专利名称：具有抗绿脓杆菌作用的人源化PcrV抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及识别PcrV的人源化单克隆抗体或其部分。具体而言，本发明涉及中和活性(下文也称为细胞毒性抑制活性)较以往的抗PcrV抗体高的抗体或其部分，以及含有该抗体或其部分的药物组合物。
背景技术：
绿脓杆菌(铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa)是自然界中广泛存在的专性需氧性革兰氏阴性杆菌。其病原性通常低，但其却是引起在患有癌症和糖尿病等各种基础疾病的患者、给予具有免疫抑制作用的药物的患者中多发的机会性感染病的病原菌，常常引起肺炎、尿路感染、败血症等，带来严重后果。绿脓杆菌感染病在临床领域中被认为是目前最难治疗的感染病之一。其原因在于绿脓杆菌不仅对现有抗生素的感受性本来就低，而且容易获得对各种抗生素的耐药性，成为难治性的倾向强。因此，对于绿脓杆菌，在不断开发新抗生素的对策方面存在局限，迫切希望不依赖于抗生素的疗法。绿脓杆菌的高细胞毒性是通过经由III型外毒素分泌系统将毒素注入真核细胞内而发挥的。PcrV是由294个残基(NCBI登录号AAC 45935，序列号1)组成的III型外毒素分泌系统的构成蛋白，己公开了编码所述蛋白的操纵子序列(专利文献1，非专利文献 1)。对PcrV的控制可能与绿脓杆菌感染病的治疗方法有关(非专利文献2)，因此报道了具有中和活性的针对PcrV的多克隆抗体(非专利文献3、4)和单克隆抗体(专利文献2、非专利文献5、6)。但是，多克隆抗体难以人源化，而且难以改善抗原性而难以用作药物组合物。 此外，迄今为止所报道的单克隆抗体的中和活性低，不能满足临床领域的要求。现有技术文献专利文献
专利文献1 美国专利6551795 专利文献2 日本特表2005-500250 非专利文献
非专利文献 1 :Yahr，T. L 等人，J. Bacteriol. 1997 年，第 179 卷，7165 页非专利文献 2 :T. Sawa 等人，Nature Medicine, 1999 年，第 5 卷，392 页非专利文献3 Jhime N等人，J. Immunol. 2001年，第167卷，5880页非专利文献4 Imamura Y等人，Eur. Respir. J. 2007年，第四卷，965页非专利文献 5 :Karine Faure 等人，J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003 年，第1卷
非专利文献 6 :Dara W. Frank 等人，J. Infect. Disease，2002 年，第 186 卷，64 页。
发明内容
发明要解决的课题
本发明所要解决的课题是提供对感染病、特别是绿脓杆菌引起的感染病的治疗有效的方法。解决课题的方法
技术领域：
本发明人对针对PcrV的单克隆抗体的制备进行了深入的研究，结果成功地制备出认为对疾病的疗效较以往己知的抗PcrV单克隆抗体更高的新型人源化单克隆抗体，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及
(1)针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有至少1种选自下列(A) - (D)中的性质
(A)在体外InM至200nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对白细胞的细胞毒性活性50%以上，
(B)在体外InM至50nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性50%以
上，
(C)与PcrV的解离常数(Kd)为2X10-9(M)以下，和
(D)在序列号1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。(2)人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有由以保藏编号FERM ABP-11805保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体的所有互补决定区(CDR)的氨基酸序列。(3)针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有
1)互补决定区中含有以下氨基酸序列的重链可变区SFTSYWMH(序列号15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列号 16)、YGNYVVYYTMDY (序列号 17)，和
2)互补决定区中含有以下氨基酸序列的轻链可变区SASTSVSYME(序列号18)、TTSKLAS (序列号 19)、HQWRNYPET (序列号 20)。(4)针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有
1)互补决定区中含有以下氨基酸序列的重链可变区SFTSYWMH(序列号15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列号16)、YGNYVVYYTMDY (序列号17)，或由在上述3个CDR中的1个以上的CDR中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而产生的氨基酸序列所组成的3个CDR， 禾口
2)互补决定区中含有以下氨基酸序列的轻链可变区SASTSVSYME(序列号18)、TTSKLAS (序列号19)、HQWRNYPET (序列号20)，或由在上述3个⑶R中的1个以上的CDR中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而产生的氨基酸序列所组成的3个CDR，
且具有至少1种选自下列(A) - (D)中的性质
(A)在体外InM至200nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对白细胞的细胞毒性活性50%以上，
(B)在体外InM至50nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性50%以上，和
(C)与PcrV的解离常数(Kd)为2X10-9(M)以下，
(D)在序列号1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。(5)针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有
1)具有序列号27的氨基酸序列的重链可变区；和
2)具有序列号观的氨基酸序列的轻链可变区。(6)含有上述(1) (5)中任一项所述的抗体或其部分作为有效成分的药物组合物。
(7)编码上述(3) (5)中记载的抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。(8)含有上述(7)记载的多核苷酸的表达载体。(9)绿脓杆菌感染病的治疗方法，包括向需要治疗的患者施用有效量的上述(1) (5)中任一项记载的抗体或其部分。(10)上述(1) (5)中任一项记载的抗体或其部分在制备绿脓杆菌感染病的治疗药中的用途，和
(11)含有上述(1) (5)中任一项记载的抗体或其部分的药物组合物，其用于治疗绿脓杆菌感染病。发明的效果
本发明的人源化单克隆抗体或其部分对PcrV的中和活性非常优异，因此用作绿脓杆菌引起的感染病的预防/治疗药。
图1显示了 ？(；1^抗体(明3、2六4、6 5、7六7和]\&113166)中生物素标记的PcrV被未标记的PcrV取代的曲线。图2显示了利用表面等离振子共振分析得到的？(1^抗体(明3、244、6 5、747和 Mab 166)的亲和性。图 3 显示了 PcrV 抗体(1F3、2A4、6F5、7A7、Mab 166)与 Mabl66 的夹心测定 (sandwich assay) 1 !^ ^图4显示了卩(；1^抗体(讣3、2六4、6 5、7六7和Mabl66)对绿脓杆菌SR24株对U937 细胞的细胞毒性活性的抑制效果。图5显示了 PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7和Mabl66)对绿脓杆菌SRM株对骨髓瘤细胞P3U1的细胞毒性活性的抑制效果。图6显示了 PcrV抗体(1F3、2A4、9D12、12H9和Mabl66)中生物素标记的PcrV被未标记的全长PcrV和缺失突变PcrV取代的曲线。图7显示了在蛋白质印迹法中，与PcrV抗体(1F3、2A4、9D12、12H9 ^P Mab 166)中的全长PcrV和缺失突变PcrV的反应性。图8通过细胞毒性抑制活性的抑制来显示抗体与全长PcrV的关联关系。图9通过细胞毒性抑制活性的抑制来显示抗体与缺失突变PcrV的关联关系。图10显示了 1F3抗体可变区的氨基酸序列。下划线部分表示⑶R区。图11显示了 2A4抗体可变区的氨基酸序列。下划线部分表示⑶R区。图12显示了小鼠抗体(小鼠1F3)、模板人源化抗体(模板)、突变型人源化抗体(回复突变)、人源化抗体(人源化1F3)的重链可变区，和轻链可变区的氨基酸序列比对。图13显示了小鼠/人嵌合抗体重链(H嵌合体)、小鼠/人嵌合抗体轻链(L嵌合体)、模板人源化抗体重链(HT)、模板人源化抗体轻链(LT)、突变型人源化抗体重链(HB)、 突变型人源化抗体轻链(LB)分别组合而成的抗体与PcrV抗原的亲和性。图14显示了小鼠/人嵌合抗体重链(H嵌合体)、小鼠/人嵌合抗体轻链(L嵌合体)、突变型人源化抗体重链突变体(I48M、A67V、L69M、V71R、A78V、V93A、L94R)、模板人源化抗体轻链(LT)分别组合而成的抗体与PcrV抗原的亲和性。
图15显示了人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列。下划线部分表示CDR区。图16显示了人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列。下划线部分表示CDR区。图17显示了小鼠/人嵌合抗体重链(H嵌合体)、小鼠/人嵌合抗体轻链(L嵌合体)、人源化抗体重链(hlF3 H)、人源化抗体轻链(hlF3 L)分别组合而成的抗体与PcrV抗原的亲和性。图18显示了人源化pcrV抗体、小鼠pcrV抗体、Mabl66对绿脓杆菌SRM株对U937 细胞的细胞毒性活性的抑制效果。图19显示了人源化抗体、小鼠抗体、Mab 166对绿脓杆菌SRM株对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性的抑制效果。
具体实施例方式作为本发明对象的“单克隆抗体”是与上述PcrV特异性结合的单克隆抗体。更具体而言，是具有至少1种选自下列的性质的针对PcrV的单克隆抗体
(1)在体外InM至200nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对白细胞的细胞毒性活性50%以上，
(2)在体外InM至50nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性50%以上，和
(3)与PcrV的解离常数(Kd)为2X10-9(M)以下，和
(4)在序列号1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。本发明的单克隆抗体可列举的一个特征是具有强的细胞毒性抑制活性。例如， 当使用白细胞时，所述抗体具有这样的抑制(中和)活性在1-200ηΜ、优选2-lOOnM、更优选 5-25nM范围内的浓度下，抑制50%以上的绿脓杆菌所具有的细胞毒性活性。此外，当使用骨髓瘤细胞时，所述抗体具有这样的抑制活性在1-50ηΜ、优选2-30nM、更优选4-20nM范围内的浓度下，抑制50%以上的绿脓杆菌所具有的细胞毒性活性。这些值远远超过Dara W. Frank 等人(J. Infect. Disease，2002 年，第 186 卷，64 页)报道的 Mabl66 的活性值。此外，本发明的单克隆抗体还具有以下特征在PcrV的全长氨基酸序列(序列号 1)的136位-233位的区域中具有其表位。本发明人发现识别该区的抗体比识别其他区的抗体具有更强的活性(细胞毒性抑制活性)。由于具有强的细胞毒性抑制活性，因此识别该区域的抗体对于感染病的治疗是有用的。可如下鉴定单克隆抗体的识别表位。首先，制备单克隆抗体所识别的分子的各种部分结构。制作部分结构时，有以下方法利用公知的寡肽合成技术制作其分子的各种部分肽的方法；利用基因重组技术将编码目标部分肽的DNA序列整合到适当的表达质粒中、在大肠杆菌等宿主内外进行生产的方法等，但为了达到上述目的，一般将上述两种方法组合使用。例如，利用本领域技术人员公知的基因重组技术，制作从抗原蛋白质的C末端或N末端起按适当的长度依次截短的一系列多肽，然后，研究单克隆抗体与这些多肽的反应性，确定大致的识别位点。之后，利用本领域技术人员公知的寡肽合成技术，进一步更细致地合成各种对应部分的寡肽或所述肽的突变体，研究本发明的预防或治疗药作为有效成分所含有的单克隆抗体与这些肽的结合性，或者研究肽对该单克隆抗体与抗原的结合的竞争抑制活性，从而限定表位。作为用于得到多种寡肽的简便方法，还可以使用市售的试剂盒(例如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies公司制造)、采用多大头针合成法的一系列多大头针/肽合成试剂盒(chiron公司制造)等)。可以按照以下程序来测定细胞毒性抑制活性。首先，将作为细胞毒性抑制活性的测定对象的单克隆抗体按2倍稀释系列进行稀释，从而将其调整至适当的浓度。随后，用细胞培养用培养基等稀释受到绿脓杆菌的毒素等影响的细胞(下文中称为靶细胞)，从而将其调整至适当的数目。具体而言，当使用骨髓瘤细胞时，希望按照3 X 106-5 X IO6细胞/ml的范围进行调整；使用白细胞时，希望按照IX 106-3X IO6细胞/ml的范围进行调整。同样地， 用培养用培养基等也将绿脓杆菌调整成1 X IO7-I X 108CfU/ml (菌落形成单位/毫升)。然后，在上述单克隆抗体的存在下，在同一试管或孔(例如微量培养板上的孔等体外条件)中， 利用适当的培养条件培养绿脓杆菌和靶细胞。此时的培养条件可以是有利于细胞、细菌生长的普通培养条件。此外，根据靶细胞的种类，将培养时间适当改变成最佳条件，例如，使用骨髓瘤细胞时，培养时间优选1-3小时左右；使用白细胞时，培养时间优选1-3小时左右。 以未添加抗体的孔作为对照组，计算相对于对照组抑制50%的浓度(有效浓度)。关于判定靶细胞的生死，确立了各种方法，在添加显色试剂后，测定适当波长(例如400-500nm)下的吸光度等是有用的(参考文献Nature Medicine, 1999年，第5卷，392-395页)。本发明的单克隆抗体可列举的一个特征是与PcrV具有高的亲和性。可以通过各种方法来分析解离常数(Kd)，其用作表示单克隆抗体与抗原的亲和性的指标。例如， 按照使用用各种标记物标记的抗原Wkatchard法，使用市售的测定试剂盒BiacoreX (AmershamPharmacia公司制造)或类似试剂盒，按照该试剂盒所附带的操作说明书和实验操作方法，可以容易地进行分析。此外，结合活性的评估也可以使用ELISA (酶联免疫吸附测定法)、EIA (酶免疫测定法)、RIA (放射免疫测定法)或荧光抗体法等。使用这些方法求得的解离常数(Kd值)以M (摩尔)单位表示。被试验的单克隆抗体解离常数越小，则表示具有越强的亲和性。本发明的单克隆抗体或其部分与PcrV的解离常数(Kd)为2X 10_9 (M) 以下，优选1.5 X 10_9 (M)以下，更优选1.2 X 10_9 (M)以下。在本发明的单克隆抗体中，作为优选的方案之一，可列举这样的抗体，所述抗体在免疫球蛋白的重链可变区(Vh)中含有互补决定区⑶R1、⑶R2和⑶R3，在此情况下，⑶Rl具有氨基酸序列SFTSYWMH (序列号15)，CDR2具有氨基酸序列INPSNGRTNYNEKFNT (序列号 16)，⑶R3具有氨基酸序列YGNYVVYYTMDY (序列号17)，免疫球蛋白的轻链可变区中含有互补决定区⑶R1、⑶R2和⑶R3，在此情况下，⑶Rl具有氨基酸序列SASTSVSYME (序列号 18)，⑶R2具有氨基酸序列TTSKLAS (序列号19)，⑶R3具有氨基酸序列HQWRNYPET (序列号 20)。对于上述⑶R区的序列，具有由在上述3个⑶R中的1个以上⑶R中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成的3个CDR的变体也包含在本发明内，只要其在保持本发明期望的生物学活性(例如，亲和性、细胞毒性抑制活性等)的范围内。作为本发明的单克隆抗体的优选方案之一，可列举具有上述特征的单克隆抗体的人源化单克隆抗体。人源化单克隆抗体是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(⑶R)移植到人抗体⑶R中得到的。因此，框架区衍生自人。可以参照Kabat Ε. A.等人的文献来选择适合使用的框架区。在此情况下的FR可选择CDR形成良好的抗原结合位点的FR。必要时，为了使重建的人源化抗体的CDR形成恰当的抗原结合位点，可以取代抗体的可变区的FR的氨基酸(Sato. K.等人，Cancer Res. 1993年，第53卷，851页)。在此情况下，可以再次进行上述步骤。人源化单克隆抗体的一般制造方法也是已知的(例如，参见WO 95/14041号公报， WO 96/02576号公报)。具体而言，首先通过PCR方法，从制备成末端部分具有重叠部分的多个寡核苷酸合成编码可变区的DNA序列，所述可变区设计为连接了小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)(参见WO 98/13388号公报)。将所获得的DNA与编码人抗体的恒定区的 DNA连接，然后整合到表达载体中。或者，可以将编码抗体可变区的DNA整合到含有抗体恒定区的DNA的表达载体中。在制备用于本发明的抗体时，将抗体基因整合到表达载体中，以便在表达控制区例如增强子/启动子控制下表达。之后，利用该表达载体转化宿主细胞，可以表达抗体。宿主细胞可列举例如COS细胞、CHO细胞等脊椎动物细胞，原核细胞，酵母等。对于抗体基因的表达，可以将抗体的重链(H链)或轻链(L链)分别整合到表达载体中同时转化宿主，或者也可以将编码H链和L链的DNA整合到单个表达载体中转化宿主 (参见 WO 94/11523)。由上述方法获得的期望的转化体可以根据本领域技术人员公知的方法进行培养， 通过所述培养，在转化体细胞内或细胞外产生PcrV的人源化单克隆抗体。对于用于所述培养中的培养基，可根据所使用的宿主细胞而恰当地选择各种常用的培养基，例如在上述COS 细胞的情况下，可使用RPMI-1640培养基、Dulbecco改良fegle极限必需培养基(DMEM)等培养基，在必要时向其中添加胎牛血清(FBS)等血清成分。培养所述转化体时的培养温度只要是不使细胞内的蛋白质合成能力显著降低的温度即可，优选合适的是在32-42°C、最合适的是在37°C下培养。此外，在必要时，可以在含有1-10% (ν/ν)的二氧化碳的空气中培养。可以利用所述蛋白质的物理性质、化学性质等，通过各种公知的分离操作方法，分离/纯化含有在上述得到的转化体的细胞内或细胞外生产的本发明的PcrV的人源化单克隆抗体的级分。具体而言，作为这种方法，可以采用例如通过通常的蛋白质沉淀剂处理，超滤、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱(HPLC)等各种层析方法，透析方法和它们的组合等。通过上述方法，可以容易地以高产率、高纯度制备期望的PcrV的人源化单克隆抗体。由此，将为了人源化小鼠单克隆抗体(1F3)而确定的全部CDR序列和部分FR序列的氨基酸残基移植到人抗体上，如此最佳化的抗体的可变区的氨基酸序列在图15 (序列号27) 和图16 (序列号28)中显示。该人源化抗体(hlF3)与通过杂交瘤产生的小鼠抗体(mlF3)相比，具有等同强度的细胞毒性抑制活性。在抗体人源化过程中，在维持原始抗体活性的同时进行人源化一般而言是困难的，但是在本发明中，成功地获得了具有与原始小鼠抗体等同活性的人源化抗体。由于人源化抗体在人体内的抗原性低，其在以治疗目的等施于人的情况下是有用的。本发明的人源化单克隆抗体使用人抗体的恒定区。作为优选的人抗体的恒定区， 重链可列举CY,例如CYl、CY2、CY3、CY4，轻链可使用CK、CX。此外，为了改善抗体或其生产的稳定性，可以对人抗体的C区域进行修饰。人源化时应用的人抗体可以是IgG、 IgM、IgA、IgE、IgD等任一种同种型的人抗体，但在本发明中优选使用IgG，更优选IgGl或 IgG4。
本发明的人源化单克隆抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的偶联抗体。此类偶联抗体可以通过对获得的抗体施加化学修饰而获得。抗体的修饰方法是本领域中已得到确立的。这些偶联抗体也包含在本发明的人源化单克隆抗体中。此外，本发明的人源化单克隆抗体的N端或C端可以与其他的蛋白质融合 (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274_1沘1)。本领域技术人员可以适当地选择融合的蛋白质。进一步地，本发明的人源化单克隆抗体可以是细胞毒性抑制活性增加的抗体。作为细胞毒活性增加的抗体，可列举例如缺失岩藻糖的抗体、糖链中添加了平分型 (bisecting) N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体、通过取代Fc区的氨基酸使与Fcy受体的结合活性改变的抗体等。这些活性增加的抗体可以使用本领域技术人员公知的方法制备。本发明中的“单克隆抗体的部分”意味着上述本发明的单克隆抗体的部分，其为具有与所述单克隆抗体相同的对PcrV的特异结合性的区域(下文中，也简单地将其称为“抗体片段”)。具体而言，可以举出对上述人PcrV具有特异结合性的Fab (抗原结合片段)、 F(ab' )2、Fab’、单链抗体(单链Fv ；下文记载为scFv)、二硫化物稳定化抗体(二硫化物稳定化Fv ；下文记载为dsFv)、2聚体化V区片段(下文记载为双抗体)、含有⑶R的肽等(Expert opinion on therapeutic patents,第 6 卷，第 5 其月，第 441-456 页，1996 年)。Fab是分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段，它是用木瓜蛋白酶分解IgG 铰链区中交联2条H链的2个二硫键(S-S键)上部的肽部分获得的，由H链的N末端侧约一半和L链全部构成。可以以木瓜蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体获得本发明中使用的Fab。或者，也可以将编码上述本发明的单克隆抗体的Fab的DNA插入细胞用表达载体中，将该载体导入细胞中使之表达而制造Fab。F(ab' )2是分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段，它是用胃蛋白酶分解 IgG的铰链区的2个S-S键的下部获得的，由2个Fab’区在铰链部分结合而构成。可以用胃蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体获得本发明中使用的F(ab’)2。或者，也可以将编码所述单克隆抗体的F (ab’)2的DNA插入细胞用表达载体中，将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造F(ab’)2。Fab'是切断上述F(ab’ )2的铰链之间的S-S键而得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。可以通过还原剂二硫苏糖醇处理上述本发明的单克隆抗体的 F (ab，)2获得本发明中使用的Fab，。或者，也可以通过将编码该单克隆抗体的Fab’的DNA 插入细胞用表达载体中，将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造Fab’。scFv是使用适当的肽接头(下文表述为P)连接一条VH和一条VL得到的VH_P_VL 或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。本发明中使用的scFv中包含的VH和 VL可以是上述本发明的单克隆抗体的VH和VL。可以通过由生产本发明单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，构建scFv表达载体，导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造本发明中使用的scFv。dsFv是将VH和VL中的各1个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代而成的多肽通过S-S键结合得到的。可以按照由Reiter等公开的方法(Protein Engineering, 7, 697(1994))，基于抗体的立体结构预测来选择取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基。本发明中使用的dsFv中包含的VH或VL可以是本发明的单克隆抗体的VH或VL。可以通过从生产本发明单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，插入适当的表达载体中而构建dsFv 表达载体，将该表达载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造本发明中使用的 dsFv。双抗体是由抗原结合特异性相同或不同的scFv形成2聚体产生的抗体片段，是对相同抗原具有二价抗原结合活性，或对不同的抗原具有2种特异性抗原结合活性的抗体片段。例如，在本发明的单克隆抗体中特异性反应的二价双抗体可以如下制造获得编码本发明单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码具有3-10个残基的肽接头的scFv的DNA，将该DNA插入细胞用表达载体中，将该表达载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使双抗体表达。含有⑶R的肽包含VH或VL的⑶R的至少1个区域以上而构成。可以直接或由适当的肽接头介导来结合多个CDR。可以如下制造包含本发明使用的CDR的肽在获得编码本发明单克隆抗体的VH和VL的cDNA后，构建编码⑶R的DNA，将该DNA插入动物细胞用表达载体中，将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使其表达。此外，也可以通过Fmoc法 (芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造包含CDR的肽。本发明的单克隆抗体或其部分可以是其修饰物，只要能够适用于本发明即可。作为修饰物，可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。对抗体的修饰可以是通过导入化学键进行的修饰，也可以是对抗体的氨基酸序列进行的修饰。本发明的单克隆抗体或其部分也包括这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得抗体施加修饰而得到。这些方法在本领域已经确立。在其他观点中，本发明提供了编码本发明的人源化单克隆抗体(hlF3)的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸具有序列号四和30的任一项记载的碱基序列。此外，在严格条件下与所述多核苷酸杂交，且编码具有与本发明抗体等同活性的抗体的多核苷酸也落入本发明的范围内。对本发明的多核苷酸没有特别的限制，只要编码本发明的抗体即可，它是由多数脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核苷酸组成的聚合物。其可以含有非天然的碱基。 本发明的多核苷酸可用于通过基因工程方法制备抗体。此外，本发明的多核苷酸也可以作为探针使用，用于筛选与本发明抗体具有等同功能的抗体。即，可以将编码本发明抗体的多核苷酸或其部分作为探针使用，通过杂交、基因扩增技术(例如PCR)等技术，获得在严格条件下与所述多核苷酸杂交，且编码具有与本发明抗体等同活性的抗体的DNA。此类DNA也包含在本发明的多核苷酸内。杂交技术(Sambrook,J等人，Molecular Cloning第 2版，9. 47-9. 58，Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)是本领域技术人员公知的技术。作为杂交条件，可列举例如低严格条件。低严格条件是在杂交后的洗涤中例如42°C、0. 1 X SSC、0. 1%SDS的条件，优选 50°C、0. 1 X SSC、0. 1%SDS的条件。作为更优选的杂交条件，可列举高严格条件。高严格条件是例如65°C、5 X SSC和0. 1%SDS的条件。在这些条件中，温度越高，越可以预期有效获得具有高同一性的多核苷酸。但是，作为影响杂交的严格性的因素，考虑温度、盐浓度等多个因素，本领域技术人员通过恰当地选择这些因素，可以实现相同的严格性。对于通过这些杂交技术、基因扩增技术获得的多核苷酸编码的、与本发明抗体功
10能等同的抗体，通常地，这些抗体的氨基酸序列具有高同一性。本发明的抗体也包含与本发明抗体的功能等同、且与所述抗体的氨基酸序列具有高同一性的抗体。高同一性指在氨基酸水平上通常至少50%以上的同一性，优选75%以上的同一性，更优选85%以上的同一性， 更优选95%以上的同一性。为了确定多肽同一性，可利用文献(Wilbur，W. J.和Lipman， D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80，726-730)中记载的算法。本发明的单克隆抗体或其部分作为药物组合物是有用的。因此，含有本发明的单克隆抗体及其部分的药物组合物可以口服或非口服(胃肠外)地全身或局部给药。作为非口服(胃肠外)给药，可以选择例如点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内给药、吸入等，但己知绿脓杆菌通过呼吸道感染特别地对肺上皮细胞、肺泡的巨噬细胞造成损伤(T. Sawa等人，Nature Medicine, 1999年，第5卷，392页)，因此期望鼻腔内给药、吸入。给予本发明的药物组合物，用于治疗由绿脓杆菌引起的囊性纤维化、感染病患者。 例如，有效给药量在每次每Ikg体重0. Olmg-IOOmg的范围内选择。或者，可以选择每名患者l-1000mg、优选5-50mg的给药量。但含有本发明的单克隆抗体或其部分的药物组合物并不限于上述给药量。此外，可以根据患者的年龄、症状适当选择给药时期。根据给药途径， 本发明的药物组合物也可以同时含有药学上可接受的载体、添加剂。作为这种载体和添加剂的例子，可以举出水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠、水溶性葡聚糖、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、酪蛋白、 二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、允许作为药物添加剂的表面活性剂等。所用添加剂根据剂型从上述物质中适当选择或组合选择，但并不限于此。下文通过参考例说明针对PcrV的小鼠单克隆抗体的制备方法。参考例1
重组Mab 166的制备
为了进行比较实验，制作Mabl66 (日本特愿2005-500250等)作为重组抗体。首先，从产生IgGh亚类的抗体的杂交瘤中提取mRNA，通过RT-PCR法克隆H链和 L链的恒定区。将通过PCR扩增的各片段插入pcDNA3. 1(+)载体(Invitrogen公司制造)的 NheI、NotI位点中，再整合多克隆位点以便可以插入可变区部分的DNA片段。之后，将Mabl66可变区部分的H链和L链的基因序列各分成4份，然后合成它们的有义DNA和反义DNA，进行退火反应。通过DNA连接酶连接退火后的片段，将H链克隆到 MfeI和BlpI区中，将L链克隆到EcoRV和BsiwI区中。使用Lipofectamine 2000 Gnvitrogen公司制造)，将己确认核苷酸序列的H链和L链的载体导入HEK239T细胞中，48小时后回收其细胞上清。使用蛋白G (PIERCE公司制造)柱从回收的细胞上清中纯化重组Mabl66。参考例2 抗原的制备
提取由东海大学提供的绿脓杆菌标准株PAOl的染色体DNA，以该DNA为模板，利用PCR 法扩增编码PcrV蛋白的基因(序列号2)。在5’侧引物中设有限制酶Sph I识别位点，在3’ 侧引物中设有限制酶Hind III识别位点(序列号3、4)，进一步地，在插入表达载体时，设计成在组氨酸标签与起始密码子之间插入半胱氨酸，以进行生物素标记。将扩增的PCR片段克隆到PQE30载体(GE Healthcare公司制造)的Sph I和Hind III位点中。确认核苷酸序列后，将该载体导入大肠杆菌JM109中，得到重组大肠杆菌(PcrV-JM109)。将PcrV-JM109 在500ml的LB/氨苄青霉素液体培养基中在37°C下培养，当0D600达到0. 5时，加入200 μ 1 0. IM的IPTG，诱导PcrV的表达。再在37°C下培养1. 5小时后，将菌体离心分离，加入15ml 含有 0. 5%溶菌酶(Sigma 公司制造)的缓冲液 A (25mM Tris-HCl (pH8. 0),0. 5M NaCl,2mM MgCl2),在0°C下放置30分钟后，进行超声处理。离心后，得到可溶级分，将其通入His-Bind 柱(Novagen公司制造)后，用含有200mM咪唑的缓冲液B (20mM磷酸缓冲液(pH7. 4),500mM NaCl)洗脱。最终的洗脱组分针对IOmM磷酸缓冲液(pH7. 4)透析，由此进行缓冲液置换。抗原的牛物素标记
如上所述，使表达/纯化的PcrV蛋白在终浓度为IOmM的巯基乙胺溶液中，在37°C下反应150分钟，还原半胱氨酸残基。向被还原的SH基中添加按摩尔比计20倍量的PEO-马来酰亚胺活化的生物素(PIERCE公司制造)，在4°C下反应过夜后，进行透析以便除去过多的生物素。抗原的免疫
将作为抗原纯化的20 μ g PcrV和弗氏完全佐剂同时对7只4周龄Balb/c雌性小鼠腹腔内给药，作为初次免疫。之后，在14天后、35天后将20 μ g PcrV和弗氏不完全佐剂同时给药，作为加强免疫。进一步地，在77天后腹腔给予20 μ g PcrV和尾静脉给予10 μ g PcrV, 作为最终免疫。杂交瘤的制备
最终免疫3天后摘出脾脏，回收脾细胞。使用50%的聚乙二醇4000使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(p3X63-Ag8.Ul，东京肿瘤研究所)融合，用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基进行选择。PcrV抗体的选定
细胞融合8天后，筛选特异性抗体产生细胞。筛选中使用的免疫测定如下。在96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入200 μ 1含有2 μ g抗小鼠IgG抗体(Shikiyagi公司制造)的iTris缓冲液(50mM Tris_HCl，pH7. 5)，在4°C下固定16小时。用300 μ 1洗涤液 (含有0. 1% Tween20的生理盐水)洗涤这些孔2次后，加入300 μ 1 BlockAce (大日本制药公司制造)，在室温放置2小时，进行封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。各孔用300 μ 1洗涤液洗涤2次后，用150 μ 1缓冲液C (含有0. 9 %氯化钠，0. 05 %叠氮化钠，0. 5 %牛血清白蛋白，0.01% Tween 80，25 μ M 二亚乙基三胺-N, N, N，，N，，，N，，-五乙酸的 50mM Tris 缓冲液、pH7. 6)稀释50 μ 1杂交瘤培养上清并添加到各孔中，在4°C下反应过夜。用300 μ 1洗涤液洗涤3次后，加入200 μ 1含有IOng Eu-标记的链霉亲和素(PERKIN ELMER公司制造) 和25ng生物素标记PcrV的缓冲液C，在室温反应1小时。反应后，用300 μ 1洗涤液洗涤 3次，添加200 μ 1增强试剂(1. 39g/l邻苯二甲酸钾、19. 3mg/l三正辛基氧化膦、4. 59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1.0g/l Triton-X100、6. Og/1乙酸)，测定它的时间分辨荧光。根据筛选结果，选择20个对重组PcrV显示出强亲和性的杂交瘤克隆，按照实施例 4确认对绿脓杆菌产生的细胞毒性的抑制活性。其结果是，在10个克隆中观察到细胞毒性抑制活性，利用有限稀释法对这些克隆进行2次克隆，由此获得了产生识别PcrV的单克隆抗体的杂交瘤克隆。从获得的10个克隆中选择4个细胞毒性抑制活性高的克隆，将其分别命名为1F3、2A4、6F5、7A7。对于这些抗体，使用小鼠单克隆抗体同种型ELISA试剂盒(BD Biociences公司制造)确定抗体亚类，结果IF3为IgG2a、2A4为IgG2b、6F5为IgG2a、7A7 为 IgG2a。产生单克隆抗体1F3和2A4的杂交瘤，于平成21年1月15日(2009年1月15日) 分别以保藏号FERM ABP-11805和FERM ABP-11806在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6号)进行国际保藏。参考例3 抗体的结合活件
为了测定抗体(1F3、2A4、6F5、7A7)的结合活性，进行竞争免疫测定。向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入ΙΟΟμΙ含有1.5yg抗小鼠Fc抗体(Jackson ImmunoReseach 公司制造)的 Tris 缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7. 5)，在 4°C 固定 16 小时。将这些孔用300 μ 1洗涤液洗涤2次，之后加入300μ 1含10%蔗糖的BlockAce (大日本制药公司制造)溶液，在室温放置2小时，进行封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。将各孔用300 μ 1 洗涤液洗涤2次，之后添加2ng/孔的各种抗体，以及自500ng/孔起以10倍稀释系列稀释5 个阶段的未标记的PcrV。之后，添加5ng/孔的生物素化PcrV，反应过夜。用300 μ 1洗涤液洗涤4次，添加100/孔的增强溶液(Wallac公司制造)后搅拌1分钟，之后测定时间分辨荧光。其结果是，与Mabl66相比，1F3、2A4、6F5、7A7显示出与PcrV的强结合活性(图1)。接下来，通过表面等离振子共振分析，算出lF3、2A4、6F5、7A7、Mabl66与PcrV的亲和性。使用小鼠抗体捕获试剂盒(Biacore公司制造)，将抗小鼠抗体固定在CM5传感器芯片上，然后捕获各PcrV抗体。在设置所述固相传感器芯片的BICORE TlOO上加载重组PcrV， 求得亲和性。其结果是，Mab 166的亲和性为3. OX 10_9，与此相对，1F3的亲和性为3. 7X 10_10， 2A4的亲和性为3. 5X10_1(I，6F5的亲和性为1. 1X10_10，7A7的亲和性为1. 1X10—9，所有克隆的亲和性均比Mabl66高(图2)。参考例4
能否与Mabl66进行夹心测定
为了证明1F3、2A4、6F5、7A7与Mabl66的表位不同，研究能否进行所述抗体与Mabl66 (下文也称为ml66)的夹心测定。最初，将Mab 166进行生物素标记。将100 μ g的Mab 166和7. 853 μ g的NHS-PE04 生物素(PIERCE公司制造)在0. IM PBS (pH7. 4)中混合，在冰中反应2小时。然后，进行凝胶层析(G2000SW柱(T0SH0公司制造))，以便从反应溶液中除去未反应的生物素。之后，进行夹心测定。向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)中加入100 μ 1含有各50(^8的卩《^抗体(讣3、2六4、6卩5、7六7)的？85(-)溶液，在4°C固定16小时。将这些孔用300 μ 1洗涤液(含有0. 01 % Tween20的生理盐水)洗涤1次，之后加入300 μ 1 BlockAce (大日本制药公司制造)，在室温放置2小时，进行封闭。将各孔用300μ 1洗涤液洗涤2次， 之后添加100 μ 1含有50 μ g PcrV和50ng生物素标记Mab 166的测定缓冲液(Wallac公司制造)，在4°C反应过夜。用洗涤液洗涤3次后，添加ΙΟΟμΙ含有50ng Eu-标记的链霉亲和素(Wallac公司制造)的测定缓冲液，在室温反应1小时。用洗涤液洗涤4次，添加100 μ 1增强溶液后，搅拌1分钟，测定其时间分辨荧光。其结果是，1F3、2A4、6F5、7A7可以与Mab 166进行夹心测定，表明该抗体组与 Mab 166的表位不同(图3)。参考例5
细胞毒件抑制活件试验
对1F3、2A4、6F5、7A7进行细胞毒性抑制活性试验。其方法如下。首先，从32μ g/ml起，将1F3、2A4、6F5、7A7以2倍稀释系列进行稀释，将其向96 孔微量培养板的各孔中分别注入10μ 1。接下来，使用细胞培养用培养基(含碳酸氢钠、不含L-谷氨酰胺和酚红的RPMI 1640 (Sigma公司制造))，将骨髓瘤细胞P3U1 (从ATCC获得)调整至5X IO6细胞/ml、或者将作为白细胞的一种的U937 (从ATCC获得)细胞调整至 IX IO6细胞/ml，在所述96孔微量培养板中添加各100μ 1。进一步使用细胞培养用培养基将在阳离子调节的Mueller Hinton Broth (Difco)中培养过夜的绿脓杆菌SRM株调整至 IXlO8 cfu/ml，将所得菌液按10μ 1/孔进行添加，在37°C、5% CO2存在下培养3小时。经过3小时后，添加各10 μ 1 WST-8 (Kishida化学公司制造)，在使用骨髓瘤细胞P3U1时在 37°C,5% CO2存在下培养3小时，在使用U937细胞时培养1小时。培养结束后，测定450nm 波长处的吸光度。其结果是，使用白细胞U937细胞时，其细胞毒性抑制活性(IC50)如下与Mabl66 的 IC50 值 213nM 以上相比，1F3 的 IC50 为 5. 3nM、2A4 的 IC50 为 20. 7nM、6F5 的 IC50 为 12. 7nM、7A7的IC50为14. 7nM ；使用骨髓瘤细胞U3P1时，与Mabl66的IC50值MnM相比， 1F3 的 IC50 为 4. 0nM、2A4 的 IC50 为 16nM、6F5 的 IC50 为 7. 3nM、7A7 的 IC50 为 6. OnM0 即， 与己知具有强活性的 Mabl66 (Frank 等人，The Journal of Infectious Diseases, 2002 年，第186卷，66页)相比，1F3、2A4、6F5、7A7对任一细胞均具有更强的细胞毒性抑制活性 (图4和图5)。参考例6
缺失突变PcrV的制备
按照以下方法制备缺失突变PcrV (136-233)。以PcrV抗原蛋白表达质粒pQE30_PcrV为模板，使用5，侧弓丨物 GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (序列号 5)、3，侧引物 GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (序列号 6 )进行PCR，使用BamHI、HindI 11对己扩增的片段进行限制酶处理，并插入pET3^(Novagen 公司制造)中。确认核苷酸序列后，将该载体导入大肠杆菌BL21-DE3株中，得到重组大肠杆菌(缺失突变PcrV-BL21)。在37°C下，使用^il LB/氨苄青霉素液体培养基预培养(前培養)该表达株一昼夜。在500ml LB/氨苄青霉素液体培养基中加入2mL预培养液，在37°C 下培养，当0D600达到0. 5时，加入培养液并在冰上静置30分钟。加入IPTG使其终浓度达到0. 75mM，使用震荡培养器在15°C下以160rpm培养一昼夜，诱导PcrV的表达。将培养液于4°C下以X5000g离心30分钟(min)，并收集细菌。除去上清，向菌体中加入IOml含有 0. 溶菌酶(Sigma 公司制造)的缓冲液 X (25mM Tris-HCl (pH7. 5)、150mM NaCl、2mM MgCl2),使其悬浮，在冰上静置1小时后，边冰冷边进行超声粉碎处理。通过离心得到可溶性级分，将其通入充填有Ni-NTA琼脂糖(Oiagen)的柱中，然后用缓冲液Y (25mM Tris-HCl (pH7. 5)、150mM NaCl、200mM咪唑)洗脱。将最终的洗脱级分针对IOmM磷酸缓冲液(pH7. 4)透析，由此进行缓冲液置换。表位区的确定
向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入150 μ 1含有1. 5 μ g抗小鼠IgG Fc 抗体(Jackson Immuno Research 公司制造)的 Tris 缓冲液(50nM Tris_HCl、pH7. 5)，在 4°C 固定16小时。将这些孔用300 μ 1洗涤液(含0. 1 % Tween20的生理盐水)洗涤2次，之后加入300μ 1封闭溶液(50mM Tris-HCl pH7. 5,2% BlockAce (大日本制药公司制造)、10% 蔗糖)，在室温下放置2小时，将各孔封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。将各孔用300μ 1洗涤液洗涤1次，之后向各孔中分别添加50 μ 1用缓冲液C (含0. 9%氯化钠、0. 05%叠氮化钠、0. 5%牛血清白蛋白、0. 01% Tween80、25 μ M 二亚乙基三胺一 N，N，N，，N，，，N，，-五乙酸的50mM Tris缓冲液、pH7. 6)稀释至80ng/ml的PcrV抗体溶液，向各孔中分别加入50 μ 1 用缓冲液C稀释至200ng/ml的Eu-标记链霉亲和素(PERKIN ELMER公司制造)溶液，再向各孔中分别加入100μ 1用DELFIA测定缓冲液稀释至各浓度的缺失突变PcrV蛋白，在4°C 下反应一夜。用300 μ 1洗涤液洗涤3次，之后添加200 μ 1增强试剂(1. 39g/l邻苯二甲酸钾、19. 3mg/l三正辛基氧化膦、4. 59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1. 0g/lTriton_X100、6. Og/1 乙酸)，测定其时间分辨荧光(图6)。其结果是，PcrV抗体1F3、2A4、9D12、12H9以及用作参考例的KaloBios公司的 ml66对PcrV全长(1-294)显示出反应性。另一方面，虽然1F3、2A4对PcrV (136-233)显示出反应性，但ml66和不具有中和活性的9D12、12H9对PcrV (136-233)没有显示出反应性。此外，还利用蛋白质印迹法进行了结合分析。将己纯化的重组PcrV蛋白进行 SDS-PAGE后，将其转印到PVDF膜上。将转印的膜用BlockAce (大日本制药制)溶液在室温下边震荡边封闭2小时。向膜上加入稀释至1 μ g/ml的PcrV抗体溶液，在4°C下反应一夜，之后用洗涤液B (10福磷酸缓冲液(？!17.4)、0.05(%1^扰1120)洗涤。向膜上加入作为二次抗体的标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare公司制造)溶液，在室温反应2小时，之后用洗涤液B洗涤膜，用ECL plus蛋白质印迹法测定系统(GE Healthcare公司制造)进行显色，用LAS-1000 (FUJIFILM)拍照(图7)。PcrV中和抗体1F3、2A4对全长PcrV和缺失突变 PcrV 二者都有反应，但ml66和中和活性低的6F5、7A7只对全长PcrV有反应而不对缺失突变PcrV反应。由此可知PcrV中和抗体1F3、2A4的表位区是氨基酸残基136-233的区域，ml66、 6F5、7A7不是仅以氨基酸残基136-233作为表位区。 PcrV蛋白白愤寺定Rij细朐,毒+杉舌+牛的强It的才目关个牛
使用全长PcrV蛋白(序列号1)和缺失突变PcrV蛋白(具有序列号1中的136位-233 位的氨基酸序列)，进行lF3、2A4、ml66的细胞毒性抑制活性的抑制试验。其方法如下。首先，将1F3、2A4、ml66分别从200nM、200nM、400nM起以2倍稀释系列进行稀释， 向96孔微量培养板中分别注入10 μ 1。本试验中1F3、2A4、ml66的试验浓度范围分别是 1. 56-6. 25nM、6. 25-25nM、50_200nM。对于各试验浓度范围，以30、10、3、1,0. 3倍摩尔浓度向96孔板中添加10 μ 1全长PcrV蛋白和缺失突变PcrV蛋白，在室温放置30分钟。然后， 使用细胞培养用培养基(含碳酸氢钠、不含L-谷氨酰胺和酚红的RPMI 1640 (Sigma公司制造))制备骨髓瘤细胞U3P1，使其达到5X IO6细胞/ml，向所述96孔微量培养板中添加各 70μ1。进一步地，用细胞培养用培养基将在Mueller Hinton Broth (Difco)中培养一夜的绿脓杆菌SRM株配制成lX108Cfu/ml，将得到的菌液添加10μ 1，在37°C、5% CO2存在下培养3小时。经过3小时后，添加各10μ 1的WST-8 (KiShida化学公司制造)，在37°C、 5% CO2存在下培养3小时。培养结束后，测定450nm波长处的吸光度。其结果是，未添加PcrV蛋白时，与ml66相比，1F3、2A4显示出强的细胞毒性抑制活性。另一方面，添加全长PcrV蛋白时，所有抗体均抑制己添加的全长PcrV蛋白的浓度依赖性细胞毒性抑制活性(图8 )。与此相比，添加缺失突变PcrV蛋白时，其氨基酸区(136-233 ) 具有表位的1F3、2A4抑制己添加的缺失突变蛋白的浓度依赖性细胞毒性抑制活性，但不具有表位的ml66在细胞毒性抑制活性方面没有观察到变化(图9)。根据以上结果认为氨基酸残基136-233中具有表位的抗体(1F3和2A4)较该区不具有表位的抗体(ml66)具有更强的细胞毒性抑制活性。即，可认为细胞毒性抑制活性的强度根据PcrV抗体所识别的区而不同，但具有强细胞毒性抑制活性的抗体是只在氨基酸残基136-233区与PcrV蛋白具有反应性的抗体。参考例8
针对人PcrV的小鼠单克降杭体(1F3和2A4)的氨某酸序歹U的分析使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司制造)，从所确立的杂交瘤细胞中提取RNA。使用快速扩增cDNA末端的5’RACE系统2. O版(Invitrogen公司制造)，从提取的1 μ g RNA中扩增DNA片段。此时，用于cDNA合成的引物如下对于1F3为TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT (序列号7)；对于2A4为TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC (序列号8)。此外，在5，RACE法中使用的引物如下对于1F3为AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (序列号9)，对于2A4为 AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (序列号 10)。用 TOPO TA 克隆试剂盒(Invitrogen 公司制造)克隆所扩增的片段，使用Applied Biosystems 3130遗传分析仪(Applied Biosystems公司制造)分析核苷酸序列。1F3的分析结果见图10，2A4的分析结果见图11。 将可变区的氨基酸序列应用于Kabat等人制成的抗体氨基酸序列数据库(“kquence of Proteins of Immunological hterest”，美国卫生与公共福利部，1983)研究同一性，结果是1F3的重链可变区中的互补决定区是SFTSYWMH(序列号15)、INPSNGRTNYNEKFNT(序列号 16)、YGNYVVYYTMDY (序列号17)，轻链可变区中的互补决定区是SASTSVSYME (序列号18)、 TTSKLAS (序列号19)、HQWRNYPET (序列号20)。同样进行研究的结果是2A4的重链可变区中的互补决定区是 SITSDYAWN (序列号 21)JITYNGDTSYNPSLKS (序列号 22)、SRNYYGAWFAY (序列号23)，轻链可变区中的互补决定区是KASQYVGTTVA (序列号M)、RASTRHT (序列号 25 )、QQYCSSPLT (序列号洸)。下文给出了实施例来具体说明本发明，但本发明并不限于下述实施例。作为抗体制备方法，如果没有特别限定，则采用Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications)中记载的方法。另外，作为基因操作方法，如果没有特别限定，则米用 Molecular cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的方法。实施例1
(1)小鼠单克隆抗体1F3的人源化关于如上制备的小鼠单克隆抗体1F3的人源化，是将小鼠抗体的CDR移植到人种系 (germline)受体序列中制备的。具体而言，用IgBLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)检索与小鼠抗体重链、轻链各自的V基因区氨基酸序列同源性最高的人种系受体序列，对于J基因区，从 IMGT (http://imgt. cines. fr/)中选择与小鼠抗体DNA序列同源性高的序列。检索的结果是获得了与小鼠抗体重链V基因区同一性最高的人种系受体序列来源的抗体基因序列，其IMGT基因名是IGHV1-46*01，获得了与J基因区同一性最高的人种系受体序列来源的抗体基因序列，其IMGT基因名是IGHJ6*01，将它们作为用于重链移植的人框架序列。同样地，获得了与小鼠抗体轻链V基因区同一性最高的人种系受体序列来源的抗体基因序列，其IMGT基因名是IGKV1-9*01，获得了与J基因区同一性最高的人种系受体序列来源的抗体基因序列，其IMGT基因名是IGKJ2*02，将它们作为用于轻链移植的人框架序列。然后，根据Kabat 编号(Wu, Τ. T.和 Kabat, E. A. , J. Exp. Med. Augl; 132⑵211-50, (1970))标明氨基酸序列的编号，限定小鼠抗体重链CDRHl、CDRH2、CDRH3 和轻链⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3，将这些⑶R区移植到人的框架序列上，将其设计为模板人源化抗体。确认所设计的模板人源化抗体与小鼠抗体的氨基酸序列的差异是在Chothia编号 (Chothia C.和 Lesk, A. M. , J. Mol. Biol. , 196 901-917 ;Chothia C.等人，Nature, 342:877-883，(1989))中的氨基酸序列号 H5、H7、Hll、H12、H20、H38、H40、H48、H66、H67、 H69、H71、H75、H78、H81、H83、H87、H93、H94、H108、L1、L3、L9、L10、L11、L15、L17、L18、L19、 L21、L40、L42、L43、L46、L70、L71、L72、L78、L79、L80、L83、L85、L100。为了鉴定小鼠抗体中的体细胞突变位点，在IgBLAST中检索小鼠抗体重链、轻链各自的V基因区氨基酸序列，获得的同一性最高的重链序列的基因名是J558. 33，而同一性最高的轻链序列的基因名是IGKV4-80*01。在IgBLAST中检索小鼠抗体重链的D基因区氨基酸序列，获得的同一性最高的重链序列的基因名是IGHD2-1*01。在IMGT中检索小鼠抗体重链、轻链各自的J基因区DNA序列，获得的同一性最高的重链序列的基因名是IGHJ4*01， 而同一性最高的轻链序列的基因名是IGKJ4*01。将这些小鼠种系序列与小鼠抗体比较，将不同的侧链作为体细胞突变位点，其中确认小鼠抗体和模板人源化抗体之间不同的侧链是 H93、H94、L9、L46。将H71、H94确认为小鼠抗体与模板人源化抗体之间不同的规范(Canonical)侧链 (http://www. bioinf. org. uk/abs/chothia. html)。在小鼠抗体与模板人源化抗体之间不同的侧链中，位于 Vernier 区(Foote等人，J. Mol. Biol. , 224.487，(1992))中的是H48、 H67、H69、H71、H78、H93、H94、L46、L71。没有确定在小鼠抗体与模板人源化抗体之间不同的链间包装残基(packing residue)。综合这些结果，设计了将小鼠抗体型突变(回复突变) 全部导入模板人源化抗体的H48、H67、H69、H71、H78、H93、H94、L9、L46、L71的氨基酸侧链中的突变型人源化抗体。设计了将作为所设计的模板人源化抗体可变区(图12 ；模板)和突变型人源化抗体可变区(图12 ；回复突变)的重链恒定区序列的人IgG4 Pro恒定区序列， 与作为轻链恒定区序列的人IgK恒定区序列连接而成的DNA序列，通过下文记载的方法， 分别构建模板人源化抗体重链表达质粒(图13 ；HT)、模板人源化抗体轻链表达质粒(图13 ； LT)、突变型人源化抗体重链表达质粒(图13 ；HB)、突变型人源化抗体轻链表达质粒(图13 ；LB)。(2)抗体基因表汰载体的制备
首先，为了避免铰链区部分的S-S键断开(Angal等人，1993，Mol. Immunol. 30(1) :105-108 和 khuurman 等人，2001，Mol. Immunol. 38:1-8)，将第 2 位的丝氨酸序列变为脯氨酸，在将IgG4的恒定区DNA分为4份后，合成它们的有义DNA和反义DNA，进行退火反应。通过DNA连接酶连接退火后的片段，在Nhel、NotI位点处插入到pcDNA3. 1 (+) 载体(Invitrogen公司制造)中，进而整合多克隆位点以便能够插入可变区的DNA片段。然后，将人源化PcrV抗体的可变区部分的基因序列按重链和轻链分别分为4份后，合成它们的有义DNA和反义DNA，进行退火反应。通过DNA连接酶连接退火后的片段，将重链克隆到MfeI和BlpI区中，并将轻链克隆到EcoRV和BsiWI区中，确定DNA碱基序列。制备小鼠/人嵌合1F3抗体作为抗体人源化时的指标。在小鼠抗体的重链可变区中设计人IgG4 Pro恒定区序列作为重链恒定区序列，通过下述方法构建表达质粒，得到小鼠/人嵌合抗体重链表达质粒(图13 ；H嵌合体)。在小鼠抗体的轻链可变区中设计连接人 Ig κ恒定区序列的DNA序列作为轻链恒定区序列，通过上述方法构建表达载体，得到小鼠/ 人嵌合抗体轻链表达质粒(图13 ；L嵌合体)。在哺乳动物培养细胞中共转染小鼠/人嵌合抗体重链表达质粒和小鼠/人嵌合抗体轻链表达质粒、模板人源化抗体重链表达质粒和模板人源化抗体轻链表达质粒、模板人源化抗体重链表达质粒和突变型人源化抗体轻链表达质粒、突变型人源化抗体重链表达质粒和模板人源化抗体轻链表达质粒、突变型人源化抗体重链表达质粒和突变型人源化抗体轻链表达质粒，使用其培养上清，通过表面等离振子共振分析(BIAcoreT-100，GE Healthcare)测定与作为抗原的重组PcrV的亲和性(图13)。小鼠/人嵌合抗体的亲和性分析的KD值是2. 6 X ΙΟ, M，此外，模板人源化抗体重链和模板人源化抗体轻链的抗体的KD值是2. 2 X ΙΟ"7 M，模板人源化抗体重链和突变型人源化抗体轻链的抗体的KD值是6. 5 X 10_7 M，确定亲和性大幅度降低。另一方面，突变型人源化抗体重链和模板人源化抗体轻链的抗体的KD值是3. 3 X 10, M，突变型人源化抗体重链和突变型人源化抗体轻链的抗体的KD值是3. 4 X 10, M，显示维持了与小鼠 /人嵌合抗体相近的亲和性。根据该结果判断，突变型人源化抗体重链对维持亲和性是重要的，轻链则使用模板人源化抗体轻链和突变型人源化抗体轻链中的任一种都没有差别。因此，关于轻链，选择与人种系来源序列相近的模板人源化抗体轻链。关于重链，制备将各种突变回复到人种系来源序列的人源化抗体，所述突变是导入了回复突变的氨基酸侧链H48、 H67、H69、H71、H78、H93、H94，通过表面等离振子共振分析来评估与抗原的亲和性(图14)。 其结果是H93的Val改变为Ala的人源化抗体的KD值是1. O X 10_9 M，H94的Leu改变为Arg的人源化抗体的KD值是3. 2 X 10_7 M，虽然亲和性降低了，但在其他突变回复到人种系来源序列的人源化抗体中没有见到大的亲和性下降。根据上述结果，确定人源化抗体序列，其中H93、H94采用小鼠抗体来源的序列， H48、H67、H69、H71、H78采用人种系氨基酸序列(图15，图16)。根据下文(3)的方法制备具有该序列的抗体，通过表面等离振子共振分析确定亲和性，结果是确定了与小鼠抗体等同的亲和性(图17)。(3)重组抗体的制备
使用Lipofectamine 2000 Gnvitrogen公司制造)，将用上述方法制备的重链基因和轻链基因导入HEK239F细胞中，72小时后回收其细胞上清。使用蛋白G(PIERCE公司制造) 柱从回收的细胞上清中纯化重组抗体。实施例2
进行mlF3 (小鼠抗体)、hlF3 (人源化抗体)和ml66的细胞毒性抑制活性实验。方法如下。首先，将mlF3、hlF3和ml66分别自200nM、200nM、800nM起，以2倍稀释系列进行稀释，向96孔微量培养板的各孔中分别注入10μ 1。然后，使用细胞培养用培养基(含碳酸氢钠、不含L-谷氨酰胺和酚红的RPMI 1640 (Sigma公司制造))将骨髓瘤细胞U3P1配制为 5X IO6细胞/ml，或将U937细胞配制为1 X IO6细胞/ml，向所述96孔微量培养板中添加各 70μ1。进一步地，用细胞培养用培养基将在阳离子调节的Mueller Hinton Broth(Difco) 中培养一夜的绿脓杆菌SRM株配制成1 X 108cfu/ml,以10 μ 1/孔添加，在37°C、5% CO2存在下培养3小时。经过3小时后，添加各10 μ 1的WST-8(Kishida化学公司制造)，在37°C、 5% CO2存在下培养1小时。培养结束后，测定450nm波长处的吸光度。其结果是，在使用 U937细胞的情况下(图18)，其细胞毒性活性(IC50)是，与ml66的98. 4 nM相对，mlF3为 1.4 nM、hlF3为1.5 nM，在使用骨髓瘤细胞的情况下(图19)，与ml66为85. 4 nM相对，1F3 为1. 5 nM、hlF3为1. 3 nM。即，mlF3和hlF3的细胞毒性抑制活性的程度相同，显示出比 ml66强的活性。产业实用性
本发明的人源化单克隆抗体或其部分不仅对PcrV有高的亲和性，而且在绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)对真核细胞的细胞毒性活性方面也显示出强的抑制活性。因此，含有该单克隆抗体或其部分的药物组合物作为目前在医疗领域中难以治疗的绿脓杆菌相关的感染病的治疗药是有用的。
权利要求
1.针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有至少1种选自下列 (1)-(4)中的性质(1)在体外InM至200nM的浓度下，抑制绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)对白细胞的细胞毒性活性50%以上，(2)在体外InM至50nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性50%以上，(3)与PcrV的解离常数(Kd)为2X10—9(M)以下，和(4)在序列号1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。
2.人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有由以保藏编号FERMABP-11805 保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体的所有互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
3.针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有1)互补决定区中含有以下氨基酸序列的重链可变区SFTSYWMH(序列号15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列号 16)、YGNYVVYYTMDY (序列号 17)，和2)互补决定区中含有以下氨基酸序列的轻链可变区SASTSVSYME(序列号18)、TTSKLAS (序列号 19)、HQWRNYPET (序列号 20)。
4.针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有1)互补决定区中含有以下氨基酸序列的重链可变区SFTSYWMH(序列号15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列号16)、YGNYVVYYTMDY (序列号17)，或由在上述3个CDR中的1个以上的CDR中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而产生的氨基酸序列所组成的3个CDR， 和2)互补决定区中含有以下氨基酸序列的轻链可变区SASTSVSYME(序列号18)、TTSKLAS (序列号19)、HQWRNYPET (序列号20)，或由在上述3个⑶R中的1个以上的⑶R中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而产生的氨基酸序列所组成的3个CDR，且具有至少1种选自下列(1)- (4)中的性质(1)在体外InM至200nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对白细胞的细胞毒性活性50%以上，(2)在体外InM至50nM的浓度下，抑制绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性活性50%以上，和(3)与PcrV的解离常数(Kd)为2X10-9(M)以下，(4)在序列号1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。
5.针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，所述抗体或其部分具有1)具有序列号27的氨基酸序列的重链可变区；和2)具有序列号观的氨基酸序列的轻链可变区。
6.以权利要求1-5的任一项所述的抗体或其部分作为有效成分包含的药物组合物。
7.编码权利要求3-5所述的抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。
8.含有权利要求7所述的多核苷酸的表达载体。
全文摘要
本发明提供了在感染病、特别是绿脓杆菌引起的感染病的治疗中作为有效手段的、针对PcrV的人源化单克隆抗体或其部分，和包含所述抗体或其部分作为有效成分的药物组合物。具体而言，本发明的人源化单克隆抗体对于绿脓杆菌对靶细胞的细胞毒性具有优异的抑制活性。此外，本发明的人源化单克隆抗体对PcrV具有高亲和性。
文档编号A61K39/395GK102341496SQ201080010648
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月9日 优先权日2009年3月11日
发明者佐藤刚章, 山野佳则, 川本敬子, 沼田义人, 辻敏永 申请人:盐野义制药株式会社