用于消化道神经肌肉功能的益生菌的制作方法

专利名称：：用于消化道神经肌肉功能的益生菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用挑选的益生菌制造营养组合物或药物，以预防或治疗消化道(gut)疼痛或消化道不适、消化道运动机能障碍(motordysfunction)、消化道神经肌肉异常(neuromuscularabnormalities)和消化道感染后的后遗症。本发明还涉及预防或治疗消化道疼痛或消化道不适以及持久性消化道运动机能障碍的方法。
背景技术：
：益生菌通常被定义为通过改善宿主的肠道微生物平衡而有利于人或动物宿主的活微生物食物增补剂。至今已经报道或提出了益生菌的若干不同有利作用，如排除螺杆菌(Helicobacter)感染(EP0577903)、增强抗定居抗性(特别是对于梭状芽孢杆菌(clostridium))、降低血清胆固醇、影响宿主免疫系统(例如在体液和细胞免疫系统水平)。EP0768375公开了能够植入肠道菌群的双岐杆菌(Bifidobacteria)，它能粘附肠道细胞并竞争性排除肠道细胞上的病原细菌。WO98/00035公开了含有几种乳酸细菌的肠用组合物，如通过TCD4+外周血淋巴细胞的数量所测量到的，它们表现出可以刺激免疫系统。当人和哺乳动物出现消化道不适或消化道疼痛时，这些常是消化道运动性障碍或换句话说，消化道神经肌肉异常的症状。任何年龄的个体在许多情况下都会出现消化道神经肌肉异常。如婴儿遭受的绞痛(colic)或反复的腹痛，妇女由于激素周期出现的消化道疼痛等等。就肠易激惹综合症(IBS)而言，益生菌对这一特殊综合症的效果在现有技术中并不一致。在最近的一项研究(NiedzielinK等人，Acontrolled，double-blind，randomizedstudyontheefficacyofLactobacillusplantarum299Vinpatientswithirritablebowelsyndrome，EuropeanJournalofGastroenterology&Hepatology2001，131143-1147)中发现益生菌可能具有调节消化道的运动性的作用。另一方面，O′SullivanMA和O′Morain的文章(Bacterialsupplementationintheirritablebowelsyndrome.Arandomizeddouble-blindplacebo-controlledcrossoverstudy，DigLivDis2000May；32(4)302-4)中没有发现干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)菌株GG与安慰剂平均值之间具有显著差异。其它现有技术确证了此后一发现。ThompsonWG(Probioticsforirritablebowelsyndromealightinthedarkness？，EurJgastroenterolHepatol131135-1136，2001)讨论了益生菌对IBS的可能治疗作用。本发明的目的之一是减轻与消化道神经肌肉控制和运动功能的改变有关的任何疼痛或不适。本发明总的目的是减少和/或减轻与个体生命中任何可能情况有关的消化道神经肌肉异常。发明概述值得注意的是，益生菌微生物、其代谢物和/或生长底物影响肠道内的神经肌肉控制。具体的，已证明特定的益生菌可用于减轻胃肠道神经肌肉异常(特别是在感染后)。因此，本发明的第一方面提供挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道疼痛或消化道不适的营养组合物或药物中的用途。本发明的第二方面提供挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道运动机能障碍的营养组合物或药物中的用途。本发明的第三方面提供挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道神经肌肉异常的营养组合物或药物中的用途。本发明的第四方面提供挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造治疗或减轻消化道感染后的后遗症的营养组合物或药物中的用途。在还有的方面，本发明提供通过向人或动物施用有效量的挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物来预防或治疗消化道疼痛或消化道不适的方法。在另一方面，本发明提供预防或治疗消化道运动机能障碍或感染后的过度收缩性(hyper-contractility)的方法，该方法包括施用有效量的挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物的步骤。本发明的一个优势是提供了治疗或预防消化道神经肌肉异常和相关的症状、消化道问题或疾病状态的可能性。本发明的另一优势是提供了不施用药物，而是基于食品级益生菌微生物或它们的衍生物来治疗或预防消化道神经肌肉异常的可能性。附图简述图1显示取自宿主生物的消化道肌肉组织的收缩强度曲线(AUC)下的面积，所述宿主在感染线虫寄生虫十天后被喂以不同的益生菌和对照。使用不同浓度的氨甲酰胆碱引发刺激(细节在实施例2中给出)。AUC是对消化道肌肉收缩的强度和持久性的测量，以及对感染过程中发展的神经肌肉异常的程度的测量。符号表示以下意义◆对照、■嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，johnsonii)、×长双岐杆菌(Bifidobacteriumlongum)、*乳酸双岐杆菌(Bifidobacteriumlactis)、▲副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。可见益生菌通常降低AUC，不同的菌株表现出或多或少的明显效果。图2显示描述于图1但是由电场刺激的肌肉组织的紧张性收缩(A)和位相性收缩(B)，并比较了喂以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副干酪乳杆菌(CNCMI-2116)益生菌株系以及仅喂以培养基上清液液(Sn)的宿主生物。术语“紧张性增加和位相性收缩”在实施例2和图3中解释。如所见的，所有益生菌来源的饲料(活的或死的细菌、上清液)都具有比对照(MRS)明显更低的紧张性增加和位相性收缩。图3形象地表示了用于测定感染后的神经肌肉异常的方法的概念。曲线显示对体外肌肉刺激的记录。在刺激前记录基础张力(tone)(1)和基础相位(4)。刺激后，肌肉发生收缩，此收缩被记录为刺激后的张力(2)和刺激后的位相性收缩(5)。也可计算曲线(AUC)下的面积(7)。为了进行统计，比较了对照和处理样品的紧张性收缩(3)、位相性收缩(6)和AUC(7)。发明详述在说明书的上下文中，“包含”一词指“包括，但不仅限于”。它不应被理解为“仅仅由…组成”。为了本发明目的，术语“挑选的益生菌微生物”或简单地“挑选的益生菌”指的是能够发挥这里报道的有利作用的任何微生物，或这类益生菌的混合物或组合。因此益生菌可以选自已知的益生菌株系。然而，至今未知具有益生性质的微生物也可能被证明具有根据本发明的有益的作用，并因此包括于术语“益生菌”中。在本发明的上下文中，术语“营养组合物”旨在包括任何可食用的物质。因此，它可以是设计为人食用的产品，但是此术语也包括动物食用的产品，例如宠物，如狗、猫、兔子、豚鼠、小鼠、大鼠、鸟(例如鹦鹉)、爬行动物和鱼食用的产品。然而，此术语也包括其它驯养动物食用的食物，例如家畜(如牛、马、猪、绵羊、山羊、水牛、骆驼等)的饲料产品。营养组合物可以是用于人消费的食物产品，如饮料、饮品、棒状食品、点心、冰激凌、奶制品(例如冷藏的或耐贮存的奶制品)、糖食、谷物产品(如早餐谷物)、旨在于微波炉或烤箱中加热后食用的冷冻产品、即食产品、速食或营养配方制品等。营养配方制品包括任何全营养的或增补的制品。它可以是例如，通常可应用的营养配方制品、婴儿或幼儿配方制品、用于老年患者的配方制品、用于需要大量护理的患者的配方制品或专门适应用于患有特殊疾病的患者的配方制品。例如，营养配方制品可以适应于患有营养相关问题的患者，所述营养相关问题是例如Crohn氏症、高血糖、肥胖、体重减轻、痢疾、便秘、苯丙酮尿症、肝炎、急性或慢性肾衰竭等等。这类配方制品可以是可复水的，即以干品的形式存在，或是易于饮用的，例如以液体制品的形式。在本发明的上下文中，术语“消化道神经肌肉异常”包括与异常的或扰乱的消化道肌肉收缩、收缩性或运动性相关联的所有疼痛或不适相关症状。例如，这些异常与不正常的膨胀或通便有关，与婴儿和/或幼儿的绞痛有关，与人或宠物的消化道套叠有关，与消化道被寄生虫(如线虫或病原细菌)感染后扰乱的通过肠的转运时间有关。在本发明上下文中，消化道神经肌肉异常还包括与婴儿期相关的异常(如作为婴儿绞痛问题的一部分)、与锻炼相关的异常(包括运动诱导的痉挛)和与剧烈锻炼和体育运动相关的神经肌肉问题、与妊娠相关的异常和与分娩相关的失调、与具有无关损伤、创伤和感染但其临床治疗或状况(包括抗生素、固定不动和肠胃外或肠内喂食)导致了肠道神经肌肉功能丧失的临床患者相关的异常、与衰老有关的异常以及与活动减少、低膳食纤维和微生物区系改变相关的神经肌肉控制丧失、与不寻常的饮食或生活习惯(包括饮酒、表现出神经肌肉副作用的药物、宇航员遇到的重力改变、剧冷或剧热和再水化(rehydration)问题)相关的异常。“运动机能障碍”等同于通常出现在人或动物的胃肠道被病原生物，如线虫、绦虫和某些细菌(如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)或沙门氏菌(Salmonella))感染之后的消化道神经肌肉异常。运动机能障碍也可能发生在其它原因导致的发炎过程中或之后。在许多情况下，消化道神经肌肉异常或运动机能障碍是持久的，会持续很长时间。优选的是，本发明的用途涉及与消化道肌肉异常有关的消化道疼痛或不适。“后遗症”是感染后持续的异常或偏离健康状态，即使是寄生虫或其它感染因素已从宿主中消除。它们被认为通常对宿主造成不可逆的损害。在本发明上下文中“益生菌来源物质”包括活的或死的益生菌、通过用益生菌发酵获得的培养基、在发酵后的培养基中发现的代谢物以及它的衍生物，如浓缩物等、发酵底物、通过如过滤或离心去除掉益生细菌后的培养基上清液或保留物。在本发明的一个实施方案中，消化道疼痛或不适、运动机能紊乱或消化道神经肌肉异常由病原体感染消化道引起。本发明上下文中“病原体”包括能够感染个体消化道并导致疾病状态的微生物。因此术语“病原体”包括寄生虫、细菌、病毒、多细胞生物(如线虫和其它蠕虫)。益生菌的选择可以选择任何合适的微生物作为益生菌。根据本发明，优选的益生菌选自对人或动物的健康发挥有益作用的微生物。文献中提及了一些可以从中挑选出根据本发明的益生菌的微生物。如EP0862863A2，具体在第3页，第25-37行，列出了可以从中选择本发明益生菌的微生物。合适的益生微生物的例子包括酵母如酵母属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)，霉菌如曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)和青霉属(Penicillium)和球拟酵母属(Torulopsis)以及细菌如双岐杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、库克菌属(Kocuria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)以及乳杆菌属(Lactobacillus)。合适的益生菌微生物的具体例子有黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、肠膜芽孢杆菌(B.mesentericus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilus)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛拟杆菌(Bac.capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bac.ruminocola)、猪拟杆菌(Bac.suis)、青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、B.animalis、短双岐杆菌(B.breve)、两岐双岐杆菌(B.bifidum)、婴儿双岐杆菌(B.infantis)、乳酸双岐杆菌(B.lactis)、长双岐杆菌(B.longum)、假长双岐杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双岐杆菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesii、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳脂肠球菌(Enterococcuscremoris)、E.diacetylactis、粪肠球菌(E.faecium)、中间肠球菌(E.intermedius)、乳酸肠球菌(E.lactis)、E.muntdi、嗜热肠球菌(E.thermophilus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、L.alimentarius、L.amylovorus、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、L.delbrueckiiss.Bulgaricus、L.farciminis、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、植物乳杆菌(L.plantarum)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、L.sakei、唾液乳杆菌(L.salivarius)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、P.cereviseae(damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Prop.shermanii)、酿酒酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staph.xylosus)、Streptococcusinfantarius、Strep.Salivariusss.thermophilus、嗜热链球菌(Strep.thermophilus)、乳链球菌(Strep.Lactis)。例如，益生菌株可以选自例如地衣芽孢杆菌(DSM5749)、枯草芽孢杆菌(DSM5750)、乳酸双岐杆菌(DSM20215)、粪肠球菌菌株(如NCIMB10415、NCIMB11181、NCIMB30098、DSM3520、DSM4788、DSM4789、DSM5464、DSM7134、CECT4515)、E.mundtii(CNCMMA27/4E)、酿酒酵母菌株(如BCCM/MUCL39885、CBS49394、CNCMI-1077、CNCMI-1079、NCYCSc47)、干酪乳杆菌(NCIMB30096)、L.farciminis(CNCMMA67/4R)、约氏乳杆菌(I-1225CNCM)、副干酪乳杆菌(I-2116CNCM)、植物乳杆菌(CNCMI-840)、鼠李糖乳杆菌(DSM7133)、乳酸片球菌(CNCMMA18/5M)、Streptococcusinfantarius(CNCMI-841)、嗜热链球菌(Chr.Hansen，)，和它们的混合物。根据本发明，具有示例性保藏菌株的益生菌种的另外例子可以选自罗伊氏乳杆菌(CNCMI-2452、CNCMI-2448、CNCMI-2450、CNCMI-2451)、鼠李糖乳杆菌(CNCMI-2449)、嗜酸乳杆菌(CNCMI-2453)和它们的混合物。在这一段提及的菌株可能特别适合宠物。可以通过筛选方法从以上列出的微生物中挑选根据本发明的有效益生菌。尽管可以使用任何合适的筛选方法，但BarbaraG、VallanceBA在CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice，Gastroenterology1997；1131224-1232中开发的方法被证明相对快速。此参考文献公开了一种测量消化道神经肌肉异常程度的模型。因此，可以通过以下步骤挑选合适的益生菌-从一种动物物种或人挑选患有消化道神经肌肉异常的至少一个生物体，-通过肠道途径向该生物施用益生菌来源物质，-测量该生物消化道肌肉组织的第一收缩性，-将此第一收缩性与阴性对照的第二收缩性相比较，和，-挑选益生菌株，所述益生菌株会导致食用它的生物的肌肉组织具有低于阴性对照的第一收缩性。在有关筛选的段落中用于挑选特定益生菌株的“阴性对照”旨在指患有消化道神经肌肉异常的生物的消化道肌肉组织，并且该生物没有通过肠道途径接受益生菌来源物质。筛选包括测量生物消化道肌肉组织的第一收缩性的步骤，此外还包括将此第一收缩性与阴性对照的第二收缩性相比较的步骤。可以通过任何适当的方法测量收缩性。例如，使用BarbaraG、VallanceBA、CollinsSM的方法(见上文)。参见特别是1225-1226页的章节“用于收缩性研究的组织制备”、“收缩的测量”、“电场刺激的参数”、“药物和溶液”及“数据表达和统计分析”，在此这些章节被引入为参考。因此，可以在体外测量收缩性，即，解剖消化道节段(例如近端空肠节段)，在组织浴槽中以合适的方式固定此节段，诱导肌肉收缩(例如通过化学或电刺激)，用适当的数据处理器记录收缩。如图3所描述的，基础张力(1)、刺激后的张力(2)和紧张性收缩(3)以及基础相位(4)、刺激后的位相性收缩(5)、位相性收缩(6)和曲线下面积(7)的测量可以作为收缩性的参数。根据本发明的挑选的益生菌是按照上述筛选方法挑选的、例如相对于阴性对照，在患有消化道神经肌肉异常的生物中能降低消化道肌肉的收缩性的益生菌。在本发明的一个实施方案中，挑选的益生菌是能够在小鼠模型中通过显著降低Th2释放的细胞因子来影响病原体诱导的免疫反应的益生菌。优选的Th2释放的细胞因子是IL-4和/或IL-13。在本发明上下文中，“显著的”指的是P＜0.1(优选p＜0.05)的统计学显著差异，它是通过将喂以益生菌的感染小鼠(处理)与阴性对照相比而获得的。通常，可以在感染后于确定的时期在纵行肠肌肌肉制品(longitudinalmyentericmusclepreparation，LMMP)中测量细胞因子。优选在感染后14天于LMMP中测量细胞因子。可以使用商业可获得的试剂盒并按照厂商的说明书测量细胞因子浓度。评估益生菌是否能够显著降低Th2释放的细胞因子的优选方法包括小鼠模型，见下述。对每只雌性NIH瑞士小鼠(6-8周龄)管饲375只旋毛虫(Trichinellaspiralis)幼虫(见BarbaraG.等人的方法，前文)。为了测定益生菌的影响，从感染后的10到21天，感染的小鼠被每日通过管饲喂以100μl1010个益生微生物(细菌、酵母等)，使用100μlMRS作为阴性对照。可以通过解剖整个空肠，在冷的无菌PBS中漂洗，并切成4段来制备LMMP。除去肠系膜，并将肠段固定在玻璃棒上。使用干净的棉签刮下肌肉层，速冻并储存于-70℃直到试验。可以通过组织学评估确证肌肉的成功分离。将肌肉组织置于1ml含有10％NP-40、10mg/ml异丙醇中的PMSF、1mg/ml抑酶肽和1mg/ml亮抑酶肽的裂解缓冲液中。组织匀浆后测定总蛋白质浓度(Bio-RAD蛋白质分析，Hercules，CA，USA)，等分分装样品并储存于-70℃以用于进一步分析。使用商业试剂盒(QuantikineMMurine，Minneapolis，MN，USA)，按照厂商说明书，可以在LMMP中测定IL-4和IL-13(Th2-细胞因子)和其它炎症介质TGF-bl和PGE2的浓度。在本发明的另一实施方案中，益生菌是能够在小鼠模型中通过显著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在LMMP中的表达或浓度来影响病原体诱导的炎症的益生菌。可以用如上指出用于IL-4和IL-13的方式以商业可获得的试剂盒，通过分析LMMP来测量TGF-β1或PGE2浓度。以下给出评估显著差异(特别是被感染小鼠的LMMP中表达的TGF-β1和COX-2)的优选方法在感染后14天于LMMP中测量TGF-β和COX-2的信使RNA表达。使用一步法从LMMP中分离总RNA(ChonczynskiP，SacciN″SinglestepmethodofRNAisolationbyacidguanidiumthiocyanate-phenol-chloroformextraction，″AnnBiochem162156-159；1987)。按照VerduEF等人的描述(Modulatoryeffectofestrogenintwomurinemodelsofexperimentalcolitis.AmJPhysiolgastrointestLiverPhysiol2000；283G27-36)完成逆转录和PCR反应。使用下述引物。HPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，用作标准化对照)有义5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’，反义5’-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3’(SveticA，″Cytokineexpressionafterimmunization″，JImmun1472391-7)。TGFβ有义5’-TCACCCGCGTGCCTAATGGT-3’和反义5’-GGAGCTGAAGCAATAGTTGG-3’(DerynckR，RheeL，NucleicAcidRes1987；153187-97)；COX-2有义5’-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3’，反义5’-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3′(Gustafson-Svard等人，Cyclooxygenase-1andcyclooxygenase-2geneexpressioninhumancolorectaladenocarcinomasandazomethaneinducedcolonictumoursinrats.Gut1996；3879-84)；为了排除污染样品的基因组DNA的扩增，也使用RNA作为底物进行PCR实验。扩增后在2％琼脂糖凝胶中电泳分离15μl的PCR产物，通过溴乙啶染色显像，并使用55型Polaroidland胶片拍照(Kodak，Rochester，NY)。底片被用于通过KodakDigitalScience1D2.0ImageAnalysis软件进行带强度的密度计量学定量。以HPRT管家基因来标准化结果，并以细胞因子对HPRTmRNA的表达比例来表示。在本发明的一个实施方案中，挑选的益生菌是双岐杆菌。优选的是乳酸双岐杆菌或长双岐杆菌。在还有的本发明实施方案中，挑选的益生菌是副干酪乳杆菌。还在本发明另外的实施方案中，挑选的益生菌选自长双岐杆菌(CNCMI-2170)、乳酸双岐杆菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副干酪乳杆菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它们的混合物。而在本发明的另一实施方案中，益生菌包括死的益生细菌、发酵底物和/或益生菌来源物质。任选的是，益生菌也包括它们的发酵底物，如益生素。本领域技术人员通常知道益生菌的发酵底物，例如双岐杆菌可利用菊粉和/或寡聚果糖作为发酵底物。益生菌制备本领域技术人员知道如何制备挑选的益生微生物。它们既可以通过商业获得，也可以通过发酵方法常规产生，并可任选地进行干燥。技术人员了解，特定的菌株通常具有特定的优选培养基或底物。微生物可以是干燥的形式，或例如是孢子的形式(对于形成孢子的微生物而言)。技术人员知道如何干燥发酵后产生的微生物。例如见WO0144440(INRA)或EP0818529(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)，其中描述了粉碎干燥方法。通常，从培养基浓缩细菌微生物并通过喷雾干燥法，流化床干燥法，冻干法(冷冻干燥)或其它适当干燥方法进行干燥。例如，在干燥前或干燥过程中将微生物与碳水化合物(如蔗糖、乳糖或麦芽糖糊精)、脂质或蛋白质(如奶粉)之类的载体材料混合。然而，微生物并非必须以干燥的形式存在。在发酵之后直接将它们与食物产品混合，然后任选地进行干燥加工，也可能是合适的。这样一种方法被描述于WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。同样，在理论上可以在发酵后直接食用益生菌。进一步的加工(例如为了制备方便的食物产品)并不是益生菌有益性质的前提条件。许多适宜实施本发明的益生菌是商业可获得的，可以以粉末的形式从各供应商处获得，例如，可以从Ch.Hansen获得乳酸双岐杆菌(DSM20215)。本领域技术人员知道多个不同的益生菌供应商。一些供应商以特定的包囊化形式提供益生菌，以便确保微生物在通过胃肠道的过程中或在产品的储藏过程中或产品的储存期有高的存活率。包含具有增加的贮存稳定性而无过多损失的微生物的产品的例子描述于EP0180743和WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。根据本发明的益生菌可以以任何形式通过肠道途径消费。它们可以加入营养组合物，如食物产品中。另外，它们也可以直接消费，例如以干燥的形式，或者在发酵产生生物质之后直接消费。例如，益生菌可以以发酵的奶制品，如冷藏的奶制品、酸乳酪或新鲜干酪的形式消费。在后面这些例子中，也可以直接使用益生菌产生发酵产品本身，因此益生菌至少具有双重功能本发明上下文中的益生功能和对底物(如奶)发酵以产生酸乳酪的功能。如果将益生菌加入营养配方制品，技术人员知道实现此的可能方案。干的，例如喷雾干燥的细菌，如可通过描述于EP0818529的方法获得的细菌可以以粉末的形式被直接加入营养配方制品或加入到任何其它任选干燥的食物产品。例如，可以在消费前将粉末益生菌制品加入营养配方制品、早餐谷物、色拉、面包片。包含特定益生菌的营养配方制品目前是商业可获得的。例如，由Nestle商品化的含有益生菌的断奶后配方制品(follow-upformula)，例如特别适合婴儿的“NAN2或NIDINA2-withBifidus”产品可以被用于本发明的目的，只要提供有效的量即可。可选的是，可以将干的益生菌加入液体产品，例如饮料或饮品。如果旨在以活的状态消费细菌，在加入益生菌后，含有益生菌的液体产品应该被相对迅速地消费。然而，如果将细菌加入耐贮存产品，只要益生菌在饮料或饮品中是稳定的，则没有必要迅速的消费。WO9810666公开了一种干燥食品组合物连同益生细菌培养物的方法。因此，可以将益生菌与例如汁、基于奶的产品或植物乳汁同时干燥，产生已经含有益生菌的干燥产品。可以在以后使用水性液体将这一产品复原。益生菌的量虽然并非强制性的，但是益生菌可以以活的状态被消费，以旨在使益生菌微生物完好地到达小肠和大肠，并可以在大肠建群。如果情况如此，通常要每日消费足够剂量的活细菌，以实现成功建群。技术人员了解每日剂量取决于微生物，但是通常介于每日106到1014cfu的范围，优选每日107到1013cfu。在本发明的上下文中，向约65kg体重的人施用的活益生菌的有效量优选介于每日1010到1014，更优选的介于1011到1013，最优选的介于1-4×1012cfu。优选的活益生菌量相当于大约每日一瓶商业可获得的、用益生菌株制备的、2dl酸乳酪。一个日份量的食品，或如果优先几个日份量，则所有这些分量一起将通常添加有以上指出的有效量益生菌。然而，使用死的益生菌、发酵的培养基或简单地使用益生菌的底物(通常是益生素纤维)也能实现本发明的教导。因此，发酵的培养基(即使基本不含益生菌，但含有益生菌代谢物)可以被用来实施本发明。换句话说，可以将死的或活的益生菌、它们的培养基、底物或代谢物以与前面描述的针对活益生菌的相同或相似的方式直接加到食物产品中。发酵的培养基、底物或代谢物可以在发酵后通过如离心或过滤与细菌分离。然后可以浓缩、冷却、冷冻、干燥(例如喷雾干燥)上清液或滤液，或直接通过肠道途径施用给个体。如果干燥发酵后的培养基，可以将其制成粉末并如前文针对活益生菌所述的加入到任何食物产品中。如果向人施用上清液或发酵培养基，有效量为0.5到3dl，优选1到2dl的30到50小时，优选45到50小时细菌培养后收获的生长培养基。当在OD600nm估计细菌密度时，通常获得2到7的OD，这分别表示生长到每毫升2到7×108个细菌。在通过如过滤除去细菌后可以施用上清液。上清液的有效量相当于每天一瓶商业可获得的、用挑选的益生菌制备的、1到2dl酸乳酪。对于动物(如宠物)，相应的活细菌或上清液的有效量以体重的函数计算。也可以将含有益生菌的发酵培养基匀浆，并与培养基一起进一步加工通常被破坏的益生菌。如已经指出的，益生菌底物(如促进特定益生菌的膳食纤维)可以被用来实现本发明。这是间接实现本发明效果的一种方式。通过促进肠道中特定益生菌株的生长，可以达到与这里所述相同的效果。给出以下实施例仅为举例说明，不应该将它们曲解为是对本发明主题的限制。以下实施例1和2旨在检查补充益生菌是否可以预防或治疗短暂的肠粘膜感染后形成的消化道异常和一般的消化道神经肌肉异常。为了检查这些问题，使用了以急性旋毛虫感染事件后持续的神经肌肉异常为特征的小鼠模型。由此发现益生细菌可以逆转肠感染后的持续消化道神经肌肉异常。这些结果首次表明益生细菌能够干扰肠感染过程中的寄生虫负荷。而且，即使是在寄生虫感染已建立之后开始施用益生菌，也可以逆转由这些感染引起的一些长期的胃肠道并发症。这些效果被首次证实高度依赖于所使用的具体益生菌。实施例1预防小鼠感染旋毛虫的益生菌材料和方法以下在″国立微生物保藏中心″(CNCM)保藏的菌株和商业可获得的益生菌株被用于实验。嗜酸乳杆菌(johnsonii)(CNCMI-1225)副干酪乳杆菌(CNCM1-2116)长双岐杆菌(CNCMI-2170)乳酸双岐杆菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)，购自ChristianHansenBioSystemsA/S(CHL)，10-12BogeAllé，P.OBox407，DK-2970Horsholm，丹麦。在旋毛虫感染(375只幼虫)前持续10天，每天用益生菌制品和两种对照(培养基(MRS)或磷酸缓冲盐水(PBS))对雌性NIH瑞士小鼠(每组n＝5)进行管饲。贯穿整个实验连续施用益生菌。旋毛虫感染后9天，对小鼠实施无痛死亡，计数蠕虫的数量和测定髓过氧化物酶活力(MPO)。每日管饲量为每种细菌1×109细菌/100μl生长培养基/小鼠/天和100μl过滤的生长培养基/小鼠/天(在实验中仅用上清液)。结果在使用MRS或PBS进行预防性处理的小鼠之间蠕虫数量没有差异，因此所有进一步的实验使用MRS作为唯一对照组。发现用乳酸双岐杆菌菌株预处理的小鼠比用MRS及PBS预处理的小鼠趋向于具有更低的蠕虫数量。另一方面，嗜酸乳杆菌菌株表现出增加蠕虫负荷(load)。剩下的菌株(就测试的时期和剂量而言)并没有表现出对蠕虫负荷有显著影响。总之，发现当预防性施用时，不同的益生菌菌株对于蠕虫负荷具有不同的效果。特定的益生菌株(如乳酸双岐杆菌菌株)能够降低肠道寄生虫(如线虫)的感染负荷。实施例2在小鼠中治疗旋毛虫感染后遗症的益生菌材料和方法在第二个实验中，小鼠首先被旋毛虫(375只幼虫)感染，并在感染后的10到21天，每日用上述5种益生菌或MRS进行管饲，然后无痛处死小鼠，并取组织进行体外收缩性实验。在此旋毛虫模型中，尽管在感染后的第21天寄生虫已被排出并且肠粘膜炎症已经消退，但神经肌肉异常(过度收缩性)仍然持续。经药理学刺激(氨甲酰胆碱)或电刺激(EFS)置于肌肉浴槽中的肠组织之后，通过体外收缩性测量来评估神经肌肉功能。使用的方法根据BarbaraG，VallanceBA，CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice.Gastroenterology1997；1131224-1232。特殊是见章节“用于收缩性研究的组织制备”和“收缩的测量”。因此，从小鼠中取一小段肠，在37℃于充氧(95％O2/5％CO2)的Krebs溶液中处理。系住肠段的相对末端。组织的一端与等长力传感器(isometricforcetransducer)(FT03C型；Grass，Quincy，MA)连接，另一端与浴槽的衔铁(armature)连接。用Grass7E多道记录仪记录反应。用EFS和氨甲酰胆碱(细节见上述参考文献)产生刺激。通过计算机分析刺激的收缩，由此测量了基础张力、位相性收缩、紧张性收缩和紧接于收缩后的最大张力，并计算了曲线下面积。图3形象化表示了基础张力(1)、刺激后的张力(2)和紧张性收缩(3)以及基础相位(4)和刺激后的位相性收缩(5)、位相性收缩(6)和曲线下面积(7)的概念。结果图1显示曲线下的面积，此面积考虑了刺激后收缩的时期和这一时期内的收缩张力。在喂以上述提及的益生菌株的小鼠和对照小鼠之间可见明显的差异(更小的曲线下面积)，证实在前面的情况下刺激后的收缩更短和/或张力更小。图1中的符号具有以下意义◆对照、■嗜酸乳杆菌(johnsonii)、×长双岐杆菌、*乳酸双岐杆菌、▲副干酪乳杆菌。图2表示描述于图1的但是由电场刺激的肌肉组织的紧张性收缩(A)和位相性收缩(B)，并比较了喂以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副干酪乳杆菌(CNCMI-2116)益生菌株和仅喂以培养基上清液(Sn)的宿主生物。对照是MRS培养基。可见，在感染后的21天，与仅喂以MRS的小鼠相比，喂以益生菌来源的饲料(活的或死的细菌、上清液)的小鼠的消化道肌肉具有明显降低的收缩张力。其数值接近于未感染小鼠的数值。结论这些结果导致结论益生菌能够使感染后的肠肌肉过度收缩状态正常化。换句话说，益生菌减少了胃肠道感染后持续的后遗症。这些效果因菌株而不同，在本实验中使用益生菌株副干酪乳杆菌(CNCMI-2116)产生最实质的效果，而选用于本实验的所有双岐杆菌菌株也呈现出这些效果。实验的整体结论是特定的益生菌株(如副干酪乳杆菌(CNCMI-2116))能够直接影响肌肉的收缩性。这一普遍性发现的结果是通过施用适当的益生菌，可以以一种一般性方式治愈、治疗和/或预防在个体的生命中许多情况下发生的胃肠道神经肌肉异常(消化道收缩)。异常的消化道收缩发生在遭受绞痛、消化道疼痛或消化道不适的婴儿、幼儿、青少年和成年人中，例如描述于IBS中的那些。异常的消化道收缩可能导致人和宠物发生消化道套叠，它们可能导致消化道鼓胀及不规则和不适当的通过肠的转运时间。可以作出结论在这些情况下，通过施用益生菌能达到一般的缓解效果。权利要求1.挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道疼痛或消化道不适的营养组合物或药物中的用途。2.挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道运动机能障碍的营养组合物或药物中的用途。3.挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造预防或治疗消化道神经肌肉异常的营养组合物或药物中的用途。4.挑选的益生菌或挑选的益生菌混合物在制造治疗或减少消化道感染后的后遗症的营养组合物或药物中的用途。5.根据权利要求1-3任一项的用途，其中消化道疼痛或不适、运动机能障碍或消化道神经肌肉异常是由病原体感染消化道引起的。6.根据前述权利要求中任一项的用途，其中挑选的益生菌是能够在小鼠模型中通过显著降低Th2释放的细胞因子来影响病原体诱导的免疫反应的益生菌。7.根据前述权利要求中任一项的用途，其中益生菌是能够在小鼠模型中通过显著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在纵行肠肌肌肉中的表达或浓度来影响病原体诱导的炎症的益生菌。8.根据前述权利要求中任一项的用途，其中挑选的益生菌是双岐杆菌。9.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中挑选的益生菌是副干酪乳杆菌。10.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中挑选的益生菌选自长双岐杆菌(CNCMI-2170)、乳酸双岐杆菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副干酪乳杆菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它们的混合物。11.根据前述权利要求中任一项的用途，其中益生菌包括死的益生细菌、发酵底物和/或益生菌来源物质。全文摘要本发明涉及在营养组合物或药物中使用益生菌来预防或治疗消化道神经肌肉异常。这类异常与例如婴儿绞痛、一般的消化道疼痛或消化道不适等有关。本发明具体涉及治疗或预防感染后的消化道神经肌肉异常。益生菌可以以活的或死的状态被施用，也可以直接使用发酵培养物的上清液来实现这里描述的有利效果。文档编号C12N1/20GK1678329SQ03820003公开日2005年10月5日申请日期2003年7月23日优先权日2002年7月23日发明者I·科尔蒂希杜拉,E·韦尔杜德贝尔希克,P·贝尔希克,S·M·柯林斯申请人:雀巢技术公司