专利名称：新型dna片段与含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产重组蛋白质的、具有调节转录的碱基序列与编码信号肽的碱 基序列的DNA片段和含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应 用。需要说明的是，作为相关申请的相互参考，本申请要求2007年7月13日提出的日本专 利申请2007-183934号的优先权，其全部记载作为公开特别援引于此。
背景技术：
随着近年来遗传工程学的进步，能利用各种生物体作为宿主细胞生产蛋白质。特 别是熟知将含有外来基因的重组载体导入宿主细胞的宿主_载体系统。如果使用宿主_载 体系统，则可以在不将外来基因插入宿主细胞的染色体的情况下获得重组蛋白质。作为宿主-载体系统中的宿主细胞而广泛使用的是大肠杆菌(Escherichia coil)(例如参见日本专利2988951号公报以及作为其同族专利的欧州0441361号公报与美 国5304471号公报(以下，有时将它们称为专利文献1)，上述专利的全部记载作为公开特别 援引于此)。大肠杆菌中，传代时间短至约为20分钟，可以将各种糖类同化并增殖。并且， 正在开发适合大肠杆菌的大量质粒载体，以大肠杆菌为宿主细胞的宿主-载体系统实现重 组蛋白质的迅速且稳定的工业生产。但是，由于大肠杆菌的在菌体内蓄积重组蛋白质的性质，存在下述对于大量且稳 定生产重组蛋白质不利的方面抑制大肠杆菌本身的生育，并且在菌体内的蛋白质分解酶 (蛋白酶)的作用下，重组蛋白质的功能容易丧失。并且，为了获得重组蛋白质而必须将菌 体回收，破碎，并且非常小心翼翼地除去作为发热性物质之一的脂多糖。因此，也产生了导 致用于收集 纯化重组蛋白质的工序变复杂的问题。为此，为了解决上述问题，目前为止正研究利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的宿主-载体系统。枯草芽孢杆菌的传代时间约为30分钟，与大肠杆菌基本相 同，能将蛋白质分泌到菌体外，并且不含有脂多糖作为菌体构成成分。因此，若与使用大肠 杆菌的宿主_载体系统相比较，使用枯草芽孢杆菌的宿主_载体系统具有可以大量且稳定 地生产重组蛋白质，并且可以容易地收集 纯化重组蛋白质的优点。例如，作为利用以上述枯草芽孢杆菌为宿主的宿主_载体系统生产重组蛋白质的 例子，报导了将来自化脓性链球菌(StreptococcuspyoRenes)株的链丝菌素0基因导入 表达载体，利用所得的重组载体转化枯草芽孢杆菌，由此可以由培养上清液得到链丝菌素 0(参见日本特开平05-184372号公报(以下，有时也称为专利文献2)，其全部记载作为公 开特别援引于此)。
发明内容
发明所需解决的课题但是，根据本发明人的研究，在使用枯草芽孢杆菌的宿主-载体系统中，根据重组蛋白质的种类，有时重组载体上的调节转录的碱基序列(以下称为“基因调节区域”)基于 某种原因而不能正常发挥功能。为此，明确了存在抑制重组蛋白质表达的问题。另外，还 明确了即使基因调节区域正常发挥功能，在编码信号肽的碱基序列(以下称为“信号肽基 因”)不发挥功能，或者基因调节区域与信号肽基因的组合不适当的情况下，也存在重组蛋 白质以容易受到蛋白酶等的分解的状态残留在细胞内或细胞膜内等问题。为此，明白了解决上述问题的宿主-载体系统的确立对于以枯草芽孢杆菌为宿主 生产重组蛋白质是必须的，所述宿主-载体系统可以与重组蛋白质种类无关地大量表达重 组蛋白质基因并有效分泌到细胞外。因此，本发明的第一目的在于提供在以枯草芽孢杆菌为宿主的系统中，可以与重 组蛋白质的种类无关地大量且有效生产蛋白质的新方法。更具体而言，在于提供可以与重 组蛋白质的种类无关地大量表达重组蛋白质的含有基因调节区域的DNA片段。此外，还在 于提供可以有效地将重组蛋白质分泌到细胞外的含有基因调节区域与信号肽基因的组合 的DNA片段。并且，还在于提供使编码重组蛋白质的碱基序列(以下，称为“重组蛋白质基 因”)连接于基因调节区域或基因调节区域与信号肽基因的下游而得到的DNA片段。本发明的第二目的在于提供含有上述DNA片段的重组载体、利用它们转化的转化 体以及利用它们的重组蛋白质的制备方法。用于解决课题的手段本申请发明人进行了潜心研究，结果克隆了保藏号为FERM AP-20227的芽孢杆菌 TAMB750 (Bacillus sp. JAMB750)株所具有的基因调节区域。进而，为了提高信号肽的分泌 性能，重新设计了信号肽。其结果是，发现如果在含有它们的DNA片段的下游结合重组蛋白 质的结构基因，将其插入于适当的载体后导入枯草芽孢杆菌，则可以与蛋白质的种类无关 地大量生产该重组蛋白质并且有效地分泌到细胞外，从而完成本发明。S卩，根据本发明，能提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下游 的基因的表达的DNA片段。(a)序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列中，缺 失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由序列表的SEQ IDN0 1或2所记载的碱 基序列和与其互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交。进而，根据本发明，能提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下 游的基因的表达并且将该基因的基因产物分泌到细胞外的DNA片段。(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序列与直接 或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列的碱基序列中，缺失、置换、倒位或 添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构 成的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基 序列与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列。
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进而，根据本发明，提供含有下述(a)-(c)的任一碱基序列、能促进存在于其下游 的基因的表达并且将该基因的基因产物分泌到细胞外的DNA片段。(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序列与直接 或间接地连接于其下游的编码SEQ ID NO 3所记载的氨基酸序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码SEQ IDN0 3所记载的氨基酸序列的碱基序列的碱基 序列中，缺失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构 成的DNA在严格条件下杂交，所述碱基包含序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列 与直接或间接地连接于其下游的编码SEQ ID NO :3所记载的氨基酸序列的碱基序列。进而，根据本发明，能提供含有上述含基因调节区域的本发明DNA片段的碱基序 列与直接或间接地连接于其下游的编码重组蛋白质的碱基序列的DNA片段、以及含有上述 含基因调节区域与肽基因的本发明DNA片段的碱基序列与直接连接于其下游的编码重组 蛋白质的碱基序列的DNA片段。优选上述重组蛋白质是选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、异构 酶、合成酶与修饰酶的1种酶。并且，根据本发明，能提供含有本发明DNA片段的重组载体。优选上述重组载体是质粒、噬菌体或逆转录转座子。进而根据本发明，能提供由下述宿主(a)或(b)构成的转化体。(a)转导了上述本发明的DNA片段的宿主；或(b)含有上述本发明的重组载体的宿主。优选上述宿主是微生物，较优选为革兰氏阳性细菌，更优选为属于芽孢杆菌属的 微生物。进而，根据本发明，能提供包括下述工序(a)与(b)的重组蛋白质的制备方法。(a)上述本发明的转化体的培养工序；与(b)该重组蛋白质的收集工序。优选重组蛋白质是选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、异构酶、 合成酶与修饰酶的1种酶。进而，根据本发明，能提供用于本发明重组蛋白质的制备方法的上述本发明的转 化体。进而，根据本发明，能提供用于制备重组蛋白质的上述DNA片段的应用。进而，根据本发明，能提供用于制备重组蛋白质的上述重组载体的应用。进而，根据本发明，能提供用于制备重组蛋白质的上述转化体的应用。
具体实施例方式以下，详细说明本发明的实施方案。(A)本发明的DNA片段本发明的DNA片段是下述片段含有基因调节区域的DNA片段，含有基因调节区域 与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因的DNA片段，含有基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的重组蛋白质基因的DNA片段，以及含有基因调节区域、直接或间接地连 接于其下游的信号肽基因与直接连接于其下游的重组蛋白质基因的DNA片段。本说明书所谓的“能促进存在于其下游的基因的表达”是指能提高位于基因调节 区域的3’末端侧的基因的转录效率、促进基因产物的表达的作用。本发明的含有基因调节区域的DNA片段是含有序列表的SEQID NO :1或2所记载 的碱基序列的DNA片段。含有SEQ ID NO :1所记载的碱基序列的DNA片段可以用例如实施 例2所示的方法由芽孢杆菌JAMB750株的染色体DNA获得。另一方面，含有SEQ IDN0:2所 记载的碱基序列的DNA片段可以用例如实施例5所示的方法在SEQ ID NO :1所记载的碱基 序列中导入随机变异来获得。作为获得含有本发明的基因调节区域的DNA片段的其他方法，例如可以基于序列 表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列的信息，由化学合成、基因工程学的方法或突变诱 发等公知的任意方法来制作。例如，将含有本发明的基因调节区域的DNA片段插入表达载体中来转化作为宿主 的枯草芽孢杆菌或将所述DNA片段直接插入枯草芽孢杆菌的染色体进行转化，由此活化存 在于其下游的蛋白质基因的转录，促进蛋白质的表达。本说明书中所谓的“具有1个至多个碱基的缺失、置换、倒位、添加和/或插入的碱 基序列”中的“1个至多个”的范围没有特别限定，例如，是指1个至40个，优选为1个至30 个，较优选为1个至20个，更优选为1个至9个，特别优选为1个至5个，最优选为1个至3 个左右。另外，所谓“碱基的缺失”是指序列中的碱基脱落或消失，“碱基的置换”是指序列 中的碱基被置换为其他碱基，“碱基的倒位”是指彼此相邻的2个以上碱基的位置逆转，“碱 基的添加”是指碱基被添加，“碱基的插入”是指在序列中的碱基间插入其他碱基。本说明书中所谓的“在严格条件下杂交”是指将DNA用作探针，通过使用菌落杂交 法、噬菌斑杂交法或DNA印迹杂交法等得到的DNA的碱基序列，例如，可以举出可以通过如 下方法鉴定的DNA等使用来自菌落或噬菌斑的DNA或将该DNA的片段固定化的过滤器， 在0. 7-1.0M的NaCl存在下，在65 °C下进行杂交后，使用0. 1-2XSSC溶液(1XSSC溶液 是150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65°C条件下清洗过滤器。杂交可以基于Molecular Cloning :Alaboratory Mannual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, NY. ,1989 ^ Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John ffiley&Sons (1987-1997)等文献记载的方法进行。需要说明的是，该文献的全部记载作为公 开特别援引于此。作为在严格条件下进行杂交的DNA，可以举出与用作探针的DNA的碱基序列具有 一定以上同源性的DNA，例如可以举出具有70%以上、优选80%以上、较优选90%以上、更 优选93 %以上、特别优选95 %以上、最优选98 %以上的同源性的DNA。本说明书中所谓的“信号肽”是指添加在存在于编码信号肽的碱基序列下游的基 因之基因产物的氨基末端，能将基因产物分泌至细胞外的肽。另外，所谓“能将基因产物分 泌至细胞外”是指，如上所述，信号肽添加在作为基因产物的重组蛋白质的氨基末端侧，引 导重组蛋白质在小胞体膜上的附着和膜通过等，最终将重组蛋白质分泌至细胞外的作用。本说明书所谓的“序列表的SEQ ID N0 :1或2所记载的碱基序列与直接或间接连 接于其下游”是指序列表的SEQ ID NO :1或2所记载的碱基序列与经由0-1000左右的碱基连接于该碱基序列的3’末端侧。包含本发明的基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因的DNA 片段是含有上述基因调节区域与经由0-1000左右的碱基连接的信号肽基因的DNA片段，优 选含有上述基因调节区域与经由0-100左右的碱基连接的序列表的SEQ ID NO :3所记载的 信号肽基因的DNA片段。包含本发明的基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因的DNA 片段例如可以由实施例3或5所示的方法获得。另外，限于含有信号肽基因的DNA片段，例 如可以基于公知的信号肽基因或序列表的SEQ ID NO :3所记载的碱基序列的信息，利用化 学合成、基因工程学的方法或突变诱发等公知的任意方法来制作。作为化学合成法，例如 能应用亚磷酰胺法自动合成。需要说明的是，序列表的SEQ ID NO :3所记载的信号肽是根 据芽孢杆菌属细菌分泌的蛋白质组的氨基末端侧的氨基酸序列信息进行统计处理、设计而 得到的数十条候补的氨基酸序列，对所述氨基酸序列评价重组蛋白质生产性并选择而得到 的。本序列即使添加、缺失或置换1个或多个、优选1个或2个氨基酸残基也可以利用。例如，将包含本发明的基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因 的DNA片段插入表达载体来转化作为宿主的枯草芽孢杆菌或将所述DNA片段直接插入枯草 芽孢杆菌的染色体进行转化，由此能活化存在于其下游的蛋白质基因的转录，促进蛋白质 表达，进而将表达的蛋白质分泌到菌体外。含有本发明的基因调节区域与直接或连接地连接于其下游的重组蛋白质基因的 DNA片段是包含上述基因调节区域与经由0-1000左右的碱基连接于其3’末端侧的重组蛋 白质基因的DNA片段。另一方面，含有本发明的基因调节区域、直接或间接地连接于其下游的信号肽基 因以及直接连接于其下游的重组蛋白质基因的DNA片段是包含上述基因调节区域、经由 0-1000左右的碱基连接于其3’末端侧的信号肽基因以及连接于其3’末端侧的重组蛋白质 基因的DNA片段，优选上述信号肽基因是序列表的SEQ ID NO :3所记载的信号肽基因。作为本发明的DNA片段的具体例，如实施例4所示，是含有序列表的SEQ ID NO 1 所记载的碱基序列、经由10个碱基连接于其下游的SEQ ID NO :3所记载的编码信号肽的基 因以及直接连接于其下游的0琼脂糖酶基因的DNA片段。作为本发明的DNA片段所含的重组蛋白质基因的基因产物的重组蛋白质没有 特别限定，例如包括洗剂、食品、纤维、饲料、化学品、医疗、诊断等各种产业用酶或生理活 性肽等。另外，根据产业用酶的功能不同，包括氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶 (Transferase)、水解酶(Hydrolase)、磷酸化酶(Phosphorylase)、裂合酶(Lyase)、异构酶 (Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)、修饰酶(Modifying enzyme)等。更具体而言， 纤维素酶与琼脂分解酶等糖分解酶、环糊精合成酶等糖转移酶、麦芽糖磷酸化酶或海藻糖 磷酸化酶等二糖类磷酸化酶、以及硫酸基转移酶等糖修饰酶等。实施例给出利用本发明的 DNA片段，能大量分泌生产作为糖质分解酶之一的a-或琼脂糖酶与纤维素酶的实例。作为获得本发明的包含基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的重组蛋白 质基因的DNA片段、或包含基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因以及 直接连接于其下游的重组蛋白质基因的DNA片段的方法，例如有如实施例3与5所示，采用 作为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭载体的PHY300PLK质粒，在作为多克隆部位的
8部位插入包含基因调节区域与直接或间接地连接于其下游的信号肽基因的DNA片段，相同 地在作为多克隆部位的SmHI部位插入重组蛋白质基因作为质粒DNA而获得的方法。具体而言，例如首先以具有目标重组蛋白质基因的生物染色体DNA为模板，使用 PCR扩增，将含有编码如下氨基酸序列的碱基序列的该重组蛋白质基因扩增，所述氨基酸序 列包含目标蛋白质的分泌性、稳定性或活性所必需部位。将所得的重组蛋白质基因的PCR 扩增物与PHY300PLK用限制酶SmHI消化，将由此得到的DNA片段进行连接。通过所得的 连接反应液转化大肠杆菌，选择含有在PHY300PLK的部位插入有该重组蛋白质基因 的质粒的转化体，由该转化体制备质粒DNA。将所得的质粒DNA用限制酶EmRI处理来切 断。以芽孢杆菌JAMB750株的染色体DNA为模板，将含有启动子部位或SD序列等的基因调 节区域进行PCR扩增，与上述被EmRI切断的开环质粒DNA连接，通过所得的连接反应液转 化大肠杆菌。选择经正常地转化的转化体制备质粒DNA，可以得到本发明的DNA片段。例如，将包含本发明的基因调节区域与直接或间接连接于其下游的重组蛋白质基 因的DNA片段插入表达载体以转化作为宿主的枯草芽孢杆菌或将所述DNA片段直接插入枯 草芽孢杆菌的染色体进行转化，由此能促进重组蛋白质基因的表达。例如，将包含本发明的基因调节区域与直接或间接连接于其下游的信号肽基因以 及直接连接于其下游的重组蛋白质基因的DNA片段插入表达载体以转化作为宿主的枯草 芽孢杆菌或将所述DNA片段直接插入枯草芽孢杆菌的染色体进行转化，由此能促进重组蛋 白质的表达，并且将表达的重组蛋白质分泌到菌体外。(B)本发明的重组载体本发明的DNA片段可以插入到适当的载体中进行使用。本发明中使用的载体的种 类没有特别限定，例如，可以是能在宿主细胞内自主复制的载体(例如质粒等)，或者也可 以是在导入于宿主细胞时插入宿主细胞的染色体组，与经插入的染色体一起复制的载体。 优选本发明所用的载体是质粒、噬菌体或逆转录转座子。插入上述载体的本发明DNA片段 能在功能上和结构上稳定地保持在载体内。作为能在宿主细胞内自主复制的载体的具体例，可以举出pRS413、pRS415、 pRS416、YCp50、pAUR112 或 pAUR123 等 YCp 型大肠杆菌-酵母穿梭载体；pRS403、pRS404、 pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135等YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体；来自大肠杆菌的质 粒(例如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、 PHSG396 或 pTrc99A 等 ColE 系质粒；pACYC177 或 pACYC184 等 plA 系质粒；pMW118、pMW119、 PMW218或pMW219等pSClOl系质粒等)；来自枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)； PHY300PLK等大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。另外，作为噬菌载体，有λ噬菌(例如 Charon 4A、Charon21A、EMBL4、λ gtlOO、gtll、zap)、ΦX174、M13mpl8、M13mpl9 等。作为逆 转录转座子，可以举出Ty因子等。另外，以融合蛋白质的形式表达的表达载体，例如可以使 用 pGEX 系歹Ij (Pharmacia( 7 τ ^y 7 制))、pMAL 系列(Biolabs 公司制)。本发明的重组载体除含有本发明的DNA片段之外，还可以功能性地含有选择标记 基因、终止子与增强子等。作为选择标记基因，例如可以举出诸如二氢叶酸还原酶(DHFR) 基因或粟酒裂殖酵母TPI基因等的补体是宿主细胞所欠缺的基因、或是耐受例如氨苄西 林、卡那霉素、四环素、氯霉素、放线菌酮、梧宁霉素、新霉素或潮霉素之类药剂的耐药剂 性基因。分别功能地连接本发明的DNA片段、选择标记基因、终止子与增强子，将它们插入适当载体的方法是本领域技术人员公知的方法，例如文献Molecular Cloning(1989) (ColdSpring Harbor Lab.)记载的方法。需要说明的是，该文献的全部记载作为公开特别 援引于此。各个重组载体的插入位置只要是与重组载体复制无关的区域即可，可以为任意 位置，通常利用载体内的多克隆位点。(C)本发明的转化体通过将本发明的DNA片段或重组载体导入适当的宿主，可以制作转化体。S卩，本发 明的转化体是导入本发明的DNA片段而形成的转化体或含有本发明的重组载体的转化体。本说明书中所谓的“转导DNA片段得到的宿主”中的“转导DNA片段”是指利用噬 菌体等将本发明的DNA片段导入宿主细胞或将本发明的DNA片段插入宿主细胞的染色体 DNA。导入本发明的DNA片段或重组载体的宿主细胞是微生物，优选为革兰氏阳性菌， 更优选为枯草芽孢杆菌，最优选为枯草芽孢杆菌的ISW1214株、BD170株或168株等。但 是，只要可以稳定地保持、复制本发明的DNA片段或重组载体，就可以使用枯草芽孢杆菌以 外的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌等。本说明书所谓的“芽孢杆菌属”包括公知的芽孢杆菌属所包括的所有种 类，没有特别限定，例如是指枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、嗜热脂肪芽孢杆 菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉 芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小 芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆 菌(Bacillus halodurans)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽胞杆 菌(Bacillus coaRulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)与苏云金芽孢杆 菌(Bacillus thurinRiensis)等。需要说明的是，将芽孢杆菌属在分类上继续再编 组，该属还包括经再分类的种。例如有地芽孢杆菌(Geobacillus)属、耐碱芽孢杆菌 (Alkalibacillus)属、双芽孢杆菌(Amphibacillus)属、了 笑 口八手卟叉(Amylobacillus) 属、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)属、丨J八千少入(Goribacillus)属、七，〉八 千小入(Cerasibacillus)属、夕7 v 'J 八手卟 7 (Gracilibacillus)属、>、口 八千 卟 ^ (Halolactibacillus)属、'、口 了卟力'J 八千^大(Halalkalibacillus)属、7 ^ 口八手卟叉(Filobacillus)属、夕彐一办丨J八手卟叉(JeotRalibacillus)属、 寸K )V % (Salibacillus)属、才一〉\ 7 K 手卟 z (Oceanobacillus)属、， 'J 二 八千^大(Marinibacillus)属、J v 二 八手卟 7 (Lysinibacillus)属、> > 千八千 入(Lentibacillus)属、々 V —% (Ureibacillus)属、”二 八千 卟 ^ (Salinibacillus)属、水。> 千八’千)v》(PontibaciUus)属、匕° )八千)v 入 (Piscibacillus)属、八，'J 才八千)B (Paraliobacillus)属、夂 了 一 夕八千)B (VirRibacillus)属、寸 >〉二一 ￥ 二 八子 > 7 (SalsuRinibacillus)属、于 二二一 4 "午 卟 ^ (Tenuibacillus)属、夕，乂 广‘千少、(Thalassobacillus)属、卄一么 了少力 >J )《午 卟叉(Thermalkalibacillus)属、子-一乂八子卟义(Tumebacillus)属等，上述菌属还包 含于本说明书所谓的芽孢杆菌属中。将本发明的DNA片段或重组载体导入宿主细胞的方法没有特别限定，但例如可以使用感受态细胞法、原生质体法、电穿孔法、钙离子法、脂质转染法法、原生质球法、乙酸锂 法、转化法、转染法、同源或异源重组法(相同i tz U異種組換i法)等。宿主细胞是枯草 芽孢杆菌时，优选感受态细胞法或原生质体法。获得通过本发明的DNA片段或重组载体来转化的转化体的方法可以使用例如以 结合于本发明DNA片段下游的选择标记基因等适当基因的表达为指标的方法、用使用DNA 探针进行杂交的方法、以及利用重组蛋白质的基质特异性的方法等。作为利用重组蛋白质 的基质特异性的方法的具体例，如实施例4所示，在本发明的DNA片段下游整合β琼脂糖 酶基因，在琼脂培养基上培养结束了转化操作的宿主细胞，由此利用琼脂糖酶活性选择琼 脂溶解了的菌落，从而可以获得通过本发明的DNA片段或重组载体来转化的转化体。(D)本发明的重组蛋白质的制备方法本发明包括根据公知的方法将本发明的转化体在适当的培养基中接种培养，由培 养物收集重组蛋白质的重组蛋白质的制备方法。作为用于培养本发明的转化体的营养培养基，只要适度含有碳源、氮源、无机物与 根据需要使用的菌株所必须的微量营养素，就可以为天然培养基、合成培养基的任一种。
作为用于培养本发明转化体的营养培养基的碳源，只要是该转化体能同化的物质 即可，例如可以使用葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、淀粉、 葡聚糖、糖蜜等糖质或柠檬酸、琥珀酸等有机酸或甘油等脂肪酸。作为用于培养本发明转化体的营养培养基的氮源，可含有各种有机与无机的氮化 合物，而且培养基可含有各种无机盐。例如能使用玉米浆、大豆渣或各种肽类等有机氮源、 以及氯化铵、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠、磷酸铵等无机氮源等化合物。另外，谷氨酸等氨 基酸与尿素等有机氮源当然也可以作为碳源。进而，蛋白胨、多蛋白胨、细菌蛋白胨、肉提取 物、鱼肉提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆粉、大豆渣、干燥酵母、酪蛋白氨基酸、水溶性植 物蛋白等含氮天然物也可以用作氮源。作为用于培养本发明转化体的营养培养基的无机物，例如可以适当使用钙盐、镁 盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐等。具体而言，可以使用磷酸二氢 钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。进而，根据 需要，也可以适当使用氨基酸以及生物素与硫胺素等微量营养素维生素等。例如，利用重组枯草芽孢杆菌168株制备重组蛋白质时，可以使用下述培养基，所 述培养基以葡萄糖或果糖等单糖类、蔗糖或麦芽糖等二糖类或淀粉等多糖类等为碳源，以 肽、大豆粉、酵母提取物、鱼肉提取物或玉米浆等为氮源，进一步掺混金属盐等。作为培养法，液体培养法较好，也可以使用分批培养、流加培养、连续培养或灌流 培养的任一种，工业上优选通气搅拌培养法。培养温度与PH可以选择最适合使用的转化体 增殖的条件。培养时间是微生物开始增殖的时间以上的时间即可，优选为8-120小时，更优 选至生成重组蛋白质基因的基因产物最多的时间为止。例如转化体是枯草芽孢杆菌时的培 养通常在从温度为15-42°C、优选28-37°C，pH为5-9、优选6-8，培养天数为2-7日之中选择 的条件下，进行振荡或通气搅拌来进行。确认枯草芽孢杆菌增殖的方法没有特别限定，但例 如可以收集培养物用显微镜进行观察，也可以用吸光度进行观察。另外，培养液的溶解氧浓 度没有特别限定，但通常优选0. 5-20ppm。因此，调节通气量或搅拌，在通气中追加氧即可。本发明的转化体的培养中，在使重组载体含有选择标记的情况等下，将与选择标记对应的抗生素一起加入营养培养基中。例如含有四环素耐性基因与氯霉素耐性基因作 为选择标记时，分别加入配制成适当浓度的四环素溶液与氯霉素溶液。另外，如果需要，在 培养开始时或从培养开始至确认了转化体增殖后，添加诱导具有本发明多聚核苷酸的基 因的表达的表达诱导剂。例如作为表达诱导剂，使用异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)。由如上所述得到的培养物收集重组蛋白质。该重组蛋白质通常蓄积于转化体外。 为此，从培养上清液收集蓄积于转化体外的重组蛋白质。本发明的重组蛋白质制备方法中 的重组蛋白质收集工序可以根据通常的蛋白质收集方法来进行。例如通过公知的方法除去 转化体后，可以将培养上清液作为重组蛋白质含有物使用。但是，根据宿主的种类，有在转化体内或转化体的细胞膜内蓄积重组蛋白质的情 况。此时，没有特别限定，但例如将由通过用有机溶剂或溶菌酶之类的酶溶解转化体的方 法与超声波破碎法、弗式压碎(7，> f > 7 french press)法、玻璃珠破碎法、砂磨机 (夕M 7 S ^)破碎法等细胞破碎法得到的转化体的细胞破碎物和/或培养物进行离心分 离法、过滤法等操作，由此将转化体与培养上清液分离。可以将如上所述得到的培养上清液 作为重组蛋白质含有物使用。另外，也可以将分离后的转化体直接作为重组蛋白质含有物。上述重组蛋白质含有物也可以直接使用，但根据需要可以通过例如单独或组合使 用盐析法、沉淀法、透析法、超滤法等公知的方法来制备工业用途的浓缩重组蛋白质含有 物。
进而，可以将上述浓缩重组蛋白质含有物供于例如离子交换色谱、等电点色谱、疏 水性色谱、凝胶过滤色谱、吸附色谱、亲和色谱、反相色谱、树脂柱法等公知的分离·纯化的 组合来得到纯化重组蛋白质。实施例[实施例1]基因调节区域探索用质粒的构建用以下的方法构建基因调节区域DNA片段检索用载体pPTCF。以来自产微球茎菌属 JAMB-A7 (Microbulbifer sp. JAMB-A7)株(保藏号；FERM BP-8320)的染色体DNA为模板，使用序列表的SEQ ID NO 4所记载的启动子A与SEQ ID NO 5记载的启动子B进行PCR，得到DNA片段A。将所得的DNA片段A用限制酶E^RI处 理，与预先用处理的作为枯草芽孢杆菌_大肠杆菌的穿梭质粒的PHY300PLK (养乐多 公司制)连接，由此构建环状质粒B。使用环状质粒B转化大肠杆菌HBlOl株，得到转化体 C。由转化体C制备环状质粒B，其中，将在琼脂分解酶基因上游具有来自PHY300PLK的多聚 接头部位的质粒命名为pPTCF。[实施例2]基因调节区域的获得(1)利用限制酶Sau3AI处理芽孢杆菌JAMB750 (Bacillus sp. JAMB750)株(保藏号 FERM AP-20227)的染色体DNA后，将其与用限制酶MmHI切断的在实施例1中构建的质粒 PPTCF混合，通过T4DNA连接酶进行连接反应，得到连接反应液D。利用所得的连接反应液 D转化枯草芽孢杆菌，得到转化体E组。作为用于培养转化体E组的再生培养基，使用8% 琥珀酸钠、琼脂、0. 5%酪蛋白氨基酸、0. 5%酵母提取物、0. 15%磷酸二氢钾、0. 35%磷 酸氢二钾、0. 5%葡萄糖、0. 4%硫酸镁、0. 01%牛血清白蛋白、0. 001%甲硫氨酸、0. 001%亮 氨酸与7.5yg/ml四环素构成的DM3培养基。在DM3培养基上培养转化体E组，选择周围形成琼脂凹陷的约2000个克隆，分别进行液体培养。该液体培养中，使用以3%多聚蛋白胨S、0. 5%鱼肉提取物、0. 05%酵母提取物、0. 磷酸二氢钾、4%麦芽糖、0. 02%硫酸镁、 0. 05%氯化钙与7. g/ml四环素为组成成分的液体培养基，在30°C、48小时的振荡条件 下进行培养。将各培养液用超声波破碎(使用Handy sonic model UR-20P、TOMY SEIKO CO.制)，测定所得的超声波破碎物的琼脂分解酶活性。选择其中活性最高的转化体，将该 转化体具有的质粒命名为PCDAG1。需要说明的是，琼脂分解酶活性用下述方法测定。琼脂分解酶活性的测定如下进行，在95°C下加热溶解，以冷却到50°C的0. 2%精 制琼脂(f力，4〒^夕公司制)为基质，在50mMM0PS缓冲液(pH 7. 0)中于50°C下进行。 通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定通过酶反应生成的还原糖。[实施例3]基因调节区域的获得(2)以来自寸，夕 乂毛于工 一 JAMB-A33 (Thalassomonassp. JAMB—A33)株 (保藏号；DSM17297)的染色体DNA为模板，使用序列表的SEQ ID NO 6记载的启动子C与 SEQ ID N0:7记载的启动子D进行PCR扩增，获得包含约300bp的PCR扩增DNA片段F。将 该PCR扩增DNA片段F用限制酶Hindlll处理，与预先用Hindlll切断的PHY300PLK通过 连接酶反应连接，得到环状质粒G。利用环状质粒G转化大肠杆菌HB101株。由转化体制备 质粒，命名为pHYTER。用以下的方法构建表达载体pJEXOPTl。以实施例2得到的质粒pCDAGl为模板，使用序列表的SEQ IDN0 8记载的启动子 E与SEQ ID NO :9记载的磷酸化启动子F，利用PCR进行包含约300bp的基因调节区域的扩 增，得到PCR扩增物H。另一方面，使包含SEQ ID NO: 18记载的碱基序列的合成单链DNA与包含SEQ ID NO 19记载的碱基序列的合成单链DNA退火，得到双链DNA片段I，在其末端实施磷酸化处 理。将所得的PCR扩增物H与双链DNA片段I通过连接酶反应结合，以其为模板，使用SEQ ID NO :10记载的启动子G与SEQ ID NO :11所记载的启动子H进行PCR扩增。将所得的 PCR扩增片段用作为限制酶的EcoRI与BamHI处理后，与用EcoRI与BamHI处理过的pHYTER 连接，由此构建环状质粒。使用本质粒转化大肠杆菌HB101株。由转化体制备质粒，命名为 pJEXOPTl。[实施例4]用表达载体分泌生产0琼脂糖酶以作为0琼脂糖酶生产菌的产微球茎菌属JAMB-A49 (Microbulbifer sp. JAMB-A94)株(保藏号；FERM BP-8321)的染色体为模板，使用序列表的SEQ ID NO: 12 所记载的启动子I与SEQ IDN0:13所记载的启动子J，将3琼脂糖酶基因DNA片段进行PCR 扩增。将其用限制酶处理。将表达载体pJEXOPTl用限制酶_ HI切断，用连接酶 与3琼脂糖酶基因连接。用含有该0琼脂糖酶基因的PJEX0PT1转化大肠杆菌HB101株。 由显示3琼脂糖酶活性的转化体制备质粒，命名为pJEXOPTlb。使用该质粒转化枯草芽孢 杆菌ISW1214(Bacillus subtilis ISW1214)株，用加有四环素的再生培养基进行筛选。将 所得的转化体在以5%多肽5、0.5%鱼肉提取物、0. 05%酵母提取物、0. 磷酸氢钾、5% 麦芽糖、0. 02%氯化镁、0. 05%氯化钙与15 u g/ml四环素为组成成分的PPS培养基中，在 30°C下以130rpm搅拌培养72小时，测定除去菌体得到的培养上清液所含的0琼脂糖酶活 性。其结果是，可以确认大量生产，即，每1L培养液中约O.15g0琼脂糖酶。说明
[实施例5]基因调节区域的改变另一方面，以质粒pCDAGl为模板，使用序列表的SEQ IDN0 8记载的磷酸化启动 子E与SEQ ID NO :9记载的磷酸化启动子F，通过PCR进行扩增。将所得的PCR片段导入 PUC18的Smal部位。以构建的质粒为模板，使用启动子E与启动子F，使用Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech ( >7 n y r V >7 )公司)，根据试剂盒的操作手册，在 PCR扩增片段中随机地导入变异。重复5次该随机变异操作。以所得的PCR产物以模板，使 用启动子E与磷酸化启动子F进行PCR扩增。然后，使用T4DNA聚合酶使PCR产物的末端 平滑。另一方面，使包含SEQ ID NO 18记载的碱基序列的合成单链DNA与包含SEQ ID NO 19所记载的碱基序列的合成单链DNA退火，得到双链DNA片段，在其末端实施磷酸化处 理。将得到的PCR产物与双链DNA片段通过连接酶反应结合。将所得的DNA片段用限 制酶EmRI、BamHI处理后，与用EmRI与MmHI处理的pHYTER连接，构建环状质粒组。使 用本质粒组转化大肠杆菌HB101株。收集所得的多于数千的转化体，制备质粒组。将其作 为质粒组A。然后，以作为0琼脂糖酶牛产菌的产微球苯菌属TAMB-A94 (Microbulbifer sp. JAMB-A94)株的染色体为模板，使用SEQ ID NO 12所记载的启动子I与SEQ ID NO 13 所记载的启动子J，将0琼脂糖酶基因DNA片段进行PCR扩增。将其用限制酶处 理。用限制酶切断质粒组A，用连接酶与0琼脂糖酶基因连接。使用它们转化大肠 杆菌HB101株。由显示3琼脂糖酶活性的转化体制备质粒，使用上述质粒转化枯草芽孢杆 菌ISW1214株，用加有四环素的再生培养基进行筛选。将所得的转化体在PPS培养基(5% 多聚蛋白胨S、0. 5%鱼肉提取物、0. 05%酵母提取物、0. 磷酸氢钾、5%麦芽糖、0. 02%氯 化镁、0.05%氯化钙、15i!g/ml四环素)中在30°C下以130rpm搅拌培养72小时，测定所得 的培养上清液所含的0琼脂糖酶活性。其结果是，可以得到可以大量生产(即，每1L培养 液中约0. 2g0琼脂糖酶)的质粒pJEX0PT2。[实施例6]用表达载体分泌生产纤维素酶以作为纤维素酶生产菌的广v 7 ^ . 了 W 4 1139(Bacillusakibaill39)株 (保藏号；JCM 9157T)(参见 J. Gen. Microbiol. 1986，132，2329-2335. Fukumori 等、Int J Syst Evol Microbiol. (2005) 55 :2309_15. Nogi，Y.等文献，上述全部记载作为公开特别援 引于此)的染色体为模板，使用序列表的SEQ ID NO :14记载的启动子M与SEQ ID N0:15记 载的启动子N将纤维素酶基因DNA片段进行PCR扩增。将其用限制酶MmHI处理。用限制酶 BamHI切断pJEX0PTl、pJEX0PT2，利用连接酶与纤维素酶基因连接。使用它们转化大肠杆菌 HB101株。由显示纤维素酶活性的转化体制备质粒，分别命名为pJEX0PTlC、pJEX0PT2C。使 用上述质粒转化枯草芽孢杆菌ISW1214株，用加有四环素的再生培养基进行筛选。将所得 的转化体在PPS培养基(3%多聚蛋白胨S、0. 5%鱼肉提取物、0. 05%酵母提取物、0. 磷 酸氢钾、4%麦芽糖、0. 02%氯化镁、0. 05%氯化钙、15ii g/ml四环素)中在30°C下以130rpm 搅拌培养72小时，测定所得的培养上清液所含的纤维素酶活性。其结果是，可以确认每1L 培养液中，PJEX0PT1C大量生产约lg纤维素酶，PJEX0PT2C大量生产约1. 5g纤维素酶。[实施例7]用表达载体分泌生产a琼脂糖酶以作为a琼脂糖酶生产菌的寸，,V ^ f工^匕。一
14JAMB-A33 (Thalassomonas sp. JAMB-A33)株(保藏号；DSM 17297)的染色体为模板，使用序 列表的SEQ ID NO 16记载的启动子O与SEQ IDNO 17记载的启动子P，将α琼脂糖酶基 因DNA片段进行PCR扩增。将其用限制酶_ΗΙ处理。将pJEXOPTl、pJEX0PT2用限制酶 切断，用连接酶与α琼脂糖酶结构基因连接。使用它们转化大肠杆菌HBlOl株。由 显示琼脂糖酶活性的转化体制备质粒，分别命名为pJEXOPTla、pJEX0PT2a。使用上述质粒 转化枯草芽孢杆菌ISW1214株，用加有四环素的再生培养基进行筛选。将所得的转化体在 PPS培养基(5%多聚蛋白胨S、0. 5%鱼肉提取物、0. 05%酵母提取物、0. 磷酸氢钾、5% 麦芽糖、0.02%氯化镁、0.05%氯化钙、15 μ g/ml四环素)中在30°C下以130rpm搅拌培养 72小时，测定所得的培养上清液所含的α琼脂糖酶活性。其结果是，确认每IL培养液中， pJEXOPTla大量生产0. 2g α琼脂糖酶，pJEX0PT2a大量生产0. 3g α琼脂糖酶。
权利要求
DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，能促进存在于其下游的基因的表达(a)序列表的SEQ ID NO1或2所记载的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在序列表的SEQ ID NO1或2所记载的碱基序列中，缺失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由序列表的SEQ IDNO1或2所记载的碱基序列和与其互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交。
2.DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，能促进存在于其下游的基因的表 达，并且将该基因的基因产物分泌到细胞外(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直接或间 接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直 接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列的碱基序列中，缺失、置换、倒位或添加 1个或多个碱基而得到的碱基序列；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构成 的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序 列与直接或间接地连接于其下游的编码信号肽的碱基序列。
3.DNA片段，其含有下述(a)-(c)的任一碱基序列，促进存在于其下游的基因的表达， 并且能将该基因的基因产物分泌到细胞外(a)下述碱基序列，其包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直接或间 接地连接于其下游的编码SEQ ID NO :3所记载的氨基酸序列的碱基序列；(b)如下得到的碱基序列在包含序列表的SEQID NO :1或2所记载的碱基序列与直 接或间接地连接于其下游的编码SEQ IDNO 3所记载的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列 中，缺失、置换、倒位或添加1个或多个碱基；或(c)下述DNA的碱基序列，所述DNA能与由下述碱基序列和与其互补的碱基序列构成 的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列包含序列表的SEQ ID NO 1或2所记载的碱基序 列与直接或间接地连接于其下游的编码SEQ ID NO :3所记载的氨基酸序列的碱基序列。
4.DNA片段，其含有权利要求1所述的DNA片段的碱基序列与直接或间接地连接于其下 游的编码重组蛋白质的碱基序列。
5.DNA片段，其含有权利要求2或3的DNA片段的碱基序列与直接连接于其下游的编码 重组蛋白质的碱基序列。
6.权利要求4或5的DNA片段，其中，重组蛋白质是选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、 磷酸化酶、裂合酶、异构酶、合成酶与修饰酶的1种酶。
7.重组载体，其含有权利要求1-6中任一项的DNA片段。
8.权利要求7的重组载体，其中，重组载体是质粒、噬菌体或逆转录转座子。
9.转化体，其由下述宿主(a)或(b)构成(a)转导了权利要求1-6的DNA片段的宿主；或(b)含有权利要求7或8的重组载体的宿主。
10.权利要求9的转化体，其中，宿主是微生物。
11.权利要求9的转化体，其中，宿主是革兰氏阳性细菌。
12.权利要求9的转化体，其中，宿主是属于芽孢杆菌属的微生物。
13.重组蛋白质的制备方法，其包括下述工序(a)与(b)(a)权利要求9-12中任一项的转化体的培养工序；与(b)该重组蛋白质的收集工序。
14.权利要求13的方法，其中，重组蛋白质是选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、磷酸化 酶、裂合酶、异构酶、合成酶与修饰酶的1种酶。
15.权利要求9-12中任一项的转化体，其用于权利要求13或14的重组蛋白质的制备 方法。
全文摘要
本发明涉及单独含有特定基因调节区域的DNA片段、或含有该基因调节区域与编码信号肽的基因的DNA片段、含有该DNA片段的重组载体、含有该重组载体的转化体以及使用该转化体制备重组蛋白质的方法。根据本发明，可以与重组蛋白质的种类无关地大量且有效地生产蛋白质。
文档编号C12N9/42GK101827937SQ20088002451
公开日2010年9月8日 申请日期2008年7月9日 优先权日2007年7月13日
发明者中村信之, 大田优佳莉, 日高祐子, 秦田勇二 申请人:独立行政法人海洋研究开发机构