专利名称：带有腺相关病毒末端序列的基因载体及其应用的制作方法
一、技本领域本发明涉及一种新的基因治疗载体以及该基因载体用于刺激血管生长，达到治疗心血管疾病，肢体缺血，和外周血管梗塞的应用。
二、背景材料心血管疾病已经成为发达国家的头号疾病。根据美国心脏协会(AHA)一九九八年统计数据，美国现有一千四百万心脏病病人，美国每年用于治疗这些病人的费用超过两千五百亿美元。在这些心脏病病人中，冠心病人占了一大多半。这些冠心病病人由于心脏冠状动脉血管堵塞造成心肌缺血和坏死，出现心绞痛症状，严重时导致心力衰竭和死亡。目前对冠心病病人治疗除以药物暂时缓解症状外，严重的冠心病病人则需要进行冠状动脉搭桥手术或冠状动脉插管来疏通堵塞的冠状动脉，以增加心脏的供血量。这两种手术疗法能有效地缓解心肌缺血症状，且防止心脏病猝发和死亡。然而目前在国内只有极少数心脏专科医院才能实施这类手术，众多冠心病病人得不到及时治疗。随着生物工程和基因治疗高科技的发展，世界各国正在积极寻找新的治疗方法，利用各种能促进心血管生长的基因或蛋白质，刺激心脏微血管生长，从而在根本上解决冠心病病人心脏供血不足，达到长期满意的治疗效果。
在正常人体中，新血管生成只局限于伤口愈合和孕妇胎盘和胎儿发育。在冠状动脉堵塞，引起心肌缺血时，心脏本身会产生自然反应，引发冠状动脉细小分枝血管生长。最新研究表明，这些微血管生成难以满足心脏供血要求，但科研人员已经发现多种血管生长因子具有刺激细小分枝血管生长作用。这些促血管生长因子在体外和动物体内能有效地诱发心脏冠状动脉细小分枝血管生长，有效地防止心脏病猝发及死亡。然而在临床试验中，由于这些蛋白质分子半衰期很短，大剂量使用又有强烈的副作用，因而在临床开发中遇到极大阻碍。另一方面，美国几家科研机构利用基因治疗手段将血管内皮细胞生长因子(VEGF)，促微血管生长因子(Angiopoietin)，和成纤维细胞生长因子(FGF)等基因转入到心脏细胞中，从而在心脏细胞内合成这些生长因子，不仅提高局部微血管生长因子浓度，而且减少对其他器官的副作用，从而达到满意治疗效果(参见后面所列文献1)。这一发现在各种动物，包括大鼠，兔子，狗，和猪心肌缺血模型试验中得到验证(参见后面所列文献2，3，和4)。这方面的基因治疗研究开发工作已经成为目前心血管治疗研究领域的热门课题。
在临床应用时，医生可以以冠状动脉插管的方式将促血管生长因子基因转入到心脏血液循环系统中，医生也可以以心肌直接注射的方式将这些基因转入到心肌细胞中。后者需要在病人前胸进行一个很小的开胸手术，暴露一部分心脏，将促血管生长因子基因注射到心肌细胞中。这两种临床方案在美国都在二期临床应用中。当这些基因进入到心肌细胞后，心肌细胞会合成血管细胞生长因子，且将这种蛋白质分泌到细胞外，促进冠状动脉微血管的生长。
除应用在治疗冠心病外，促血管生长因子基因治疗产品亦可用于增加外周血管生长和促进伤口愈合。在动脉硬化病人中，经常存在下肢供血不足现象，影响病人的正常生活。促血管生长因子基因治疗同样可以刺激堵塞的下肢血管周围产生新的微血管，增加下肢供血，缓解病人症状，且可以防止病情恶化。在糖尿病病人和大面积烧伤病人中，伤口愈合十分困难。新血管生成能提供皮肤细胞生长必须的营养成分，从而促进伤口愈合。促血管生长因子基因治疗产品在这些病人身上也会有极好的治疗效果(参见后面所列文献5)。
目前有多种基因治疗载体可将治疗基因转移到目的组织中进行表达，产生相应的蛋白质。对于血管生长的基因治疗，目前采用的方法主要是腺病毒载体和裸体质粒载体。这两种载体都具有短期表达所携带的基因的功能。在目前的临床应用中，腺病毒载体因其转导率高，被广泛使用。然而因其制备复杂，易被具有复制功能的腺病毒污染，其使用的安全性和制备的简易性限制了其发展。裸体质粒载体具有制备简单，安全性高的优点，但其转导率很低，导致蛋白质表达量有时达不到刺激新血管生长作用。
发明内容
为解决上述问题，发明人对常规的裸体质粒载体进行了改造，在其中加入了腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)末端重复序列(InvertedTerminal Repeat，ITR)，并将促血管生长因子基因克隆在两个AAV ITR之间。我们所选择的治疗冠心病的基因治疗产品是血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。血管内皮细胞生长因子基因是1989年发现的一种细胞生长因子，在体外对血管内皮细胞生产具有特异的刺激作用。由于外显子的不同组合方式，VEGF基因有五个亚型，VEGF121，145，165，189，和206(参见后面所列文献6和7)。在血管内皮细胞生长因子刺激下，血管内皮细胞开始分裂和扩增，从原有的血管上形成发芽状细胞群。这些新生细胞经迁移和分化形成管状结构，与新生平滑肌一起形成新的微血管。AAV ITR具有启动子，增强子，和静显子的功能。在不同条件下，它能够增强外来基因表达，并给予外来基因表达组织特异性(参见后面所列文献8和9)。当AAV ITR与血管内皮细胞生长因子基因组合在一个质粒中时，我们的实验证明AAV ITR能够增加促血管生长因子基因的表达，并有更强的刺激血管内皮细胞生长的作用。这将为我们提供一个更简便的基因治疗心血管和下肢缺血症的手段。
四、附图简述
图1A是带有VEGF基因的质粒pVEGF145和带有腺相关病毒末端序列(AAVITR)和VEGF基因的pAVEGF145结构示意图。
图1B是质粒pVEGF145和pAVEGF145限制性内切酶图谱。
图2是对照质粒转导的细胞上清液和本发明质粒pAVEGF145转导的细胞上清液的WESTERN转移分析图。质粒pVEGF145和pAVEGF145均能表达VEGF145蛋白质。10微克质粒pEGFP-1(第二条带)、pVEGF145(第四条带)和pAVEGF(第三和第五条带)转导到293细胞后24小时，培养液换成无血清培养液，再经24小时培养，收集上清(第二和第三条带)或收集细胞，制备成裂解液(第四和第五条带)。经SDS-PAGE蛋白质电泳和WESTERN转移后，用VEGF特异性抗体显示VEGF蛋白质，MW代表分子量(kD)。第一条带为VEGF标准对照物。
图3是对照质粒pVEGF-N1、质粒pAVEGF145和pVEGF145转导的293细胞无血清上清液在不同稀释度下对HUVEC细胞生长的刺激作用图。质粒pAVEGF145和pVEGF145表达的VEGF具有刺激HUVEC细胞增殖的功能。10微克质粒pEGFP-1，pVEGF145和pAVEGF转导到293细胞后24小时，培养液换成无血清培养液。再经24小时培养，收集上清加入到培养在96孔板中的HUVEC细胞上。经72小时培养，利用MTS染色法，在OD490nm测量细胞密度。
图4A是对照质粒pEGFP-N和本发明质粒pAVEGF145转导的293细胞无血清上清液对HUVEC细胞迁移作用的显微镜下照相图。质粒pAVEGF145表达的VEGF具有刺激HUVEC细胞迁移的功能。10微克质粒pVEGF-N1(a)、pAVEGF145(b，c，和d)转导到293细胞后24小时，培养液换成无血清培养液。再经24小时培养，收集上清以1∶1(a和b)，1∶5(c)和1∶25(d)稀释度加入到培养在48孔带有化学吸附剂膜槽孔的载玻板中的HUVEC细胞上。经2小时培养后，将吸附在膜上的细胞在显微镜下照相。
图4B是对照质粒pEGFP-N和本发明质粒pAVEGF145转导的293细胞无血清上清液对HUVEC细胞迁移作用的显微镜下细胞计数统计图。质粒pAVEGF145表达的VEGF具有刺激HUVEC细胞迁移的功能。10微克对照质粒pVEGF-N1和pAVEGF145转导到293细胞后24小时，培养液换成无血清培养液。再经24小时培养，收集上清以1∶1，1∶5和1∶25稀释度加入到培养在48孔带有化学吸附剂膜槽孔的载玻板中的HUVEC细胞上。经2小时培养后，将吸附在膜上的细胞在显微镜下计数。图中数据为六个视野的平均值。
图5是用HUVEC增殖试验测量的质粒pAVEGF145和pVEGF145长期基因表达图。在不同时间将质粒pAVEGF145和pVEGF145转导的293细胞培养液换成无血清培养液，然后在下一天，收集无血清培养上清液。然后以1∶1或1∶10稀释，加入到培养在96孔板中的HUVEC细胞上，用MTS方法测定其刺激HUVEC细胞生长功能。
图6是质粒pVEGF145载体在细菌中的长期稳定性试验的结果图。将带有质粒pAVEGF145的细菌进行传代培养，然后用TAQMAN定量PCR法检测单一细菌内质粒拷贝数。
五、实验材料和方法质粒构建质粒pEGFP-N1是从Clontech公司购买，其中带有卡那霉素(KAN)抗性基因，CMV启动子带动绿色荧光蛋白质基因(GreenFluorescence Protein，GFP)，多聚腺瞟呤，和克隆位点。质粒pSub201带有AAV ITR和AAV全部基因序列。VEGF基因通过从HELA细胞中提取RNA，RT-PCR方法克隆。所用的引物序列如下5′端GGGAAGCTTGGATCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTT3′端GGGTCTAGAGGATCCCTCATTCATTCATCACCGCCTCGGCTTGTCACATACGCT引物5′端加入了Hind III和Bam H1克隆位点，引物3′端加入了Xba I和Bam H1克隆位点，以利于将来亚克隆。PCR产物先通过Bam H1位点克隆到pUC19质粒中。为将VEGF基因克隆到带有AAV ITR的质粒中，首先先构建了质粒pAVEGFPneo。其构建过程如下用限制性内切酶Ase I和Eco 01092切质粒pEGFP-N1，然后用KLWNOW补平，将CMV启动子，GFP基因，KAN/Neo基因部分与Xba I切过并补平的质粒pSub201中带有青霉素抗性(Amp)基因的部分相连接，组成质粒pAAVneo。为取出pAAVneo中的Amp基因，用Pvu II部分切pAAVneo，提取4.2kb片段，与Ase I和Eco 0109I切过并补平的质粒pEGFP-N1中pUC19复制起始位点(约650bp)相连接，组成质粒pAAVEGFPneo。质粒pAAVEGFPneo除在基因两侧带有AAV ITR外，与质粒pEGFP-N1完全相同。目的质粒pAVEGF121，pAVEGF145，和pAVEGF167分别带有VEGF基因121，145，和167。其构建过程为将质粒pAAVEGFPneo中EGFP基因(Bam H1/Not I酶切，补平)用克隆在pUC19中的VEGF基因(Hind III/Eco R1酶切，补平)所取代。目的质粒pEGFP012，pEGFP014，和pEGFP016分别带有VEGF基因121，145，和167。其构建过程为将质粒pEGFP-N1中EGFP基因(Bam H1/Not I酶切，补平)用克隆在pUC19中的VEGF基因(Hind III/Eco R1酶切，补平)所取代。细胞人类293细胞由ATCC获得。HUVEC细胞，人类脐带血管上皮细胞由Clonetech获得。这些细胞培养条件是37℃，5％CO2恒温细胞培养箱。细胞在临使用前一天用胰蛋白酶处理，接种到六孔板或二十四孔板中，第二天使用。基因表达检测实验头一天将1×106293细胞培养在10厘米细胞培养皿中，实验时将10微克各种质粒DNA以磷酸钙沉淀的方式转导到细胞293中。四小时后来更换新鲜培养液。第二天将培养液换成无血清培养液。实验第四天收集细胞上清，并用1毫升PBS收集细胞，准备细胞裂解液，经离心后，保存上清，与细胞培养上海清液一道进行SDS-PAGE蛋白质电泳和WESTERN转移分析，以及ELISA检测。HUVEC细胞增殖实验实验头一天将1000个HUVEC细胞培养在96孔板中。实验时将培养液换成无血清培养液，同时加入10微升各种测试样品，让细胞在无血清培养液中再培养72小时，然后用MTS在37℃染色1小时，测量OD490纳米的方法(PEOMEGA)来确定细胞生长密度。HUVEC细胞迁移实验先将25微升测试样品放在48孔带有化学吸附剂膜槽孔的载玻板上，小心放上能吸附细胞的多聚碳化膜，然后将槽孔放好，装入8000悬浮在0.1％血清中的HUVEC细胞，培养2小时后，取掉槽孔，头小心将多聚碳化膜取出，依次放在细胞固定液，染色液中，经空气干燥后，将有细胞的一面放在新的载玻板上，在显微镜下数吸附的细胞数目。六、实验结果VEGF基因克隆和表达利用RT-PCR，以HELA细胞RNA为模板，我们得到两个PCR产物，大小约为460bp和530bp，相当于VEGF121和VEGF145(结果在案)。将这两个PCR产物克隆到pEGFP-N1中，分别得到质粒pVEGF12和pVEGF145。将这两个PCR产物克隆到pAVEGFPneo中，分别得到质粒pAVEGF121和pAVEGF145。经DNA测序分析后，发现pVEGF12和pAVEGF121中VEGF序列与VEGF121完全相同；pVEGF145和pAVEGF145中VEGF序列与VEGF145完全相同。为简便起见，以下实验只用pVEGF145和pAVEGF145。图1A是质粒pVEGF145和pAVEGF145结构示意图。
根据DNA质粒序列，用下列内切酶对质粒pVEGF145进行了分析；Bge II(0)，Bst X1(0)，EcoR V(0)，HinC II(3)，Hind III(1)，Kpn I(1)，Pst I(2)，Pvu II(2)，Sal I(2)，Sma I(1)，和Sph I(3)。酶切结果(图1B)与已知序列完全一致，表明克隆过程没有错误。
根据DNA质粒序列，用下列内切酶对质粒pAVEGF145进行了分析Not I(0)，Bst X1(0)，EcoR V(0)，HinC II(3)，Hind III(1)，Kpn I(1)，Pst I(2)，Pvu II(2)，Sal I(2)，Sma I(5)，和Sph I(3)，酶切结果(图1B)与已知序列完成一致，表明克隆过程没有错误。其中每个AAV ITR中有两个Sma I位点，Sma I酶切表明有两个AAV ITR在质粒pAVEGF145中。
为确认AAV ITR的功能，我们测试了质粒pAVEGF145形成重组AAV病毒的能力。当与质粒pAAV/Ad一起转导到293细胞中，在有腺病毒存在的情况下，质粒pAVEGF145能产生带有VEGF的AAV病毒(数据备案)，证明质粒pAVEGF145中AAV ITR是有功能的。
为确认质粒pAVEGF145和质粒pVEGF145能表达VEGF145蛋白质，我们将这两个质粒转导到293细胞中，然后将细胞无血清上清液和细胞裂解液进行蛋白质分析。图2是WESTERN转移分析图。其中MW是蛋白质分子量标准；第一条带是VEGF标准对照物；第二条带是对照质粒转导的细胞上清液；第三条带是质粒pAVEGF145转导的细胞上清液；第四，和第五条带分别是质粒pVEGF145和pAVEGF145转导的细胞裂解液。从图2中可以看出，正常条件下，293细胞中VEGF产生量极少，质粒pAVEGF145和质粒pVEGF145均能产生一定量的VEGF145，同时这些VEGF能被分泌到细胞外。ELISA分析也确定了这一点。表达的VEGF功能测定为确认从质粒pAVEGF145和质粒pVEGF145表达VEGF145蛋白质具有刺激HUVEC细胞生长和迁移的功能，我们进行了HUVEC细胞生长和迁移实验。
首先将质粒pEGFP-N1，pAVEGF145和pVEGF145转导的细胞无血清上清液以1∶5，1∶25，和1∶125稀释后，分别加入到培养在96孔板中的HUVEC细胞中，在无血清培养条件下生长72小时，然后进行细胞密度染色分析。图3表明，在无血清条件下，对照质粒pEGFP-N1转导的细胞无血清上清液对HUVEC细胞生长没有影响，而质粒pAVEGF145和pVEGF145转导的细胞无血清上清液在不同的稀释度下对HUVEC细胞生长都有促进用。
利用可吸附细胞的多聚碳化膜和细胞培养槽，我们进行了HUVEC细胞迁移实验。将质粒pEGFP-N1，pAVEGF145和pVEGF145转导的293细胞无血清上清液以不同浓度稀释后加入槽中，放上槽以后，再加入HUVEC细胞。如果测试样品对HUVEC细胞迁移有刺激作用，HUVEC细胞就会吸附到膜上。测量膜上细胞数目(取六个视野内平均值)，即可测出样品中是否有能刺激HUVEC细胞迁移的物质，在此条件下，为VEGF蛋白质。
如图4A和4B中显示，对照质粒pEGFP-N转导的293细胞无血清上清液(1∶1稀释)对细胞迁移没有影响(图4-AA)；质粒pAVEGF145转导的293细胞无血清上清液在不同稀释度，1∶1(4-AB)，1∶5(4-AC)，和1∶25(4-AD)都能刺激HUVEC细胞迁移。表明质粒pAVEGF145转导的293细胞无血清上清液含有有功能的VEGF蛋白质。AAV ITR能帮助质粒中VEGF基因长期表达为确定质粒pAVEGF145中AAV ITR对VEGF基因表达有促进作用，我们进行了长期基因表达实验，在此实验中，我们维持被转导的细胞不断生长，在其长到覆盖整个培养皿时，用胰蛋白酶处理，以1∶5稀释，放到新的培养皿中。在不同时间，第1，4，7，11，16，21，27，和36天时，将培养液换成无血清培养液，然后在下一天，第2，5，8，12，17，22，28，和37天时，收集无血清培养上清液，冰冻保存(-70℃)。然后以1∶1或1∶10稀释，加入到培养在96孔板中的HUVEC细胞上，测定其刺激HUVEC细胞生长功能。
如图5所列，质粒pAVEGF145和质粒pVEGF145表达的VEGF145蛋白质在第五天达到高峰，随后下降。质粒pVEGF145转导的293细胞无血清上清液在第22天时几乎没有刺激HUVEC细胞生长的作用，表明VEGF表达已经停止。而质粒pAVEGF145转导的293细胞无血清上清液在第37天时仍有刺激HUVEC细胞生长作用，表明VEGF表达仍维持在一定浓度。这个实验证明了在质粒pAVEGF145中的AAV ITR对VEGF基因长期表达有明显促进作用。AAV ITR能在细菌内稳定存在由于在VEGF基因表达质粒中加入了AAV ITR，而AAV ITR在某些质粒中由于潜在的重组倾向，会引起目的基因的不稳定。我们对这种可能性进行了验证。首先我们将带有质粒pAVEGF145的细菌进行传代培养，然后检测单一细菌内质粒拷贝数。检测方法如下取一百万细菌，用硷裂解法裂解细胞，以醋酸钠中和后，离心取上清液。经解释1000倍，用TAQMAN定量DNA分析方法来测定VEGF质粒拷贝数。
从图6可以看出，细菌内VEGF基因质粒拷贝数在30代内没有明显变化，在325-1050之间，平均为590。这个实验表明AAV ITR并不影响质粒中VEGF基因的稳定性。
长期以来，AAV作为一种非自发性复制的病毒载体因其独特的AAV ITR序列，已被开发成一种有效、并可长期表达外源基因的病毒载体(参见后面所列文献10)。虽然人们用很大精力来改进AAV病毒载体生产过程，但目前如何有效生产大规模可供临床应用的AAV载体仍然是商业化应用中的一个难题。为充分利用AAV ITR具有的促进长期基因表达的功能，本发明将AAVITR克隆在VEGF基因两端，证明了AAV ITR确实具有延长VEGF表达的功能，而且其在细菌宿主中具有极好的稳定性。由于大量制备高纯度，确可应用于临床的DNA质粒载体技术已经成熟，这一发现将有利于提高VEGF表达效率，能够提前将有利于血管生长的VEGF基因治疗产品推入有效临床使用。这一结果亦可被推广到其它基因表达系统，从而提高潜在质粒载体的表达效率和未来治疗效果。
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权利要求
1.一种DNA质粒载体，其特征在于它带有腺相关病毒末端重复序列(AAV ITR)。
2.根据权利要求1的质粒载体，包括裸体质粒和腺相关病毒末端重复序列(AAV ITR)
3.权利要求1或2所要求的DNA质粒载体，它还带有血管生长刺激因子基因。
4.权利要求3所要求的DNA质粒载体，其中血管生长刺激因子基因为VEGF基因。
5.权利要求1-4中任一项的DNA质粒载体，其特征在于所述载体内有一个或两个腺相关病毒末端重复序列(AAV ITR)。
6.权利要求1-4中任一项的DNA质粒载体，其特征在于所述载体内腺相关病毒末端重复序列(AAV ITR)位于载体基因的两端或位于载体基因的一端。
7.权利要求4的DNA质粒载体，其特征在于它能够表达VEGF。
8.权利要求1-4中任一项的DNA质粒载体用于增强外源基因表达的应用。
9.权利要求3的DNA质粒载体用于转导血管生长刺激因子以作为治疗心血管疾病、肢体缺血或外周血管梗塞的基因药物的应用。
10.权利要求4的DNA质粒载体用于转导血管内皮生长因子以作为治疗心血管疾病、肢体缺血或外周血管梗塞的基因药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的基因治疗载体以及该基因治疗载体用于转导血管生长刺激因子来刺激血管生长,达到治疗心血管疾病,肢体缺血,和外周血管梗塞的应用。
文档编号A61P9/00GK1339604SQ0114212
公开日2002年3月13日 申请日期2001年9月13日 优先权日2001年9月13日
发明者杨启成 申请人:杨启成