮炎、传染性皮炎、风疹、昆虫过敏、食物过敏和药物过敏。
16.权利要求12所述的保健食品，其中，所述粗提取物在非极性溶剂中可溶，所述非极性溶剂选自蒸馏水、低级醇类、或它们的混合物。
17.权利要求16所述的保健食品，其中，所述粗提取物在蒸馏水或70％乙醇中可溶。
18.权利要求12所述的保健食品，其中，基于组合物的总重量，以重量计，提取物的量在0.01至80％的范围内。
19.权利要求12所述的保健食品，其中，所述保健食品以粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形式提供。
20.一种食品添加剂，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物，用于预防和改善过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
21.权利要求20所述的食品添加剂，其中，所述耐寒猕猴桃的粗提取物还包含选自乳糖酪蛋白、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的至少一种。
22.权利要求20所述的食品添加剂，其中，每100w/w％组合物中，添加剂的比例在大约0到20w/w％的范围内。
23.根据权利要求20至22之一所述的食品添加剂，其中，将所述食品添加剂用于香料、调味料或食品原料。
24.权利要求23所述的食品添加剂，其中，可以通过沉积、喷雾或混合将所述食品添加剂添加到食品中。
25.权利要求20所述的食品添加剂，其中，所述食品是选自下述至少一种水果、蔬菜、食物脱水食品或例如水果和蔬菜的切片产品；果汁、蔬菜汁或它们的混合汁；包含酸性饮料的饮料；甜食，例如小甜饼、冰糖、饴糖、口香糖；面包；冰淇淋、茶、例如酵母乳的发酵牛奶；乳制品、调味品、含酒精的饮料、罐头、瓶装食品、面条、加工畜产品、加工海产品、发酵食品、豆类食品、谷类食品、加工肉类、甘草和果皮。
26.一种饲料添加剂，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物，用于预防和治疗动物的过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
27.权利要求26所述的饲料添加剂，其中，所述粗提取物可溶于极性溶剂，该极性溶剂选自蒸馏水，例如乙醇、甲醇、丁醇的低级醇，或它们的混合物。
28.权利要求26所述的饲料添加剂，其中，所述耐寒猕猴桃选自软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃和木天蓼。
29.权利要求26所述的饲料添加剂，其中，所述饲料添加剂以液体、粉末或颗粒的形式提供。
30.权利要求26所述的饲料添加剂，其中，通过沉积、喷雾或混合将所述饲料添加剂添加到饲料中。
31.一种饲料组合物，其包含权利要求26至30之一所述的饲料添加剂。
32.一种化妆品组合物，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物，用于预防、改善和治疗过敏性皮肤疾病和非过敏性皮肤炎性疾病。
33.权利要求32所述的化妆品组合物，其中，使用提取溶剂提取所述粗提取物，所述提取溶剂选自蒸馏水、例如乙醇、甲醇、丁醇的低级醇类、或它们的混合物。
34.权利要求32所述的化妆品组合物，其中，所述过敏性疾病包括遗传性过敏性皮炎、传染性皮炎、风疹、昆虫过敏、食物过敏和药物过敏。
35.权利要求32所述的化妆品组合物，基于组合物的总重量，以重量计，提取物的量在0.01至30％的范围内。
36.根据权利要求32至35之一所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物以护肤品、外用化妆液、乳膏、香精、收缩水、乳液、面膜、胶浆、洗发精、染发水、洁面乳、沐浴液、洗涤液或护理品的形式提供。
37.一种化妆品添加剂，其包含耐寒猕猴桃的粗提取物，用于预防、改善和治疗过敏性皮肤疾病和非过敏性皮肤炎性疾病。
全文摘要
本发明提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的有效量的耐寒猕猴桃提取物，通过减少炎症反应，抑制组胺从肥大细胞中的释放，提高血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，降低血清中Th2细胞因子和IgE的水平，以治疗和预防过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。本发明还提供了上述提取物在制备药物组合物中的应用。本发明还提供了一种保健食品或食品添加剂、一种化妆品组合物、一种饲料或饲料添加剂，其包含上述提取物，通过减少炎症反应，抑制组胺从肥大细胞中的释放，提高血清中Th1细胞因子和IgG2a的水平，降低血清中Th2细胞因子和IgE的水平，用于预防或缓解过敏性疾病和非过敏性炎性疾病。
文档编号A23L1/30GK1678333SQ03819990
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月12日 优先权日2002年8月23日
发明者金峰徹, 陈美琳, 朴银珍, 郑亨镇, 申圣燮, 吴镇桓, 李和峻, 金善荣, 全香 申请人:凡基因里门