绿脓杆菌的外膜蛋白质pa4710的制作方法

专利名称：绿脓杆菌的外膜蛋白质pa4710的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自绿脓杆菌外膜蛋白质PA4710的蛋白质抗原或肽抗原，以及针对 该抗原的抗体。本发明还涉及含有该抗原的疫苗组合物。本发明进一步涉及含有该抗体的 药物组合物、绿脓杆菌感染症诊断剂、绿脓杆菌感染症治疗剂、绿脓杆菌的检测试剂盒。
背景技术：
绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是在土壤、水中等自然环 境中广泛分布的革兰氏阴性杆菌，引发难治性的严重致死性感染症。绿脓杆菌的主要感染 目标是包括烧伤、脏器移植或癌症患者的一般被称为受累宿主(compromised host)的生物 体防御功能衰弱的易感染性患者，绿脓杆菌是造成院内感染的主要病原菌。而且该菌所造 成的肺感染症对囊性纤维化病患者是致死性的。虽然可以对这些患者主要施用具有抗绿脓 杆菌活性的抗菌剂，但较多病例由于绿脓杆菌的抗药性而得不到充分的治疗效果。另外，对 于针对绿脓杆菌的疫苗、抗体也长期进行了研究，但是在直接使用灭活菌的方法中，存在必 须根据绿脓杆菌的血清型不同而分别制备各种疫苗、抗体等缺点。在这种情况下，人们期待通过使用在绿脓杆菌之间具有共同的氨基酸序列的来自 绿脓杆菌的蛋白质进行主动免疫或被动免疫，来预防或治疗绿脓杆菌感染症。作为将来自 绿脓杆菌的蛋白质应用于疫苗的例子，已知融合了外膜蛋白质OprF和OprI的一部分的重 组蛋白质(特开平8-245699号公报文献1)、IV型菌毛蛋白质(W02004/099250号公报 文献2)等。另外，关于以来自绿脓杆菌的蛋白质为靶标的抗体药物，已经报告了抗IV型菌毛 蛋白抗体(文献2)、抗PA1706(或PcrV)抗体(US6309651号公报文献3、US6827935号公 报文献4)、抗PA5158抗体(W02007/049770号公报文献5)等。但是，因为显示多种血清型的绿脓杆菌临床分离株所共同具有的来自菌体的蛋白 质可以作为“绿脓杆菌共同抗原”而用于绿脓杆菌感染症的预防、诊断或治疗，所以人们经 常寻求这种蛋白质。可是，PA4710(或 phuR)基因(Genebank 登录号 AF055999)所编码的 PA4710 (又 名PhuR)蛋白质，属于TonB依赖性受体家族，是构成绿脓杆菌的血红素吸收系统的外膜 氯高铁血红素受体蛋白质(Microbiology, 2000,146，185-198 文献 6 ；Environmental Microbiology，2003，5，1350-1369 文献7)。TonB依赖性受体包括由22个横跨外膜的
折叠股构成的外膜桶(0-barrel)和栓结构域(plug domain) 0栓结构域从周质 侧进入桶内，形成栓形状。一旦配体结合，TonB依赖性受体就发生构象变化，从而将 配体摄入周质。利用TonB依赖性受体的配体摄入需要能量。该能量是通过存在于内膜的 由3个蛋白质TonB-ExbB-ExbD形成的能量转换复合体，经由TonB蛋白质与延伸至TonB 依赖性受体的氨基末端的TonB框(TonBbox)相互作用来供给的。仅有唯一的D-Squared Biotechnologies, Inc.公开了 PA4710蛋白质的部分序列可以作为疫苗的成分利用、并且 由该蛋白产生的抗体组合物可以作为感染症治疗药或诊断药利用的内容，但其中没有实施例，仅从广泛的菌种之间铁吸收系统蛋白质的同源性出发进行了描述(W02002/083843号 公报文献8 ；W02003/006672号公报文献9)。

发明内容
本发明的课题是提供具有实质性地预防或治疗绿脓杆菌感染的能力、且能够作为 应对来自绿脓杆菌感染患者的临床分离株的多样性的疫苗组合物使用的蛋白质抗原或肽 抗原，以及针对该抗原的抗体。本发明者们为了解决上述课题，尝试了从绿脓杆菌的外膜蛋白质中探索新型、有 用的“绿脓杆菌共同抗原”，进行了各种研究，结果通过基因芯片(GeneChip)分析发现，编 码位于绿脓杆菌的外膜的PA4710(又名PhuR)蛋白质的基因无论是否存在人血清，都能够 稳定表达(实施例1)。另外，通过对于67株绿脓杆菌临床分离株进行基因分析，成功鉴 定了 PA4710蛋白质中氨基酸序列保守的区域，同时在该氨基酸序列保守的区域中，特定了 PA4710蛋白质的11个细胞外区域(实施例2、9)。进而，本发明者们发现，免疫PA4710重组蛋白质或位于其氨基酸序列保守的区域 内的细胞外区域的肽所得到的抗血清或抗体，与PA4710蛋白质结合，也与绿脓杆菌的菌体 表面结合(实施例7、8)。另外，确认了该抗体在绿脓杆菌感染模型小鼠中显示高抗感染效 果(实施例10 12)。S卩，本发明者们通过对PA4710蛋白质的全长区域进行详细的分析，成功地压缩出 PA4710蛋白质的免疫优势区域，同时发现针对该区域的抗体在绿脓杆菌感染模型小鼠中显 示高抗感染效果，从而完成了本发明。本发明更详细地说，涉及以下发明。<1> 选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的蛋白质(i)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii)由与编码序列号4所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷 酸编码、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)含有与序列号4所示氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列、且与由 序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。<2>由下述氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列包含在选自序列号3所示氨基 酸序列中的181位 198位、204位 257位、259位 311位、313位 319位、321位 436位、440位 491位、493位 600位、602位 764位中的氨基酸序列中，且该肽编码从 绿脓杆菌的表面露出的肽区域。<3>由<2>所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。<4>由序列号5 15的任一项所示氨基酸序列组成的肽。<5>由<4>所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。<6>由含有<2>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组成的肽。<7>由含有<3>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<8>由含有<4>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<9>由含有<5>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<10>针对来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质或其一部分的抗体或其功能性片段。<11>如<10>所述的抗体或其功能性片段，来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的一部 分是来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域。<12>针对<1>所述的蛋白质的抗体或其功能性片段。<13>针对<2>所述的肽的抗体或其功能性片段。<14>针对<3>所述的肽的抗体或其功能性片段。<15>针对<4>所述的肽的抗体或其功能性片段。<16>针对<5>所述的肽的抗体或其功能性片段。<17>针对<6>所述的肽的抗体或其功能性片段。<18>抗体或其功能性片段，与由序列号5 15的任一氨基酸序列组成的肽结合， 且不与由除序列号5 15的氨基酸序列以外的氨基酸序列组成的肽结合。<19>如<10>所述的抗体或其功能性片段，与绿脓杆菌表面结合。<20>如<10> <19>的任一项所述的抗体或其功能性片段，抗体是单克隆抗体。<21>如<10>所述的抗体或其功能性片段，对感染了绿脓杆菌的患者具有抗菌活 性。<22>如<21>所述的抗体或其功能性片段，患者是处于嗜中性粒细胞减少的状态 的患者。<23>如<21>所述的抗体或其功能性片段，绿脓杆菌是多药耐药性绿脓杆菌。<24>如<21> <23>的任一项所述的抗体或其功能性片段，抗体是单克隆抗体。<25> 抗体或其功能性片段，是由在 FERM BP-10970、FERMBP-1097U FERM BP-10972.FERM BP-10973、FERM BP-10974的任一保藏编号下保藏的杂交瘤产生的。<26>单克隆抗体或其功能性片段，与下述抗原反应，所述抗原是与下述单克隆 抗体的抗原相同的抗原，所述单克隆抗体是由在FERMBP-10970、FERM BP-10971、FERM BP-10972、FERM BP-10973、FERMBP-10974的任一保藏编号下保藏的杂交瘤产生的。<27>产生<20>所述的抗体的杂交瘤。<28>产生<24>所述的抗体的杂交瘤。<29> 在 FERM BP-10970、FERM BP-10971、FERM BP-10972、FERM BP-10973, FERM BP-10974的保藏编号下保藏的杂交瘤。<30>抗原组合物，含有能够产生针对来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的抗体的蛋 白质抗原或肽抗原。<31>抗原组合物，含有<1>所述的蛋白质或<2> <9>的任一项所述的肽。<32>用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，含有<30>或<31>所述的抗原组合物，并可根据情况含有1种以上药学上容许的载体、稀释剂和/或佐剂。<33>如<32>所述的疫苗组合物，与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染引起 的全身感染疾病。<34>如<33>所述的疫苗组合物，绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。<35>用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，含有<10> <19>、 <21> <23>、<25>、<26>的任一项所述的抗体或其功能性片段，并可根据情况含有1种以 上药学上容许的载体和/或稀释剂。<36>如<35>所述的药物组合物，与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染引起 的全身感染疾病。<37>如<36>所述的药物组合物，绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。<38>绿脓杆菌感染症诊断剂，含有<10> <19>、<25>、<26>的任一项所述的抗体 或其功能性片段。<39>绿脓杆菌检测试剂盒，含有<10> <19>、<25>、<26>的任一项所述的抗体或 其功能性片段。
具体实施例方式[PA4710 蛋白质]PA4710蛋白质是来自绿脓杆菌的外膜PA4710蛋白质。该蛋白质的氨基酸序列在 序列号3中记载，编码该蛋白质的多核苷酸的碱基序列在序列号1中记载。其中，根据由大肠杆菌FhuA蛋白质的结构分析信息(Cell, 1998,95,771-778, Science, 1998，282，2215-2220)、大肠杆菌F印A蛋白质的结构分析信息(Nat. Struct. Biol.，1999，6，56-63)、大肠杆菌FecA蛋白质的结构分析信息(Science, 2002，295， 1715-1719、J. Mol. Biol.，2003，332，353-368)、绿脓杆菌 FpvA 蛋白质的结构分析信息 (J. Mol. Biol.，2005，347，121-134)和PA4710蛋白质的2级结构预测信息所获得的信息，推 测在序列号1所示的碱基序列中，氨基酸编码区2295个碱基中的第541位 第2295位的 碱基序列(序列号2)编码PA4710蛋白质的外膜桶蛋白质部分。推测该区域包括横跨 外膜的22个反平行折叠股，连接各折叠股的21个环中，11个环露出细胞表面。以下， 将该区域称为“含有细胞表面环的区域”。PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域，是选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的 蛋白质(i)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii)由与编码序列号4所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷 酸编码、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)含有与序列号4所示氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列、且与由 序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。在本说明书中，所谓“在氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基 酸的氨基酸序列”，意味着通过定点诱变法等公知的方法来进行改变，或者由于能够自然产生的程度的多个数目的氨基酸置换等而产生改变。氨基酸改变的个数优选为1 50个，更 优选为1 30个，进而优选为1 10个，进一步优选为1 5个，最优选为1 2个。PA4710蛋白质的改变氨基酸序列的例子，优选可以是其氨基酸具有1个或多个 (优选为1 数个，或者为1、2、3或4个)保守性置换的氨基酸序列。在本说明书中，所谓“保守性置换”，意味着将1个或多个氨基酸残基用化学性质 类似的其他氨基酸残基置换。可列举例如，将某个疏水性残基用其他疏水性残基置换的情 况、将某个极性残基用具有相同电荷的其他极性残基置换的情况等。至于能够进行这样的 置换的功能类似的氨基酸，对每种氨基酸在该技术领域内是公知的。如果列举具体例，则作 为非极性(疏水性)氨基酸，可列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷 氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷的(碱性)氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸、 赖氨酸等。另外，作为带有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。在本说明书中，所谓“严格条件”，意味着杂交之后的膜洗涤操作在高温下低盐浓 度溶液中进行，例如，意味着0. 5XSSC浓度(1XSSC :15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)、 60°C、15分钟的洗涤条件，优选为在0. 5 X SSC浓度、0. 1 % SDS溶液中、60°C、15分钟的洗涤 条件。杂交可以按照公知的方法进行。另外，在使用市售的文库的情况下，可以按照附带 的使用说明书所记载的方法进行。在本说明书中，所谓碱基序列或氨基酸序列的“同一性”，是以在被比较的序列之 间，构成各序列的碱基或氨基酸残基的一致程度的意义使用的。本说明书中所示的“同一 性”的数值只要都是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值即可，例如 可以通过在FASTA、BLAST等中使用默认(初始设定)的参数，容易地计算出。与序列号4所示氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列，可以是具有优选 为80%以上、更优选为85%以上、进而优选为90%以上、进一步优选为95%以上、特别优选 为98 %以上、并且最优选为99 %以上的同一性的氨基酸序列。在本发明中，如果给出序列号4所示氨基酸序列，则容易确定编码它的核苷酸序 列，可以选择编码序列号4所示氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，所谓编码含有序列号 4所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，除了序列号2所示的DNA序列的一部分或全部之 外，还意味着下述序列，即编码相同氨基酸的DNA序列，该序列具有处于简并关系的密码子 作为DNA序列。本发明还包括对应于这些序列的RNA序列。作为编码含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选例子，可列举 含有序列号2所示的碱基序列的多核苷酸。在本说明书中，是否与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能， 可以通过评价与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达相关的生物体现象或功 能来确定，例如，可以利用基因重组技术表达该蛋白质，通过评价能否制作针对PA4710蛋 白质的抗体来确定。因为本发明的蛋白质存在于绿脓杆菌细胞表面，所以该蛋白质可以作为用于制作 针对绿脓杆菌的抗体的抗原(蛋白质抗原)使用。本发明者们通过分析大量临床分离株，成功地在PA4710蛋白质(序列号3)中特定了氨基酸序列保守的区域。特定的区域(5个氨基酸以上的区域)如下序列号3所示氨基酸序列中的181位 198位、204位 257位、259位 311位、 313位 319位、321位 436位、440位 491位、493位 600位、602位 764位。为了制成作为针对绿脓杆菌感染的药物、诊断药使用的抗体，优选本发明的肽是 这些氨基酸序列保守的区域所包含的肽，并且是从绿脓杆菌的表面露出的肽区域(以下， 称为“细胞外区域”)的肽。这样的肽是共同抗原。可以通过PA4710蛋白质的结构特征分 析和利用抗体与绿脓杆菌表面的结合实验进行验证等(参考实施例2、9)，来特定细胞外区 域。本发明者们特定了 11个肽区域(序列号5 15)作为细胞外区域。序列号5 15是 本发明的肽的优选方式。本发明的序列号5 15的肽中，由序列号11、12、14所示氨基酸序列组成的肽被 证实了以它们为靶标的抗体具有针对绿脓杆菌感染的抗菌活性(实施例11、12)。因此，由 序列号11、12、14所示氨基酸序列组成的肽，作为用于制备用作针对绿脓杆菌感染的药物 的抗体的抗原，是特别理想的肽。为了制备抗体而使用的本发明的肽不必是整个上述细胞外区域的肽。只要可以制 备抗体即可，对氨基酸的链长不限制，优选为7个氨基酸以上(例如，8个氨基酸以上、10个 氨基酸以上、12个氨基酸以上)。此外，在为了作为共同抗原使用的情况下，本发明的肽优选为上述氨基酸序列包 含在保守区域的肽，在为了其他目的的情况(例如，以绿脓杆菌的特定株为靶标的情况等) 下，也可以考虑以含有变异的区域为靶标。这样本发明的肽还包括1个或数个氨基酸存在 变异的肽。该变异可以是保守性置换。为了防止由于电荷造成凝集等，本发明的肽可以在N末端、C末端添加保护基团。 对N末端经常使用乙酰化，对C末端经常使用酰胺化，但不限于这些。本发明的肽可以使用 添加半胱氨酸残基、强化与间隔物(spacer)的结合的修饰等。作为间隔物，一般使用DMS(辛二亚氨酸二甲酯，DimethylSuberimidate)、DMA(己 二亚氨酸二甲酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲 酸酯)、磺基-MBS (间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)等，但不限于此， 只要是能够作为间隔物发挥功能的化合物即可。对于本发明的肽，作为载体可以使用牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、人 血清白蛋白(HSA)或来自帽贝的血蓝蛋白(KLH，匙孔血蓝蛋白)等载体蛋白质，但不限于这 些。可以将该肽组装到其他蛋白质的末端或内部而制作融合蛋白质，作为用于制作抗体的 抗原使用。[抗原组合物]本发明的蛋白质或本发明的肽可以作为蛋白质抗原或肽抗原使用。因此，根据 本发明，提供了下述抗原组合物，所述抗原组合物包含可以产生针对来自绿脓杆菌的外膜 PA4710蛋白质的抗体的上述蛋白质抗原或上述肽抗原。其中，作为蛋白质抗原或肽抗原，优选按照本领域技术人员公知的方法将本发明 的蛋白质或本发明的肽纯化使用。在本说明书中，所谓“抗原组合物”，既可以是以蛋白质抗原或肽抗原为唯一构成 要素的组合物，也可以是还含有其他成分的组合物。
根据本发明，提供了下述抗原组合物，所述抗原组合物包含可以产生针对来自绿 脓杆菌的PA4710蛋白质的抗体的蛋白质抗原或肽抗原。[抗体]本发明的抗体识别绿脓杆菌的外膜PA4710蛋白质或其一部分，且与绿脓杆菌结
1=1 o根据本发明，提供了本发明的抗体或其功能性片段，其中，来自绿脓杆菌的PA4710 蛋白质的一部分，是来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域。其中，PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域，是选自以下(i)、(ii)、(iii)和 (iv)的蛋白质(i)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii)由与编码序列号4所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷 酸编码、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)含有与序列号4所示氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列、且与由 序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。根据本发明，提供了本发明的抗体或其功能性片段，其中，来自绿脓杆菌的PA4710 蛋白质的一部分，是(i)作为氨基酸序列保守的区域(序列号3所示氨基酸序列中的181 位 198位、204位 257位、259位 311位、313位 319位、321位 436位、440位 491位、493位 600位、602位 764位)、且作为细胞外区域的肽；(ii)由⑴的肽的氨基 酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组成的肽；或(iii)由含有(i)或(ii) 的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组成的肽。根据本发明，提供了本发明的抗体或其功能性片段，其中，来自绿脓杆菌的PA4710 蛋白质的一部分，是⑴作为序列号5 15所示的细胞外环区域的肽；(ii)由⑴的肽的 氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组成的肽；或(iii)由含有(i)或 (ii)的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组成的肽。根据本发明，提供了下述抗体，所述抗体仅与来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质中的 序列号5 15的氨基酸序列所示的细胞外环区域中的特定细胞外环区域结合，不与其他细 胞外环区域结合。根据本发明，提供了能够与绿脓杆菌结合的抗体，其特征在于，是对本发明的抗原 组合物发生应答，由动物自身的免疫系统产生的抗体。本发明的抗体可用于绿脓杆菌感染的治疗、诊断，或者作为研究用试剂使用。在将 本发明的抗体应用于绿脓杆菌感染的方式中，提供对感染了绿脓杆菌的患者具有抗菌活性 的抗体或其功能性片段。在该方式中，特别优选的抗体是针对由序列号11、12、14的任一个 所示氨基酸序列组成的肽的抗体。可以通过使抗体与PA4710蛋白质(序列号3)中由序 列号11、12、14的任一个所示氨基酸序列组成的肽的区域作用，从而发挥针对绿脓杆菌的 抗菌活性。作为显示这样的抗菌活性的具体抗体，例如，可例示由在FERM BP-10972、FERM BP-10973、FERM BP-10974的保藏编号下保藏的杂交瘤产生的抗体。如果在为了使抗体发 挥针对绿脓杆菌的抗菌活性而特定优选的肽区域作为该抗体的靶标的情况下，只要是本领域技术人员，就能够以该肽区域为靶标制作显示同样活性的各种抗体。本发明包括由本发 明者们发现的、与这些靶标肽区域结合的各种抗体。感染了绿脓杆菌的患者，例如可以是由于各种药剂施与、放射线治疗等而处于嗜 中性粒细胞减少的状态的患者。根据本发明的抗体，在即使对容易发展成严重感染症的、上 述这样的患者也能够发挥效果的方面，是有利的。另外，感染患者的绿脓杆菌可以是多药耐 药性绿脓杆菌。本发明的抗体在即使对不能用通常使用的抗生素治疗的、感染了多药耐药 性绿脓杆菌的患者也显示有效性的方面，也是有利的。根据本发明，提供了由在FERM BP-10970、FERM BP-10971、FERMBP-10972、FERM BP-10973.FERM BP-10974的任一保藏编号下保藏的杂交瘤所产生的抗体或其功能性片段。 进一步地，提供了这样的抗体，其特征在于，是与由这些杂交瘤产生的单克隆抗体相同的抗 原反应的单克隆抗体。本发明的抗体优选如下获得，即以能够免疫含有经纯化的本发明的蛋白质抗原或 肽抗原的抗原组合物并诱导抗体的量对实验动物进行施与。可以从心脏或动脉采血，分离 而得到抗血清，将得到的抗血清进行纯化，然后作为纯抗体使用。本发明的抗体包括以PA4710蛋白质或肽为抗原，将该抗原免疫小鼠等哺乳动物 而得的多克隆抗体或单克隆抗体(还包括能产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤所产生的 单克隆抗体)；使用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体；和使用能产生人抗体的 转基因动物等制造的人抗体。在将本发明的抗体作为药物对人施与的情况下，从降低副作 用的观点出发，优选为人抗体。所谓“人抗体”，是所有区域来自人的抗体。本发明的人抗体可以使用本领域技 术人员公知的方法来制作(例如，可以参考Intern. Rev. Immunol，1995，13，65-93、J. Mol. Biol，1991，222，581-597、特开平10-146194号公报、特开平10-155492号公报、特许 2938569号公报、特开平11-206387号公报、特表平8-509612号公报、特表平11-505107号 公报等)。“人源化抗体”是仅将小鼠抗体的抗原结合部位(⑶R，互补决定区)的基因序列移 植(CDR移植)到人抗体基因中而成的抗体。本发明的人源化抗体可以使用本领域技术人 员公知的方法制作(例如，可以参考EP239400、W090/07861号公报等)。所谓“嵌合抗体”，是某种抗体的可变区和与它异种的抗体的恒定区连接而成的抗 体。具体地说，可以通过对小鼠免疫抗原，从该小鼠单克隆抗体的基因上切下与抗原结合的 抗体可变区(V区)，并与来自人骨髓的抗体恒定区(C区)基因连接来制作。本发明的嵌 合抗体可以使用本领域技术人员公知的方法来制作(例如，可以参考特开平8-280387号公 报、美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报等)。本发明的单克隆抗体可以使用本领域技术人员公知的方法来制作(例如，可以 参考 Antibodies A LABORATORY MANUAL(抗体实验指南)EdHarlow，David Lane Cold Spring Harbor Laboratory 1988、単々口一 >抗体実験二 - 7 A (单克隆抗体实验指 南)(1987)讲谈社富山朔二等编、単夕口一 >抗体7、4 K 一 7 i ELISA(单克隆抗体杂 交瘤和ELISA) (1987)讲谈社岩崎辰夫等编等)。本发明的多克隆抗体可以使用本领域技术人员公知的方法来制作。
本发明的所谓“功能性片段”，意味着作为抗体的一部分(部分片段)的、特异性地 识别本发明的蛋白质的片段。具体地说，可列举Fab、Fab'、F(ab' )2、可变区片段(Fv)、 二硫键Fv、单链抗体(scFv)和它们的聚合物等。另外，根据本发明，提供了产生上述本发明的抗体的杂交瘤。在本发明的杂交瘤 的优选方式中，可提供2008年5月28日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物 保藏中心(〒305-8566，茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)保藏的保藏编号FERM BP-10970.FERM BP-10971、FERM BP-10972、FERM BP-10973、FERM BP-10974 的杂交瘤。对 应的原始保藏如下。2005年11月25日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(亍 305-8566，茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)保藏的保藏编号FERM P-20723的 杂交瘤(4710-B-1)、FERM P-20724 的杂交瘤(4710-L3A-1)、FERM P-20725 的杂交瘤 (4710-L7-1)，以及2007年2月8日在同一中心保藏的保藏编号FERM P-21205的杂交瘤 (4710-L8B-1)和 FERM P-21206 的杂交瘤(4710-L10-1)。[疫苗组合物]本发明的抗原组合物可以作为疫苗使用。因此，根据本发明，提供了疫苗组合物， 该疫苗组合物含有能够产生针对来自绿脓杆菌的外膜PA4710蛋白质的抗体的抗原组合 物。根据本发明，可以制造用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，该 疫苗组合物含有本发明的抗原组合物，并可根据情况含有1种以上药学上容许的载体、稀 释剂和/或佐剂。本发明的疫苗组合物中所使用的载体，可基于施与的方式和途径、以及标准制药 的实际情况来选择，有载体蛋白质(例如，牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、人血清 白蛋白(HSA)、来自帽贝的血蓝蛋白(KLH:匙孔血蓝蛋白)等)、溶解剂(例如，乙醇、聚山 梨酸酯、Cremophor EL(注册商标)等)、等张剂、保存剂、抗氧化剂、赋形剂(例如，乳糖、淀 粉、结晶纤维素、甘露糖醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质无水硅酸、碳酸钙等)、结合剂(例如，淀 粉、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、阿拉伯树胶等)、润滑剂 (例如，硬脂酸镁、滑石、硬化油等)、稳定剂(例如，乳糖、甘露糖醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、聚 乙二醇、聚氧乙烯硬化蓖麻油等)等。如果需要，还可以加入甘油、二甲基乙酰胺、70%乳酸 钠、表面活性剂或碱性物质(例如，氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、葡甲胺、 三氨基甲烷等)等。作为载体蛋白质的具体例，为了提高本发明的疫苗组合物的抗原性，可以使本发 明的肽与公知的KLH溶液(Calbiotec社制，在每1ml的50%甘油溶液中溶解125mg)进行 偶联。本发明的疫苗组合物中使用的稀释剂，可以基于施与的方式和途径、以及标准制 药的实际情况来选择，可列举例如，水或生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、碳酸氢盐溶液等。本发明的疫苗组合物中所用的佐剂，可以基于施与的方式和途径、以及标准制药 的实际情况选择，可列举例如，霍乱毒素、大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)、脂质体或免疫刺 激复合物(ISCOM :immunostimulatingcomplex)等。施与方式根据可能被绿脓杆菌感染的施与对象的年龄、体重、性别、一般健康状态不同而不同，可以通过经口施与、非经口施与(例如，静脉施与、动脉施与、局部施与)的任 一施与途径进行施与，优选为非经口施与。用于经口施与和非经口施与的剂型及其制造方 法对本领域技术人员是公知的，可以通过将本发明的抗原组合物与药学上容许的上述载体 等混合等，按照常规方法来制造。用于经口施与的剂型有固体或液体的剂型，具体可列举溶 液剂、片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。用于非经口施与的剂型可列举溶液剂、悬浮剂、软膏 剂、霜剂、栓剂、滴眼剂、点鼻剂、点耳剂等。在经口施与的情况下，还可以加入香料和着色 料。在希望本制剂缓释时，可以加入生物降解性聚合物(例如，聚-D，L-丙交酯共乙 交酯、聚乙交酯等)作为增容基质(例如，可以参考美国专利5，417，986号公报、美国专利 4，675，381号公报、美国专利4，450，150号公报)。适当的药物用载体和稀释剂等、以及为了使用它们而在药物上必需的物质在 Remington' s Pharmaceutical Sciences 中有记载。本发明的疫苗组合物的施与量，例如，可以根据疫苗抗原的种类、是否与本抗原共 同施与佐剂、共同施与的佐剂的种类、施与的方式和频率、以及所希望的效果(例如，是预 防还是治疗)不同，由本发明者们确定，一般以每名成人每次施与1 P g lOOmg的量施与 本发明的疫苗组合物。在与本疫苗共同施与佐剂的情况下，一般每名成人每次施与lng lmg的量。按照本发明者们的决定，在需要时可反复施与。例如，可以继用于初始化的施与 之后，每隔一周进行用于加强的施与，加强3次。或者使用相同的调合剂在最初免疫接种后 的第8 12周进行用于加强的注射，并且在第16 20周进行第2次加强。[抗体的用途和药物组合物]与绿脓杆菌相关的疾病绿脓杆菌是随着宿主的抵抗力降低而造成致命结果的机会感染的病原菌，另外， 由于对抗生素具有抗性，因而也是造成院内感染的主要病原菌。正如后述实施例所示，在通 过施与粘蛋白而降低了巨噬细胞功能的小鼠绿脓杆菌易感染模型中，确认了本发明的抗体 具有实际的抗感染效果(实施例10)；另外，在通过施与环磷酰胺一水合物而减少了嗜中性 粒细胞的小鼠绿脓杆菌易感染模型中，确认了本发明的抗体具有实际的抗感染效果(实施 例11)。进而，在小鼠多药耐药性绿脓杆菌易感染模型中，确认了本发明的抗体具有实际的 抗感染效果(实施例12)。因此，通过对绿脓杆菌的PA4710蛋白质(特别是其细胞外区域) 作用本发明的抗体，可以预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。本发明的抗体可以对各种性 质的绿脓杆菌应用，并且可以对各种症状的绿脓杆菌感染患者应用。在PA4710蛋白质的细 胞外区域中，由序列号11、12、14的任一个所示氨基酸序列组成的肽的区域，是特别适合这 样的医疗目的的抗体靶标区域。作为对绿脓杆菌感染患者显示抗菌活性的具体抗体，可列 举例如，在FERM BP-10972、FERMBP-10973、FERM BP-10974的保藏编号下保藏的杂交瘤所产 生的抗体。对难以治疗的多药耐药性绿脓杆菌感染症的预防或治疗，在PA4710蛋白质的细 胞外区域中，适合使用针对由序列号14所示氨基酸序列组成的肽区域的抗体(例如，由在 FERM BP-10974的保藏编号下保藏的杂交瘤产生的抗体)(实施例12)。作为与绿脓杆菌相关的疾病，可列举由包括多药耐药性绿脓杆菌的绿脓杆菌感染 引起全身感染疾病，例如，败血症、脑膜炎、心内膜炎等。在耳鼻喉科领域，可列举中耳炎、鼻 窦炎；在呼吸科领域，可列举肺炎、慢性呼吸道感染症、导管感染症；在外科领域，可列举术后腹膜炎、术后胆管等的炎症术后感染症；在眼科领域，可列举眼睑脓肿、泪脓炎、结膜炎、 角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眼眶感染；在泌尿科领域，可列举包括复杂性尿路感染症的 尿路感染症、导管感染症、肛门周围脓肿等。此外，还可列举包括重症烧伤、呼吸道烧伤的烧 伤、褥疮感染症、囊性纤维化病等。根据本发明，提供了与绿脓杆菌相关的疾病的预防方法或治疗方法，包括将预防 上或治疗上有效量的本发明的抗体对包括人的哺乳类施与的工序。绿脓杆菌感染症诊断剂如后述的实施例中所示，确认了本发明的抗体与露出绿脓杆菌细胞表面的PA4710 蛋白质的细胞外区域结合(实施例8)。另外确认了本发明的抗体与露出绿脓杆菌细胞表面 的PA4710蛋白质的细胞外区域结合(实施例9)。这些结果显示，本发明的抗体能够检测绿 脓杆菌的存在。因此，本发明的抗体可以作为绿脓杆菌感染症诊断剂使用。与PA4710蛋白 质的细胞外区域中由序列号11、12、14的任一个所示氨基酸序列组成的肽的区域结合的抗 体，在这样的诊断中是特别理想的抗体。根据本发明，提供了使用本发明的抗体的绿脓杆菌感染的诊断方法。本发明的诊 断方法是通过从可能感染绿脓杆菌的包括人的哺乳动物采集咳痰、肺灌洗液、脓、泪、血液、 尿等生物样品，接着使采集的样品与本发明的抗体接触，判断是否产生抗原抗体反应，从而 进行的。绿脓杆菌感染症诊断药试剂念根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌的存在的试剂盒，该试剂盒至少含有本发 明的抗体。本发明的抗体可以是被标记的抗体。该检测用试剂盒是通过检测抗原抗体反应来 检测绿脓杆菌的存在的。因此本发明的检测试剂盒根据需要可以进一步含有用于进行抗原抗体反应的各 种试剂，例如ELISA法等中使用的2次抗体、发色试剂、缓冲液、说明书和/或器具等。药物组合物本发明的药物组合物或用剂使用本发明的抗体作为有效成分，可以优选以含有经 纯化的抗体组合物和任意成分、例如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液等的组合物 的形态使用。本发明的药物组合物根据需要可以以液体或冻结干燥的形态制剂化，也可以任意 含有药学上容许的载体，例如，稳定剂、防腐剂、等张剂等。作为药学上容许的载体，在冻结干燥的制剂的情况下，可以列举甘露糖醇、乳糖、 蔗糖、人白蛋白等为例，在液体制剂的情况下，可以列举生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲 液、氢氧化铝等为例。但是，并不限于这些。施与方式根据施与对象的年龄、体重、性别、一般健康状态不同而不同，可以通过 经口施与、非经口施与(例如，静脉施与、动脉施与、局部施与)的任一施与途径施与，优选 为非经口施与。药物组合物的施与量根据患者的年龄、体重、性别、一般健康状态、绿脓杆菌感染 症的程度和施与的抗体组合物的成分不同而不同。本发明的抗体组合物在一般静脉内施与 的情况下，对成人每1kg体重每天施与0. 1 lOOOmg，优选为1 lOOmg。
本发明的药物组合物优选对可能被绿脓杆菌感染的患者预先施与。在调制成诊断剂时，可以采用符合目的的任意方法、以任意的剂型获得。例如对于 腹水、含目的抗体的培养液或经纯化的抗体，测定其抗体效价，适当用PBS (含生理浓度食 盐的磷酸缓冲液)等稀释，然后加入0. 叠氮化钠等作为防腐剂。或者在胶乳等上吸附本 发明的抗体，也求出抗体效价并适当稀释，添加防腐剂使用。如上所述，使本发明的抗体与 胶乳粒子结合而成的制剂，是作为诊断药优选的剂型之一。这时适合作为胶乳的树脂材料， 例如聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯、聚丁二烯等胶乳是适当的。
实施例以下，为了加深对本发明的理解而按照实施例进行说明。但本发明并不限于这些 实施例。[实施例1] :GeneChipE 分析作为探索在添加人血清的培养基中表达的基因的方法，使用661^0^沪表达分析 系统(Affymetrix社制GeneChip8绿脓杆菌基因组阵列)。使用绿脓杆菌PA01菌株，在3 套培养条件、即添加0%、20%、50%的人血清的1^1^&-86汁&11土(1^)培养基(f力，4歹 ^夕社制)(最终的LB培养基组成是均勻的)中，在37°C振荡培养至595nm的吸光度为 1.0，使用 RNeasy Protect Bacteria Mini Kit(QIAGEN GmbH 社制)，按照附带文件的方 法提取总RNA，通过Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies社制)进行定量。然后， 按照GeneChipK附带文件的方法进行实验。基因表达数据的分析通过Microarray Suite 5. (KAfTymetrix社制)来进行，对信号和检测进行计算。这时，进行校正使得所有探针组的 信号的平均值为1000。实验独立地进行2次。其结果是，作为管家蛋白质的PA4761蛋白质(DnaK或HSP70)被判定为“存在”，所 述“存在”即显示在任一培养条件下、无论是否添加血清，都可检测到转录产物，从而显示该 基因表达。另外，PA5158蛋白质(OpmG)，以及作为与PA2019蛋白质(MexX)共同构成药剂 排出泵的横跨内膜蛋白质的、由四环素、氨基糖苷类抗生素等核糖体抑制剂诱导的PA2018 蛋白质(MexY) (J. Bacteriology, 2005，187，5341-5346)，在这次不存在这些药剂的条件下 被判定为“不存在”，从而显示这些基因不表达。另一方面，对于PA4710基因，在不添加血 清的条件下被判定为“不存在”，从而显示基因不表达，但在添加血清的条件下被判定为“存 在”。由以上事实毫无疑问地暗示了，PA4710基因表达、作为其基因产物的PA4710蛋白 质在菌体表面稳定存在的可能性。由此暗示，绿脓杆菌的PA4710蛋白质作为疫苗的成分是 有用的。[实施例2]临床分离株中PA4710基因的分析关于使用菌株，将全国的临床机构中从各种临床材料分离出的67株绿脓杆菌(在 明治製菓株式会社横浜研究所保管)进行试验。这些菌株来自血液、尿、咳痰、脓、咽部粘液 等，血清型包括基于由绿脓杆菌研究会主持的型别检讨委员会所决定(1975年)的血清学 的分类的A组、B组、E组、G组、I组、M组等。(1)基因组DNA的制备对于临床分离的67株绿脓杆菌，用米勒-海顿(Mueller-Hinton)培养基(《夕卜> rM ,、)、J >社制)在37°C培养过夜，通过低速离心收集菌体。使用DNeasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH社制)，按照附带文件的方法从得到的菌体制备基因组DNA。(2)通过PCR法扩增DNA片段以制备的基因组DNA为模板，通过PCR扩增含PA4710基因的区域。具体地说，以绿 脓杆菌PA01株的基因组序列(NCBI数据库的登录号NC_002516)为基础，设计特异性地扩 增PA4710基因的引物对(序列号16、序列号17)，用Takara ExTaq(夕力，才株式会 社制)按照附带的说明书，使用GeneAmp PCR System 9700 (Applied BioSystems社制)来 进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳来确认用PCR扩增的DNA片段是目的大小(2635碱基对)。(3)用DNA测序仪分析多核苷酸序列PCR 产物在用 Multiscreen PCR Plate (Millipore Corporation 社制)纯化之 后，进行测序反应。以PA01菌株的基因组序列(NC_002516)为基础，设计能够测序各PCR 产物的引物(序列号18 序列号22)，测序反应使用BigDye Terminator vl. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied BioSystems社制)。测序反应按照附带的说明书，用GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBioSystems社制)进行。测序反应产物使用塞入了预先用水膨 胀的 S印hadexG-50 Fine DNA Grade (Amersham Biosciences AB 社制)的 MultiScreen—HV Kit (Millipore Corporation 社制)纯化，然后使用 Applied Biosystems3730 DNA Analyzer (Applied BioSystems社制)进行多核苷酸序列分析。将通过上述分析判明的临床分离株的多核苷酸序列转换成多肽序列，与PA01株 的序列进行比较研究，结果在PA4710蛋白质的全长序列中，发现了 17处变异(表1)。进而，以由大肠杆菌FhuA蛋白质的结构分析信息(Cell，1998，95，771-778、 Science, 1998，282，2215-2220)、大肠杆菌F印A蛋白质的结构分析信息(Nat. Struct. Biol.，1999，6，56-63)、大肠杆菌FecA蛋白质的结构分析信息(Science, 2002，295， 1715-1719、J. Mol. Biol.，2003，332，353-368)、绿脓杆菌 FpvA 蛋白质的结构分析信息 (J. Mol. Biol.，2005，347，121-134)和PA4710蛋白质的2级结构预测信息所得到的信息为 基础进行结构分析，由该分析，在不包含该17处变异的肽区域(氨基酸序列保守的肽区域) 中发现了细胞外区域(序列号5 序列号15)。这些绿脓杆菌的PA4710蛋白质的细胞外区 域的肽作为“绿脓杆菌共同抗原”是有用的。[表1]临床分离株中PA4710蛋白质的变异图谱
表示是与PA01株相同的氨基酸[实施例3]:PA4710基因DNA片段的克隆通过以下方法，将绿脓杆菌PA4710基因(序列号1)的氨基酸编码区2295碱 基中的第541位 第22%位的DNA片段(序列号2)插入无细胞体系蛋白质表达载体 pIVEX2. 4d (Roche Diagnostics 社)和大肠杆菌表达载体 pET15b (Novagen 社)中。以信号序列和与PA4710蛋白质属于同族的TonB依赖性受体的大肠杆菌FhuA蛋 白质的结构分析信息(Cell, 1998,95, 771-778、Science, 1998，282，2215-2220)、大肠杆菌 F印A蛋白质的结构分析信息(Nat. Struct. Biol.，1999，6，56-63)、大肠杆菌FecA蛋白质的 结构分析信息(Science, 2002，295，1715-1719、J. Mol. Biol. , 2003，332，353-368)、绿脓杆 菌FpvA蛋白质的结构分析信息(J. Mol. Biol.，2005，347，121-134)和PA4710蛋白质的2 级结构预测信息为基础，推测氨基酸编码区的第1位 第540位的碱基序列编码不露出细 胞表面的部分，因而从克隆对象中排除。通过PCR(DNA Thermal Cycler 4洲；Perkin_Elmer 社制)从绿脓杆菌 PA01 株 的基因组DNA扩增克隆的DNA片段。DNA聚合酶使用Pyrobest (宝酒造社制)，在反应 液中添加5%的二甲基亚砜，PCR引物使用含有用于添加限制性酶位点XhoI(CTCGAG)和 BamHI (GGATCC)的碱基的引物(序列号23、序列号24)。PCR的温度条件是在94°C加热2分钟，然后将94°C 30秒、60°C 1分钟和72°C 2分 钟进行 30 个循环。使用 GenElute PCR DNA Purification Kit (Sigma 社制)纯化 PCR 产 物，再用Xhol (New England Biolabs社制)和BamHI (东洋纺社制)切割。用Xhol和BamHI 切割pIvEX2. 4d，将这些DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen社制)进行提取纯化。将用xhol-BamHI切割的PCR产物和pIVEX2. 4d用T4DNA 连接酶(Invitrogen社制)连接，转化大肠杆菌DH5 a菌株(Competent High DH5a、东洋 纺社制)。将插入了 PA4710基因片段的pIVEX2. 4d质粒(pIVEX-PA4710_l)使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen 社制)进行纯化，再使用 BigDye Terminator vl. ICycleSequencingKit (Applied Biosystems社制)进行循环测序反应，确认插入部分的碱基序列 (3730 DNA Analyzer, Applied Biosystems/HITACHI 社制)。接着，将pET15b 用 Xhol 和 BamHI 切割，与 pIVEX_PA4710_l 的 XhoI-BamHI 插入片 段连接并转化大肠杆菌，从而得到插入了 PA4710基因片段的pET15b质粒(pET-PA4710-4)。[实施例4]:PA4710重组蛋白质的表达和纯化重组蛋白质的表达使用无细胞和大肠杆菌的表达体系。无细胞体系使用了利用T7 RNA聚合酶和大肠杆菌裂解物进行转录和翻译的RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit (Roche Diagnostic 社制)。无细胞体系蛋白质表达载 体pIVEX-PA4710-l，是编码在T7启动子的下游融合了 His标签(6个连续的组氨酸)的 PA4710蛋白质的质粒(参考实施例3)。按照操作说明书制备无细胞体系反应液，添加10 yg 的pIVEX-PA4710-l并在30°C反应20小时，然后通过离心回收生成的不溶性蛋白质。大肠杆菌表达体系使用插入了 T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株和 具有T7启动子的pET载体表达体系(Novagen社制)。大肠杆菌表达载体pET_PA4710_4， 是编码在T7启动子的下游融合了 His标签的PA4710蛋白质的质粒(参考实施例3)。用 氯化钙处理BL21 (DE3)菌株(参考Molecular Cloning (分子克隆)第2版、Sambrook等 (1989))，用pET-PA4710-4进行转化。将转化体在含50 u g/ml氨苄青霉素的LB培养基 中培养过夜，稀释200倍悬浮在新的培养基中，在37°C培养4小时，然后添加最终浓度为 0.5mM的IPTG，进一步培养3小时。通过离心回收细胞，在_20°C冻结。用蛋白质提取试剂 BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen 社制)溶解细胞，依据附带说明书回 收包涵体。这时，进行超声波处理，溶菌酶(卵清溶菌酶、生化学工業社制)的最终浓度为 200y g/ml。蛋白质的纯化使用了利用His标签的M螯合层析法。将无细胞或大肠杆菌的表 达体系所表达的不溶性蛋白质用溶解缓冲液(添加了 8M尿素、5mM咪唑、200mM NaCl和 0. 05% NP-40的杜尔贝科(Dulbecco)磷酸缓冲盐类溶液(PBS))进行可溶化。使溶解的蛋 白质与Ni-NTA Agarose (Qiagen社制)结合，用40倍体积的溶解缓冲液进行洗涤。进一步 用40倍体积的洗涤缓冲液(除去了 NP-40的溶解缓冲液)洗涤，然后用洗脱缓冲液(添加 了 8M尿素、300mM咪唑、200mM NaCl的PBS)洗脱并回收带有His标签的蛋白质。其结果是，在无细胞体系中从1ml反应液最终得到1. 7mg蛋白质，在大肠杆菌表达 体系中从100ml培养最终得到7. 2mg蛋白质。[实施例5]抗原的免疫和血清的制备绿脓杆菌使用下述灭活菌，所述灭活菌是将PA103菌株(ATCC29260)在米勒-海 顿琼脂培养基上、在37°C培养过夜，将数个菌落悬浮在LB培养基中，然后在37°C振荡培养 过夜，用PBS洗涤、重悬浮，然后加入福尔马林使其为1 %，进行24小时以上的灭活处理而得 的。对于PA4710重组蛋白质的免疫，将该蛋白溶解在8M尿素溶液中使其浓度为100 y g/ml 而使用在PA4710蛋白质中氨基酸序列保守的区域中发现的细胞外区域的氨基酸序列 (序列号5 序列号15)中，通过使用Fmoc的固相合成法，合成包含序列号6 序列号15 的肽。合成在序列号6 序列号15的各氨基酸序列的氨基末端添加半胱氨酸残基、并将羧 基末端酰胺化的肽(序列号25 序列号37)。
在含有4710Loop2(序列号6)的氨基酸序列的合成肽4710L2 (序列号25)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 2446. 199(计算值m/z 2447. 451)，通过HPLC分析，在保留时 间10. 265分钟得到面积比为88. 29%的峰。在含有4710Loop3(序列号7)的氨基酸序列的合成肽4710L3A(序列号26)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 1587. 823 (计算值m/z 1588. 713)，通过HPLC分析，在保留时 间12. 205分钟得到面积比为59. 02%的峰。在含有4710Loop3(序列号7)的氨基酸序列的合成肽4710L3B(序列号27)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 1461. 256 (计算值m/z 1457. 65)，通过HPLC分析，在保留时 间15. 568分钟得到面积比为73. 71%的峰。在含有4710Loop4(序列号8)的氨基酸序列的合成肽4710L4(序列号28)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 2683. 446 (计算值m/z 2682. 107)，通过HPLC分析，在保留时 间13. 117分钟得到面积比为73. 64%的峰。在含有4710Loop5(序列号9)的氨基酸序列的合成肽4710L5 (序列号29)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 2335. 175(计算值m/z 2335. 495)，通过HPLC分析，在保留时 间12. 629分钟得到面积比为83. 12%的峰。在含有4710Loop6 (序列号10)的氨基酸序列的合成肽4710L6 (序列号30)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 1681. 271 (计算值m/z 1679. 824)，通过HPLC分析，在保留时 间9. 656分钟得到面积比为73. 45%的峰。在含有4710Loop7(序列号11)的氨基酸序列的合成肽4710L7 (序列号31)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 1731. 422 (计算值m/z 1730. 92)，通过HPLC分析，在保留时 间14. 669分钟得到面积比为56. 67%的峰。在含有4710Loop8(序列号12)的氨基酸序列的合成肽4710L8A(序列号32)中， 通过质量分析，观测到[M+l]m/z 1337. 108(计算值m/z 1335. 501)，通过HPLC分析，在保留 时间14. 011分钟得到面积比为81. 31%的峰。在含有4710Loop8(序列号12)的氨基酸序列的合成肽4710L8B(序列号33)中， 通过质量分析，观测到[M+l]m/z 1037. 734(计算值m/z 1037. 066)，通过HPLC分析，在保留 时间10. 083分钟得到面积比为70. 18%的峰。在含有4710Loop9(序列号13)的氨基酸序列的合成肽4710L9 (序列号34)中，通 过质量分析，观测到[M+l]m/z 1316. 107(计算值m/z 1315. 426)，通过HPLC分析，在保留时 间11. 011分钟得到面积比为70. 61%的峰。在含有4710Loopl0(序列号14)的氨基酸序列的合成肽4710L10 (序列号35)中， 通过质量分析，观测到[M+l]m/z 1467. 748(计算值m/z 1465. 514)，通过HPLC分析，在保留 时间13. 276分钟得到面积比为65. 81%的峰。在含有4710Loopll(序列号15)的氨基酸序列的合成肽4710L11A(序列号36)中， 通过质量分析，观测到[M+l]m/z 1186. 740 (计算值m/z 1184. 244)，通过HPLC分析，在保留 时间12. 609分钟得到面积比为55. 14%的峰。在含有4710Loopll(序列号15)的氨基酸序列的合成肽4710L11B (序列号37)中， 通过质量分析，观测到[M+l]m/z 1258. 403 (计算值m/z 1257. 434)，通过HPLC分析，在保留 时间14. 268分钟得到面积比为61. 47%的峰。
使用了利用Fmoc的固相合成法来合成含有位于细胞内区域的氨基酸序列的肽。 合成在各肽的氨基酸序列的氨基末端添加半胱氨酸残基、并将羧基末端酰胺化的肽。在含有位于细胞外区域4710Loop7(序列号11)与4710Loop8 (序列号12)之间 所存在的细胞内区域的氨基酸序列的合成肽4710A(序列号38)中，通过质量分析，观测到 [M+l]m/z 1110. 919 (计算值m/z 1110. 25)，通过HPLC分析，在保留时间13. 687分钟得到 面积比为71. 88%的峰。在含有位于细胞外区域4710Loop9(序列号13)与4710Loopl0 (序列号14)之间 所存在的细胞内区域的氨基酸序列的合成肽4710C(序列号39)中，通过质量分析，观测到 [M+l]m/z 1107. 356 (计算值m/z 1105. 097)，通过HPLC分析，在保留时间10. 992分钟得到 面积比为58. 52%的峰。进而，同时制备使上述合成肽经由间隔物与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联而成的缀 合肽。作为间隔物，使用磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己 烷-1-甲酸酯Pierce社制)。此外，肽合成及其KLH缀合肽的制备委托hermo ELECTRON 社。对于KLH缀合肽的免疫，将各KLH缀合肽溶解在8M尿素溶液中使得其最终浓度为 83.3i!g/ml而使用。作为对动物的免疫方法，在雄性BN大鼠(挪威棕色大鼠，从日本★ ^ 一-j K一社购入)或雌性新西兰白兔(从日本— 'J A—社购入)的皮下或肌 肉内免疫，仅初次与弗氏完全佐剂一同免疫，第2次以后与不完全佐剂一同免疫，免疫间隔 为2周，共计免疫6次。福尔马林灭活菌、PA4710重组蛋白质分别以20 u g/只动物进行免 疫，各KLH缀合肽以41. 7 y g/只动物进行免疫。在最后1次免疫的1周之后，从颈动脉或 腹部大动脉进行采全血，在室温放置1小时，然后进行离心分离(1500G、20分钟)，上清为抗 血清，每只大鼠得到约5ml，每只兔得到约50ml。[实施例6]自抗血清和腹水的IgG级分的纯化来自大鼠抗血清和腹水的IgG级分的纯化，按照McCauley R&Racker，E ； Molecular and Cellular Biochemistry 1，73-81 (1973)等的使用硫酸铵沉淀的方法(硫 酸铵沉淀法)来进行。在硫酸铵沉淀法中，在抗血清中添加冰冷的饱和硫酸铵溶液(pH8)使其为43 (v/ v) %，将得到的悬浮液在室温搅拌15分钟。通过以10，OOOXg离心20分钟来回收沉淀，并 通过将沉淀溶解在添加了 10%甘油的10mM磷酸钾缓冲液(pH8)中，然后通过添加冰冷的饱 和硫酸铵溶液(PH8)使其为50(v/v) %再次析出沉淀来进行2次洗涤。将沉淀溶解在添加 了 10%甘油的10mM磷酸钾缓冲液(pH8)中，接着对该缓冲液透析过夜。离心，然后添加到阴 离子交换层析柱(DEAE-Toyopearl 650M(T0S0H社制))中，通过测定280nm的紫外吸收，从 而将直接通过的容积作为IgG级分回收。最终真实样品使用Amicon Ultra-15 (Millipore) 进行浓缩，最后在PBS (-)溶液中交换。从5ml的PA4710重组蛋白质免疫大鼠抗血清中进行 纯化，作为IgG级分，回收得到54mg蛋白质。将得到的纯化IgG级分命名为抗PA4710IgG。 蛋白定量是通过基于Lowry法的DC Protein Assay (Bio-Rad社制)进行的，IgG的纯度是 通过SDS-PAGE评价的。另夕卜，作为简易的其他方法，可以使用Harlow&Lane, 288-318，Chapter 8， Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor(1988) 白勺i^ffi.gl白勺力夕去。大鼠抗血清或者在小鼠腹腔增殖大鼠_小鼠杂交瘤而得的腹水以10，OOOXg离心20分钟 除去不溶物，在上清中添加2倍体积的60mM乙酸钠(pH4.0)，然后用IN盐酸将pH调整为 4. 8。在室温下对腹水样品缓慢添加0. 06倍体积的辛酸，搅拌30分钟，从而生成不溶物。 以13，OOOXg离心10分钟除去沉淀，然后使其通过0.45μπι的过滤器。在将得到的样品 使用Amicon Ultra_15 (Millipore社制)浓缩之后，最终在PBS (-)溶液中交换，制成最终 标品。从大鼠抗血清IOml或者含有由独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中 心的保藏编号为 FERM BP-10970、FERM BP-10971、FERM BP-10972、FERM BP-10973、FERM BP-10974的杂交瘤所产生的大鼠MAb的小鼠腹水llmL、9mL、llmL、40mL、36mL中进行纯化， 作为IgG级分，回收了 24mg、6. 5mg、2. 7mg、4. 5mg、6.8mg、5. 2mg的蛋白质。蛋白定量是通过 基于Lowry法的DC Protein Assay (Bio-Rad社制)进行的，IgG的纯度是通过SDS-PAGE评 价的。[实施例7]:ELISA试验为了用ELISA法检测与PA4710重组蛋白质结合的抗体，将PA4710重组蛋白质溶 解在添加了 8M尿素的 PBS 中，在镍包被 96 孔板(HIS-SelectHigh Sensitivity (HS) Nickel Coated Plates，Sigma社制)上每孔加入0. 5 μ g的蛋白质，在室温放置1小时使其与板结 合。用洗涤缓冲液(添加了 0. 05%吐温20、5mM咪唑和500mM NaCl的PBS)进行洗涤，用 封闭缓冲液(添加了 0.5%明胶的洗涤缓冲液)进行封闭，然后将含有实施例5或6所得 抗体的样品加入孔中，反应30分钟，然后洗涤，加入2次抗体(过氧化物酶标记的山羊抗大 鼠IgG抗体、10000倍稀释、Sigma社制)，反应30分钟，然后进行洗涤。添加发色底物(TMB Microwell Peroxidase SubstrateSystem、KPL社制)并进行反应，然后用IM磷酸停止酶 反应，测定450nm的吸光度。其结果是，PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清(10，000倍稀释)的吸光度为0. 676， 与此相对，作为阴性对照的免疫前血清(10，000倍稀释)的吸光度为0.058。这表示在 PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清中，含有与作为免疫原的PA4710重组蛋白质结合的抗体。另外为了用ELISA法检测与合成肽(序列号25 39)结合的抗体，将合成肽溶解 在碳酸缓冲液(0. 15% Na2C03、0. 3% NaHCO3)中，在96孔板(Maxisorp、Nunc社制)上每孔 加入1 μ g的肽，在4°C放置过夜，使其吸附在板上。用PBS进行洗涤，用添加了 0. 5%牛血 清白蛋白的PBS进行封闭，然后将含有实施例5或6所得的抗体的样品进行稀释并加入孔 中，反应2小时，然后用含有0. 05%吐温20的PBS进行洗涤。将2次抗体加入孔中并反应 1小时，然后用含有0. 05%吐温20的PBS进行洗涤。与上述同样地进行发色，测定吸光度。 结果在后述实施例9中显示。[实施例8]全细胞ELISA试验全细胞ELISA，是将用LB培养基培养的PA103菌株的菌液分别注入ELISA板 (MaxiSorp Type，NUNC社制)中，在4°C进行固相化，然后用洗涤缓冲液(含有0.05%吐温 20的TBS)进行洗涤，用封闭缓冲液(含有2%牛血清白蛋白的TBS)进行封闭，然后作为1 次抗体样品，加入用PBS稀释的实施例5所得的血清或纯化IgG级分，在37°C使其反应1 小时。洗涤之后，作为2次抗体使用过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体(5000倍稀释、 Sigma 社制)，添加发色底物(TMB Microwell Peroxidase substrateSystem、KPL 社制)并 进行反应，然后用0. 18M硫酸停止酶反应，测定450nm的吸光度。
其结果是，对于PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清，作为阴性对照的免疫前大鼠血 清(100倍稀释)的吸光度为0. 142，与此相对，在免疫了 PA4710重组蛋白质的大鼠血清 (100倍稀释)中，吸光度为0.462。这表示，在PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清中，含有识 别露出菌体表面的PA4710蛋白质的细胞外区域的抗体(IgG)。另外，对于作为由PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清获得的纯化IgG级分的抗 PA4710 IgG，作为阴性对照的从仅施与佐剂而得的对照大鼠血清中纯化出的IgG级分 (50yg/孔)的吸光度为0. 116，与此相对，在抗PA4710IgG(50iig/孔)中，吸光度为0. 377。 这表示，在该IgG级分中，含有识别露出细胞表面的PA4710蛋白质的细胞外区域的抗体 (IgG)。[实施例9]单克隆抗体(MAb)的制作在PA4710重组蛋白质或KLH缀合肽的实施例5中的最后1次免疫1周之后，从大 鼠中在麻醉下无菌地摘取脾脏。将得到的脾脏用RPMI-1640培养基(Gibco社制)洗涤，然 后在载玻片中夹入脾脏，作为粉碎微小片而得到供试脾细胞。将得到的脾细胞用RPMI-1640 培养基以lOOOrpm离心5分钟来进行洗涤。另一方面，将预先用含有10% FCS (胎牛血清) 的RPMI-1640培养基在5% C02、相对湿度100%、37°C的条件下培养并处于对数期的骨髓瘤 细胞(P3X63Ag8Ul细胞)，用RPMI-1640培养基进行离心洗涤，进行混合使得上述脾细胞与 骨髓瘤细胞的比为4 1。将混合的细胞以lOOOrpm离心5分钟，倒掉上清并使细胞充分松 散。在含有该细胞的离心管中缓慢加入lmL的由2g聚乙二醇(M.W. 1000、和光纯药社制)、 2mLRPMI-1640培养基和0. 2mL DMS0( f力，4〒^夕社制)组成的溶液，缓慢旋转离心管 使细胞混合。1分钟之后，在缓慢旋转离心管的同时经过3分钟加入15mL RPMI-1640培养 基。以lOOOrpm离心5分钟，然后倒掉上清并使细胞充分分散，然后用HAT培养基(Gibco 社制)进行调整使得脾细胞为1.6X106个/mL，在96孔微量培养板(住友《一々7 4卜社 制)中分别注入0. 2mL。在5% C02、相对湿度100%、37°C的条件下培养约1 2周，然后 在显微镜下观察孔中生长的杂交瘤。(1)目的抗体的筛选用实施例7所记载的ELISA法检测与PA4710重组蛋白质或PA4710蛋白质的推定 的细胞外区域(序列号5 15)结合的抗体。另外，用实施例8所记载的全细胞ELISA法 检测与绿脓杆菌细胞表面结合的抗体。(2)产生目的抗体的细胞的克隆将筛选结果判定为产生目的抗体的杂交瘤，用含5%的BM-CondimedHl Hybridoma Cloning Supplement (Roche Diagnostics 社制)的 10% FCS/HT (Gibco 社制)培养基进行 调整，使得其为5个/0. 2mL或20个/0. 2mL,在96孔微量培养板的各孔中分别注入0. 2mL 进行培养。1 2周之后可以在显微镜下观察克隆的生长。通过筛选项所述的方法进行 分析，从而选择产生目的抗体的克隆。再次通过上述的方法用含5%的BM-Condimed HI Hybridoma Cloning Supplement 的 10% FCS/HT(Gibco 社制)培养基调整杂交瘤，使得其 为1个/0. 2mL或2个/0. 2mL，将调整后的杂交瘤在各孔中分别注入0. 2mL。1 2周之后 通过筛选项所述的方法进行分析并选择产生目的抗体的单克隆，从而得到独立行政法人产 业技术综合研究所专利生物保藏中心的保藏编号为FERM BP-10970、FERMBP-1097U FERM BP-10972.FERM BP-10973、FERM BP-10974 的杂交瘤。
(3)体外(in vitro)细胞的培养和MAb的产生将在96孔微量培养板中充分增殖的目的克隆逐渐放大至48孔板、12孔板、50mL 烧瓶、250mL烧瓶并用10% FCS-RPMI培养基进行培养。用实施例7所记载的ELISA法检测 这样得到的细胞的培养上清中产生的MAb。其结果是，在用于检测与吸附了作为细胞外区域的4710Loop3(序列号7)所包 含的实施例5的合成肽4710L3A (序列号26)的孔的结合的ELISA中，作为阴性对照的 10% FCS-RPMI培养基的吸光度为0. 078，与此相对，独立行政法人产业技术综合研究所专 利生物保藏中心的保藏编号为FERMBP-10971的杂交瘤的培养上清的吸光度为1.382。在 用于检测与吸附了作为细胞外区域的4710Loop7(序列号11)所包含的实施例5的合成 肽4710L7(序列号31)的孔的结合的ELISA中，10% FCS-RPMI培养基的吸光度为0. 097， 与此相对，保藏编号为FERM BP-10972的杂交瘤的培养上清的吸光度为0.637。另外，在 用于检测与吸附了作为细胞外区域的4710Loop8(序列号12)所含的实施例5的合成肽 4710L8A(序列号38)的孔的结合的ELISA中，10 % FCS-RPMI培养基的吸光度为0. 071， 与此相对，保藏编号为FERM BP-10970的杂交瘤的培养上清的吸光度为1.211。此外，保 藏编号为FERM P-21205的杂交瘤的培养上清，在用于检测与吸附了作为细胞外区域的 4710Loop8 (序列号12)所含的实施例5的合成肽4710L8B (序列号33)的孔的结合的ELISA 中，吸光度为0. 497，与此相对，在用于检测与吸附了除4710L8B以外的肽(序列号25 序列号32、序列号34 序列号39)的孔的结合的ELISA中，吸光度为0. 060 0. 088。保 藏编号为FERMBP-10974的杂交瘤的培养上清，在用于检测与吸附了作为细胞外区域的 4710Loopl0(序列号14)所包含的实施例5的合成肽4710L10(序列号35)的孔的结合的 ELISA中，吸光度为0.810，与此相对，在用于检测与吸附了除4710L10以外的肽(序列号 25 序列号34、序列号36 序列号39)的孔的结合的ELISA中，吸光度为0. 061 0. 085。 由以上结果明确了，产生了与各个肽结合的MAb。(4)体内(in vivo)细胞的腹水化和MAb的产生将独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的保藏编号为FERM BP-10971、FERM BP-10972、FERM BP-10970、FERM BP-10973、FERM BP-10974 的杂交瘤对 BALB/c-nu/nu小鼠(从日本子~ 一义^ V广一社购入)以1 X 107个/只小鼠进行腹腔内 施与，1 2周之后采取腹水。将腹水中所含的MAb用实施例6所记载的方法进行纯化，将 得到的纯化IgG级分分别命名为抗4710L3A IgG(MAb)、抗4710L7 IgG(MAb)、抗4710L8A 186(獻13)、抗47101^88 186(獻13)、抗47101^10 IgG (MAb) 对于该大鼠 MAb 的 IgG 亚类，用 单克隆抗体分型试剂盒(RMT1、大日本制药社制)判定重链和轻链，结果是重链分别判定为 IgGl、IgG2a、IgGl、IgG2b、IgG2b，轻链全部判定为 k。通过实施例8所记载的全细胞ELISA，确认了用实施例6所记载的方法从小鼠腹水 中纯化出的上述MAb与绿脓杆菌表面结合。抗4710L7IgG(MAb)的结果作为从施与了保藏编号为FERMBP-10972的杂交瘤的 小鼠腹水中纯化得到的IgG级分，抗4710L7 IgG (MAb)的吸光度为0. 601，与此相对，作为阴 性对照，从仅施与了佐剂的对照大鼠血清中纯化得到的IgG级分(50iig/孔)的吸光度为 0. 280。由该结果明确了，该IgG级分中，含有识别露出细胞表面的PA4710蛋白质的细胞外 区域的抗体(IgG)。
抗4710L8B IgG(MAb)的结果作为从施与了保藏编号为FERMBP-10973的杂交瘤 的小鼠腹水中纯化得到的IgG级分，抗4710L8B IgG(MAb)的吸光度为0. 530，与此相对，作 为阴性对照，从仅施与了佐剂的对照大鼠血清中纯化得到的IgG级分(50 μ g/孔)的吸光 度为0. 244。由该结果明确了，该IgG级分中，含有识别露出细胞表面的PA4710蛋白质的细 胞外区域的抗体(IgG)。
抗4710L10 IgG(MAb)的结果作为从施与了保藏编号为FERMBP-10974的杂交瘤 的小鼠腹水中纯化得到的IgG级分，抗4710L10 IgG(MAb)的吸光度为0. 435，与此相对，作 为阴性对照，从仅施与了佐剂的对照大鼠血清中纯化得到的IgG级分(50 μ g/孔)的吸光 度为0. 092。由该结果明确了，该IgG级分中，含有识别露出细胞表面的PA4710蛋白质的细 胞外区域的抗体(IgG)。[实施例10]:PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清对正常小鼠中PA103菌株全身感 染的抗感染能力正常小鼠全身感染模型中的评价，是将悬浮在500μ 1含5%粘蛋白的生理盐水中 的ΡΑ103菌株的活菌以1. OX IO5Cfu/只小鼠(20LD5Q)对4周龄的OT-I小鼠(从日本子乂 一> ^ -J κ一社购入)进行腹腔内施与，之后立即将用生理盐水稀释2. 5倍的血清样品以 0. ImL/只小鼠从尾静脉施与，根据7天后生死来判定抗感染活性。其结果是，在作为阴性对照的大鼠假(sham)血清的施与组中，7只小鼠中5只死 亡，但在免疫了福尔马林灭活PA103菌株的兔血清施与组中，全部存活，从而确认了抗感染 活性。在该条件下，PA4710重组蛋白质免疫大鼠血清施与组中，7只小鼠中6只存活，从而 确认了抗感染活性。[实施例11]:PA4710单克隆抗体对嗜中性粒细胞减少小鼠中PA103菌株全身感 染的抗感染能力嗜中性粒细胞减少小鼠全身感染模型中的评价，是制备环磷酰胺(以下称为CY， Sigma-Aldrich社制)的12. 5mg/mL (生理盐水)溶液，对4周龄的OT-I雄性小鼠以125mg/ kg的施与量进行腹腔内施与，在第-5、-2、0天合计施与3次，从而使末梢血中的嗜中性粒细 胞减少。然后，将悬浮在250 μ 1生理盐水中的ΡΑ103菌株以1. 8 X IO5Cfu/只小鼠(133LD5Q) 接种在腹腔内，之后立即将用生理盐水稀释的样品(血清和纯化IgG级分)以0.2mL/只小 鼠从尾静脉施与，根据7天后的生死来判定抗感染活性。其结果是，在以纯化血清IgG级分为样品的情况下(0. 5mg/只小鼠)，在作为阴性 对照的大鼠假IgG施与组中，7只小鼠中6只死亡，仅1只存活，但在由福尔马林灭活PA103 菌株免疫血清得到的抗PA103IgG施与组中，7只中5只存活，从而确认了抗感染活性。在该 条件下，在实施例9所得的作为大鼠MAb的抗4710L7 IgG(MAb)和抗4710L8B IgG(MAb)施 与组中，7只中各有4和5只存活，从而确认了抗感染活性。[实施例12]纯化血清IgG级分和单克隆抗体对嗜中性粒细胞减少小鼠中多药耐 药性绿脓杆菌全身感染的抗感染能力各种抗菌剂对多药耐药性绿脓杆菌MSC06120菌株的最小发育阻止浓度为亚安培 Fl (Imipenem) 32 μ g/mlJSJ^^M (Amikacin) 64 μ g/mU^fl^itPM (Ciprofloxacin) > 256yg/mL·使用本菌株的嗜中性粒细胞减少小鼠全身感染模型中的评价，是制备CY的 12. 5mg/mL(生理盐水)溶液，对4周龄的OT-I雄性小鼠以125mg/kg的施与量进行腹腔内施与，在第-5、-2、0天合计施与3次，从而使末梢血中的嗜中性粒细胞减少，然后，将悬浮在 250 μ 1生理盐水中的MSC06120菌株以1. 73 X IO5Cfu/只小鼠(15. 5LD50)接种到腹腔内，之 后立即将用生理盐水稀释的样品以0. 2mL/只小鼠从尾静脉施与，根据7天后的生死来判定 抗感染活性。其结果是，在以纯化血清IgG级分和单克隆抗体为样品 的情况下(0.5mg/只小 鼠)，在作为阴性对照的大鼠假IgG施与组中，7只小鼠中4只死亡，仅3只存活，但在由福 尔马林灭活PA103菌株免疫血清得到的抗PA103 IgG施与组中，7只中4只存活。在该条件 下，在实施例6所得的抗4710 IgG和实施例9所得的作为大鼠MAb的抗4710L10 IgG (MAb) 施与组中，7只中分别有6和5只存活，从而确认了抗感染活性。产业可利用性本发明提供具有实质性地预防或治疗绿脓杆菌感染的能力、且能够应对来自绿脓 杆菌感染患者的临床分离株的多样性的疫苗组合物和多克隆抗体(以下，记为PAb)或单克 隆抗体(以下，记为MAb)，可以应用于绿脓杆菌感染症的预防或治疗剂，或绿脓杆菌感染症 诊断药。进而考虑到本发明的抗体与存在于绿脓杆菌的外膜或者细胞外的PA4710蛋白质 的细胞外区域结合，并且这些区域无论血清型等如何在菌株之间的保守性都极高，且与多 种临床分离株反应，因此可期待针对绿脓杆菌感染症的高的治疗效果。
权利要求
选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的蛋白质(i)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii)由与编码序列号4所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)含有与序列号4所示氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
2.由下述氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列包含在选自序列号3所示氨基酸序列 中的181位 198位、204位 257位、259位 311位、313位 319位、321位 436位、 440位 491位、493位 600位、602位 764位中的氨基酸序列中，且该肽编码从绿脓杆 菌的表面露出的肽区域。
3.由权利要求2所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。
4.由序列号5 15的任一项所示氨基酸序列组成的肽。
5.由权利要求4所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。
6.由含有权利要求2所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。
7.由含有权利要求3所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。
8.由含有权利要求4所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。
9.由含有权利要求5所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。
10.针对来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质或其一部分的抗体或其功能性片段。
11.如权利要求10所述的抗体或其功能性片段，来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的一部 分是来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域。
12.针对权利要求1所述的蛋白质的抗体或其功能性片段。
13.针对权利要求2所述的肽的抗体或其功能性片段。
14.针对权利要求3所述的肽的抗体或其功能性片段。
15.针对权利要求4所述的肽的抗体或其功能性片段。
16.针对权利要求5所述的肽的抗体或其功能性片段。
17.针对权利要求6所述的肽的抗体或其功能性片段。
18.抗体或其功能性片段，与由序列号5 15的任一氨基酸序列组成的肽结合，且不与 由除序列号5 15的氨基酸序列以外的氨基酸序列组成的肽结合。
19.如权利要求10所述的抗体或其功能性片段，与绿脓杆菌表面结合。
20.如权利要求10 19的任一项所述的抗体或其功能性片段，抗体是单克隆抗体。
21.如权利要求10所述的抗体或其功能性片段，对感染了绿脓杆菌的患者具有抗菌活性。
22.如权利要求21所述的抗体或其功能性片段，患者是处于嗜中性粒细胞减少的状态 的患者。
23.如权利要求21所述的抗体或其功能性片段，绿脓杆菌是多药耐药性绿脓杆菌。
24.如权利要求21 23的任一项所述的抗体或其功能性片段，抗体是单克隆抗体。
25.抗体或其功能性片段，是由在FERM BP-10970、FERM BP-1097U FERM BP-10972、 FERM BP-10973.FERM BP-10974的任一保藏编号下保藏的杂交瘤产生的。
26.单克隆抗体或其功能性片段，与下述抗原反应，所述抗原是与下述单克隆抗体的抗 原相同的抗原，所述单克隆抗体是由在FERM BP-10970、FERM BP-10971、FERM BP-10972、 FERM BP-10973、FERM BP-10974的任一保藏编号下保藏的杂交瘤产生的。
27.产生权利要求20所述的抗体的杂交瘤。
28.产生权利要求24所述的抗体的杂交瘤。
29.在FERMBP-10970,FERM BP-1097UFERM BP-10972,FERMBP-10973,FERM BP-10974 的保藏编号下保藏的杂交瘤。
30.抗原组合物，含有能够产生针对来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的抗体的蛋白质抗 原或肽抗原。
31.抗原组合物，含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2 9的任一项所述的肽。
32.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，含有权利要求30或31所述 的抗原组合物，并可根据情况含有1种以上药学上容许的载体、稀释剂和/或佐剂。
33.如权利要求32所述的疫苗组合物，与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染引起 的全身感染疾病。
34.如权利要求33所述的疫苗组合物，绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。
35.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，含有权利要求10 19、 21 23、25、26的任一项所述的抗体或其功能性片段，并可根据情况含有1种以上药学上容 许的载体和/或稀释剂。
36.如权利要求35所述的药物组合物，与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染引起 的全身感染疾病。
37.如权利要求36所述的药物组合物，绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。
38.绿脓杆菌感染症诊断剂，含有权利要求10 19、25、26的任一项所述的抗体或其功 能性片段。
39.绿脓杆菌检测试剂盒，含有权利要求10 19、25、26的任一项所述的抗体或其功能 性片段。
全文摘要
本发明的课题是提供具有实质性地预防或治疗绿脓杆菌感染的能力、且能够作为应对来自绿脓杆菌感染患者的临床分离株的多样性的疫苗组合物使用的蛋白质抗原或肽抗原，以及针对该抗原的抗体。本发明提供用于与绿脓杆菌相关的疾病的诊断、预防或治疗的蛋白质抗原或肽抗原以及针对这些抗原的抗体。根据本发明，提供了用于与绿脓杆菌相关的疾病的诊断、预防或治疗的来自绿脓杆菌的外膜蛋白质PA4710的蛋白质或肽，以及针对它们的抗体。
文档编号C12N5/10GK101878302SQ20088002256
公开日2010年11月3日 申请日期2008年6月30日 优先权日2007年6月29日
发明者大塚圭子, 熊谷正志, 田中二朗, 赤羽宏友, 铃木贵久, 长曾宏 申请人:明治制果株式会社