专利名称：去除测序文库中的载体片段的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域。特别地，本发明提供了去除测序文库中的载体片段的方法。本发明还提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括利用基因组克隆文库构建测序文库，并且在对测序文库进行测序前去除测序文库中的载体片段。本发明还提供了可用于本发明的方法的试剂盒。
背景技术：
De nove测序法也称从头测序法，其不需要任何基因序列信息即可对某个物种的基因组进行测序。在测序后，用生物信息学的分析方法对测序获得的序列进行拼接、组装， 即可获得该物种的基因组序列图谱。使用Illumina公司的DNA测序平台进行De nove测序的方法主要分为以下四个步骤1，制备测序文库；2，用Cluster Station对样品进行扩增；3，对成簇后的样品进行测序；4，数据处理和拼接。根据测序的片段的大小，基于Illumina公司的DNA测序平台的测序文库制备分为小片段DNA的测序文库制备和大片段DNA的测序文库制备。为了解决非单倍体基因组序列杂合度过高、De novo测序序列拼接组装难度大的问题，目前通常采用以i^osmid克隆文库为模板构建DNA小片段测序文库的方法。建立 Fosmid克隆文库是指将某种生物的总DNA与R)Smid载体一起以重组的形式转移到宿主细胞中，然后通过细胞增殖形成多个克隆的整体。对于i^smid载体，可插入的基因组DNA片段的合适的长度为大约401Λ。构建R)smid小片段测序文库是指将一定数量的R)smid克隆混合到一起作为建库模板，然后采用以下步骤进行测序文库制备1、打断DNA到一定的片段大小；2、进行末端修复，S卩，利用T4 DNA聚合酶和Klenow聚合酶使DNA片段全部变成平末端，并采用T4 PNK (也称为T4多核苷酸激酶)将DNA片段的5'端磷酸化；3、利用无 3'到5'外切酶活性的Klenow聚合酶(也称为Klenow 3’-5’eX0_)在已进行末端修复的 DNA片段的3'端加上一个碱基“A”;4、用DNA连接酶将接头有方向性地加到DNA片段的两端，其中接头的核苷酸序列能与Solexa测序仪的flowcell上带有的寡核苷酸的序列互补； 5、将加了接头的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收一定大小的DNA片段，以除去未加到DNA片段上的接头，以及其他不符合片段大小的DNA片段；6、富集所有两端都加上接头的目的片段，使用针对接头的核苷酸序列的引物，通过PCR扩增所有加了接头的DNA ;7、纯化获得的PCR产物，从而建立测序文库。测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR检测确定浓度及片段大小合格后使用Solexa测序仪进行测序。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序的成本和时间大大降低，从而为研究新物种的全基因组序列提供了一个崭新的研究平台。然而，由于集中化商业性多物种基因组测序的大规模开展，使得我们迫切需要降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率， 以便能够更好的将测序方法应用到分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领域。
发明内容
除非另有定义，否则本文中所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了更好的理解本发明，特别提供了下列术语的定义。如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。 核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。可用于标记探针的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于，放射性同位素或核素，生物素，吖啶翁酯(acridinium ester)，polyA等。根据使用的标记物，相应的核酸分离和检测方法在本领域内也是已知的，包括但不限于， 羟基磷灰石(HAP)法和亲和吸附法。参见例如，Henegariu 0等人，(1999). "Custom fIuorescent-nucIeotide synthesis as an alternative method for nucleic acid labeling，，，Nature Biotechnology 18 :345-348 ；Ezaki T 等人，1989. Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization in which Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains. Int. J. ofSystemic Bacteriology 29(3) :224-229 ；和 Herrington C 等人，1998. PCR 3 :PCR in situ hybridization :a practical approach, Volume 3. Oxford Oxford University Press。本发明至少部分基于下述原理在对测序文库进行测序前，除去测序文库中用于构建基因组克隆文库的载体的片段可以避免浪费测序资源和产生不需要的测序数据，从而降低测序成本，提高测序效率。例如，当使用Solexa DNA测序仪对由R)smid克隆文库建立的测序文库进行测序时，由于在建库过程中对i^smid克隆进行了打断处理，R)smid载体也被打断成了许多11Λ 以下的小片段DNA，因而测序文库中包含有大量的R)smid载体片段，因此，如果对整个测序文库进行测序，那么将产生大量的不需要的载体序列数据，并且这些不需要的序列数据还将影响后续的数据分析。相比之下，如果在使用SolexaDNA测序仪对测序文库进行测序前， 将R)smid载体片段将去除，那么将可以避免对R)smid载体进行测序，减少不必要的数据读取及分析，从而显著降低测序成本，提高测序效率。因此，在一个方面，本发明提供了除去测序文库中的载体片段的方法，其包括步骤1)制备经标记的探针，所述探针能够与所述载体或其片段杂交；2)将所述探针与测序文库进行杂交反应，从而使探针与所述载体或其片段形成带标记的双链核酸；3)利用特异性结合探针上的标记的分子实体，去除步骤2)中形成的带标记的双链核酸，从而除去测序文库中的载体片段。在一个优选实施方案中，所述载体用于构建基因组克隆文库，并且优选是R)smid载体。在又一个优选实施方案中，探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素，例如链霉亲和素磁珠。在另一个优选实施方案中，将探针与测序文库进行液相杂交反应。在一个优选实施方案中，通过下列步骤制备生物素标记的探针1)使用生物素化的dNTP对载体进行PCR扩增，并纯化回收PCR产物；2)将PCR产物片段化并回收纯化，从而获得生物素标记的探针。在一个优选实施方案中，使用Covaris将PCR产物片段化。在另一个优选实施方案中，将PCR产物片段化为大约200bp-500bp的片段，例如大约300bp的片段。在一个优选实施方案中，通过在95°C下使探针与测序文库变性，然后在65°C下退火来进行杂交反应。在一个优选实施方案中，探针与测序文库以大约1 1至大约2 1 的比(按质量计)进行杂交反应。在一个优选实施方案中，任选地，在进行探针与测序文库的杂交之前，向测序文库中加入接头封闭剂(block)。如本文中所使用的，接头封闭剂是能够与测序文库构建过程中所使用的接头杂交的核酸。优选，接头封闭剂的核苷酸序列与接头的核苷酸序列完全互补。在进行探针与测序文库的杂交时，接头封闭剂与接头杂交，从而避免发生接头与探针的杂交以及接头间配对连接。在一个优选实施方案中，加入的接头封闭剂和文库的比例为大约0.3pM/ ng-0. 8pM/ng，例如0. 5pM/ng。当加入的接头封闭剂的量过大时，文库中的载体片段的去除效率会降低，然而当加入的接头封闭剂的量过少时，大量的非载体的文库DNA片段会被探针捕获而被去除。在一个优选实施方案中，杂交可以进行1，4，16，24或更多个小时。在另一个方面，本发明提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括1)利用基因组克隆文库构建测序文库，并除去测序文库中的载体片段；2)对去除载体片段后的测序文库进行测序。在一个优选实施方案中，所述基因组克隆文库是R)smid克隆文库，并且所述载体是R)smid载体。在一个优选实施方案中，使用根据本发明的方法来去除测序文库中的载体片段。在一个优选实施方案中，测序文库的构建包括以下步骤1)片段化基因组克隆文库中的DNA ；2)将接头连接至经片段化的DNA的两端；3) PCR扩增添加了接头的DNA，并回收纯化PCR产物，从而建立测序文库。在一个优选实施方案中，在构建测序文库后，除去测序文库中的载体片段。在另一个优选实施方案中，在构建测序文库的过程中，例如在片段化基因组克隆文库中的DNA后， 除去载体片段。在一个优选实施方案中，使用Solexa测序仪对测序文库进行测序。在另一个方面，本发明提供了用于基因组测序的试剂盒，所述试剂盒包括用于构建基因组克隆文库的载体，能够与所述载体或其片段杂交的经标记的探针以及能够特异性结合所述探针的标记的分子实体。
在一个优选实施方案中，所述载体是R)smid载体。在一个优选实施方案中，所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素， 例如链霉亲和素磁珠。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括其他试剂，包括但不限于，接头和接头封闭剂。发明的有益效果与现有技术相比，本发明的技术方案在对测序文库进行测序前，除去了测序文库中的载体片段，由此可以避免对载体进行测序(避免浪费测序资源)，避免产生不需要的测序数据，减少不必要的数据分析，从而降低测序成本，提高测序效率。这对于大规模开展集中化商业性多物种基因组测序，以及开发测序方法的新应用(例如，疾病诊断以及个性化医疗)具有重要的意义。下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
具体实施例方式在本发明的实施例中，使用的主要实验仪器及试剂具体如下。1、主要实验仪器。
权利要求
1.用于除去测序文库中的载体片段的方法，其包括步骤[1)制备经标记的探针，所述探针能够与所述载体或其片段杂交；[2)将所述探针与测序文库进行杂交反应，从而使探针与所述载体或其片段形成带标记的双链核酸；[3)利用特异性结合探针上的标记的分子实体，去除步骤2)中形成的带标记的双链核酸，从而除去测序文库中的载体片段。
2.权利要求1的方法，其中优选，所述载体是i^smid载体；优选，所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素，例如链霉亲和素磁珠；优选，将探针与测序文库进行液相杂交反应；优选，探针与测序文库以按质量计大约1 1至大约2 1的比进行杂交反应； 优选，在进行杂交反应前，向测序文库中加入接头封闭剂，并且优选接头封闭剂和文库的比例为大约 0. 3pM/ng-0. 8pM/ng，例如 0. 5pM/ng ；优选，杂交反应进行的时间为1，4，16，M或更多个小时。
3.用于对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括[1)利用基因组克隆文库构建测序文库，并除去测序文库中的载体片段；[2)对去除载体片段后的测序文库进行测序。
4.权利要求3的方法，其中，优选，所述基因组克隆文库是i^osmid克隆文库，并且所述载体是R)smid载体； 优选，使用权利要求1或2的方法来去除测序文库中的载体片段； 优选，通过下列步骤来构建测序文库(1)片段化基因组克隆文库中的DNA;(2)将接头连接至经片段化的DNA的两端；(3)PCR扩增添加了接头的DNA，并回收纯化PCR产物，从而建立测序文库；优选，在构建测序文库后，或在构建测序文库的过程中，例如在片段化基因组克隆文库中的DNA后，除去载体片段；优选，使用Solexa测序仪对测序文库进行测序。
5.用于基因组测序的试剂盒，所述试剂盒包括用于构建基因组克隆文库的载体，能够与所述载体或其片段杂交的经标记的探针以及能够特异性结合所述探针的标记的分子实体。
6.权利要求5的试剂盒，其中， 优选，所述载体是i^smid载体；优选，所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素，例如链霉亲和素磁珠；优选，所述试剂盒还包括其他试剂，例如，接头和接头封闭剂。
全文摘要
本发明提供了去除测序文库中的载体片段的方法。本发明还提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括利用基因组克隆文库构建测序文库，并且在对测序文库进行测序前去除测序文库中的载体片段。本发明还提供了可用于本发明的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102559856SQ20101060021
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者樊帆, 武靖华, 胡帅星, 赵美茹, 陈琳 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司