专利名称：小鼠生精细胞分化相关基因的制作方法
生殖系统是生物种族得以延续的基础，受精则是单倍体精子与卵子相互结合而启动新生命发育的过程，而配子发生的正常进行为受精过程提供了物质基础。人睾丸每天要产生数以十亿计的精子细胞，如此艰巨的任务必须依赖于高效的细胞复制和精确的细胞分化的有机协调，精子发生过程正是这样的一个在时间和空间上高度协调的多细胞相互作用的复杂过程。从原始生殖细胞到成熟精子的分化依赖于大量睾丸特异和发育阶段特异基因的表达，这些差异表达的基因控制了精子发生过程中一系列重要的生物学事件，包括减数分裂、同源重组、单倍体基因表达、顶体形成、组蛋白的去除、鱼精蛋白的置换、核浓缩、尾巴形成、连续的有丝分裂及细胞程序化死亡等。这些事件的任何环节发生问题都可能影响精子发生的正常进行，甚至导致雄性不育。已经发现许多雄性不育疾病的发生是由于维持精子细胞分化的基因变化而造成的。因此克隆与生精细胞分化相关的基因并对其功能进行研究对于认识精子发生的生理、病理过程，寻找新的针对雄性生殖系统疾病的诊断、治疗方法有重要的意义。
本发明的内容是应用mRNA差异显示、5’RACE、分子克隆、DNA测序等技术，克隆雄性生殖系统特异表达基因Peat，通过生物信息学手段对基因和所编码蛋白的结构特征进行分析，并用Northern杂交技术对其表达特征进行了研究。
该基因达到的技术指标为1.小鼠Peat全长cDNA为1909bp，含一个1623bp的完整开放阅读框架，编码541个氨基酸，其全长cDNA和编码氨基酸见
图1和图2。
2.小鼠Peat基因编码蛋白含有大量的磷酸化位点，含有一核定位信号，170-249和483-525氨基酸与Pfam数据库中VIT1_FUNHE蛋白的PfamB-2结构域分别有41％和45％的一致性，其中富含丝氨酸(图3)；234-272氨基酸与典型的核糖核酸酶结构域的氨基酸一致性为34.2％，同源氨基酸残基达到76.3％(图4)；在人中存在Peat的同源基因，位于人4号染色体上，其中一个人cDNA(Genbank登录号AB037851)所编码蛋白与小鼠Peat基因编码蛋白的同源性为64％(图5)。
3.小鼠Peat基因在生精过程中呈现出组织特异性和发育阶段特异性表达。Northern杂交显示Peat基因包含至少两个转录本，大小分别约为6.5和2.0kb，2.0kb的转录本主要在小鼠睾丸表达(图6，图7)；而两个转录本均在生精过程表现为差异表达(图8)。
本项发明的优点一般来说，在某种组织器官特异表达的基因对于维持这种组织器官的功能有重要作用。我们所克隆的新基因Peat在睾丸组织特异表达，而且在生精过程中表现为差异表达，可能对于生精细胞的正常分化具有重要的作用。该基因的克隆及表达特征分析为进一步研究其功能，包括今后在疾病诊断与治疗上的应用奠定了基础。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图2、Peat cDNA的全编码区与氨基酸序列。
图3、Peat基因编码蛋白与Pfam数据库中VIT1_FUNHE蛋白PfamB-2结构域同源性比较。
一致的氨基酸残基用小写字母表示，而保守的氨基酸用“+”表示，短横“-”表示为了达到最好的对齐效果，所引入的间隔。
图4、Peat基因编码蛋白与Pfam数据库中典型核糖核酸酶结构域的同源性比较。
一致的氨基酸残基用小写字母表示，而保守的氨基酸用“+”表示，短横“-”表示为了达到最好的对齐效果，所引入的间隔。
图5、人和小鼠Peat基因所编码蛋白的同源性比较。
一致的氨基酸用反白的字体表示，用短杠“-”表示缺失或间隔的氨基酸。
图6、Peat基因在八种成年小鼠组织中表达的Northern杂交分析。
用提取的组织总RNA进行杂交。1.脾；2.肺；3.心；4.脑；5.肾；6.肝；7.卵巢；8.睾丸；箭头指示两个杂交条带。
图7、Peat基因在八种成年小鼠组织中表达的Northern杂交分析。
用商品化的小鼠多组织杂交膜进行杂交。1.心；2.脑；3.脾；4.肺；5.肝；6.骨骼肌；7.肾；8.睾丸；箭头指示6.5和2.0kb两个杂交条带。
图8、Peat基因在不同发育阶段睾丸中表达的Northern杂交分析。
10、20、30、40、50和60分别代表所用睾丸的小鼠日龄；箭头指示两个杂交条带。
实施例1Peat基因的克隆及序列测定在小鼠精子发生的第一轮生精波中，不同类型的生精细胞在小鼠出生后的不同阶段开始出现，根据某一基因开始表达时小鼠的日龄可间接推测该基因可能表达的生精细胞类型。为了克隆主要在小鼠单倍体球形精子细胞表达的基因，我们用mRNA差异显示方法对16天和60天小鼠睾丸的mRNA差异情况进行了分析。
用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取16和60天小鼠睾丸总RNA。用Reverse TranscriptionSystem试剂盒(购自Promega)将大约0.2μg总RNA逆转录形成cDNA，其中反转录引物为T12CG。按照标准的mRNA差异显示方法，以T12CG和Operon公司的H系列随机引物为扩增引物，用Promega公司的PCR扩增引物对得到的单链cDNA进行扩增，扩增产物在8％的聚丙烯酰胺变性凝胶上进行电泳，放射自显影。从凝胶上回收主要在60天小鼠睾丸表达的一个条带，经再次PCR扩增，对扩增产物进行纯化后，用Promega公司的pGEM-T载体系统进行克隆，转化JM109菌珠。从转化平板上挑取阳性菌落，抽提质粒，酶切鉴定插入片段的大小。用双脱氧法测定插入片段的序列，然后登录到Genbank(登录号为AW584047)。
利用上述得到的测序结果，设计合适的引物，用5’RACE方法对该基因片段的全长cDNA序列进行扩增。将得到的扩增产物从琼脂糖凝胶上进行回收纯化，克隆到pGEM-T载体上，酶切鉴定后进行测序。将该序列与上述的差异片段进行拼接后，得到一全长为1909bp的cDNA(图1)，考虑到其表达特征，将其命名为Peat(predominantly expressed in adult testis)。
实施例2用生物信息学技术分析Peat基因编码蛋白的结构特征用Translate蛋白翻译软件对上述得到的cDNA进行翻译，发现从第133bp至1754bp有一个1621bp的开放阅读框架，编码一含541个氨基酸的蛋白(图2)。用Psort软件分析发现484-490氨基酸为一核定位信号。用ProfileScan程序对Pfam蛋白家族数据库的比较发现170-249和483-525氨基酸与Pfam数据库中VIT1_FUNHE蛋白的PfamB-2结构域分别有41％和45％的一致性，其中富含丝氨酸(图3)；234-272氨基酸与典型的核糖核酸酶结构域的氨基酸一致性为34.2％，同源氨基酸残基达到76.3％(图4)；该蛋白含有大量的潜在磷酸化位点，提示该蛋白可能同VIT1_FUNHE蛋白类似，属于高度磷酸化蛋白。在NCBI Blast服务器上用blastn、blastp和blastx程序对Genbank数据库的相似性比较发现，在数据库中存在大量的同源EST或cDNA，但关于序列的结构或表达特征没有深入分析，其中一个cDNA(Genbank登录号AB037851)所编码蛋白与小鼠Peat基因编码蛋白的同源性为64％(图5)。这些信息说明我们克隆的Peat基因编码一新的蛋白，该蛋白可能为一高度磷酸化的核蛋白。
实施例3Peat基因在不同组织的表达分布为了检测Peat基因在不同组织的表达分布，用mRNA差异显示得到的cDNA片段(Genbank登录号AW584047)作为探针，对来自睾丸、肝、肾、脾、心、肺、脑和卵巢的总RNA进行了Northern杂交。其具体步骤包括组织总RNA的提取、乙二醛-DMSO变性电泳、转膜、预杂交、杂交、洗膜、压片和放射自显影等。结果显示，除了可以在睾丸组织检测到明显的杂交信号外，在其它七种组织检测不到明显的杂交信号(图6)。
为了进一步确定Peat基因的不同拼接形式及不同转录本的大小，用相同的探针对购自Clontech公司的小鼠多组织杂交膜进行杂交，结果发现，在检测的八种组织中均可检测到一大小约6.5kb的转录本，该转录本在睾丸中的表达量显著高于其它七种组织(图7)。此外，在睾丸中还可检测到一大小约2.0kb的片段，在其它组织则检测不到，说明为睾丸特异的转录本，其大小与我们所克隆的cDNA大小相符合。在精子发生中存在大量的选择性拼接现象，导致在生精细胞中表达大量区别于体细胞的转录本，在生精细胞中发挥特异的功能。因此，2.0kb的Peat转录本在精子发生中可能发挥特异的功能。实施例4Peat基因在不同发育阶段睾丸中的表达分析为了检测Peat基因在不同发育阶段睾丸中的表达特征，分别选用10、20、30、40、50和60日龄的小鼠睾丸提取总RNA，按照实施例3中描述的程序，进行Northern杂交，结果见图8。从中可以看出，Peat基因转录本在10日龄小鼠睾丸几乎检测不到杂交信号，而在20日龄已有很强的杂交信号，并且一直持续表达下去。这种表达特征暗示，Peat基因主要在减数分裂或减数分裂后期的睾丸细胞中表达，可能参与了减数分裂或减数分裂后期生精细胞的特异分化事件。
权利要求
1.本发明涉及一小鼠睾丸特异表达的基因Peat，其特征在于互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长1909bp，含一个1623bp的完整开放阅读框架，编码541个氨基酸，分子量为60.8kD的蛋白质。
2.根据权利要求1所述之睾丸特异表达的基因Peat，其特征在于所编码蛋白484-490氨基酸为一核定位信号，丝氨酸含量非常高(14.2％)，含有大量的磷酸化位点，234-272氨基酸与典型的核酸酶有一定的同源性。
3.根据权利要求1所述之睾丸特异表达的基因Peat，其特征在于在不同的组织含有6.5kb和2.0kb两个不同大小的转录本，其中大小约2.0kb的转录本在睾丸组织特异表达，而且这两个转录本在生精过程均表现为差异表达。
4.根据权利要求1、2、3所述之睾丸特异表达的基因Peat，其特征在于可用于雄性生殖系统疾病的基因诊断、基因治疗和药物治疗，也可用于筛选药物。
全文摘要
本发明涉及一个新的小鼠睾丸特异表达基因(Peat)，包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因在睾丸组织特异表达，并且在精子发生过程中呈现、出差异表达，在生精细胞的正常分化及某些雄性生殖系统疾病的发生过程中可能具有重要的作用。
文档编号A61K48/00GK1408869SQ0114188
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月18日 优先权日2001年9月18日
发明者王天奇, 黄秀英, 孙方臻 申请人:中国科学院发育生物学研究所